THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

Trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT GV biên soạn: Lê Trầm Nghĩa Thư Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư BÀI 1, TẾ BÀO SINH DỤC CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ ĐẠI CƯƠNG 1.1 Hệ sinh dục đực 1.1.1 Cấu tạo Tinh hồn (testis): có cấu trúc dạng cặp bọc túi (bìu) Bên tinh hồn có nhiều ngăn, ngăn tổ chức mơ biệt hóa sinh sản tinh trùng Mào tinh (epididymis): nối với tinh hoàn, đường dẫn tinh trùng Ống dẫn tinh (ductus deferens): nối với ống mào tinh Túi tinh: nơi chứa tinh trùng tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch Túi tinh nơi tập kết tạm thời tinh trùng trước Tuyến tiền liệt: sản xuất dịch (có thành phần tinh dịch) tiết vào túi tinh Niệu đạo: nằm dương vật, tinh trùng phóng ngồi qua niệu đạo Dương vật: xuất tinh xuất nước tiểu 1.1.2 Sinh lý tinh trùng Cấu tạo tinh trùng gồm phần: đầu, thân đuôi Phần đầu: chứa thể đỉnh acrosome, nơi giải phóng enzyme giúp cho tinh trùng xâm nhập trứng Phần thân: chứa ty thể, có liên quan đến hoạt động chuyển hóa chất lượng Phần đi: có vai trị vận động, khơng tham gia vào trình thụ tinh Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Cấu tạo tế bào tinh trùng Số lượng tinh trùng: chiếm trung bình 5% thể tích tinh dịch (95% dịch tiết) Ở người, trung bình có ml tinh dịch cho lần xuất tinh, số lượng tinh trùng trung bình từ 60 – 120 triệu tế bào/ml Số lượng tinh dịch bò 4-5 ml lợn 150-200 ml Tinh trùng vận động cách tự quẫy đuôi Sự sinh tinh xảy gần suốt đời sống cá thể đực, nhiên số lượng chất lượng tế bào thay đổi Điều kiện để trình thụ tinh xảy bình thường là: - Tinh trùng gặp trứng sau 12 phóng vào ống dẫn trứng - Số lượng tinh trùng phải đảm bảo ml tinh dịch - Tỷ lệ % tinh trùng dị dạng không vượt – 5% - Phần đầu tinh trùng có chứa đủ lượng enzyme hyaluronidase Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Cấu tạo tinh hồn sinh tinh 1.2 Hệ sinh dục 1.2.1 Cấu tạo - Buồng trứng: nơi chứa nang trứng - Vòi tử cung (ống dẫn trứng): nơi trứng gặp tinh trùng thụ tinh (ở 1/3 ống dẫn trứng) - Tử cung: quan để thai làm tổ phát triển - Âm đạo: quan giao hợp - Một số quan phụ (thứ cấp) khác 1.2.2 Sinh lý buồng trứng Buồng trứng cấu tạo dạng cặp, gồm phần vỏ tủy Phần vỏ chứa tế bào trứng phát triển, phần tủy có nhiều mạch máu bạch huyết, số tế bào phụ trợ khác Các trứng non nằm màng liên kết (nang nguyên thủy) Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Buồng trứng phát triển giai đoạn trứng Ở người, sơ sinh có khoảng 3.104 - 3.105 nang trứng nguyên thủy Khi trưởng thành 400 – 500 nang Hình Thời điểm kích hoạt hormone rụng trứng Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư 1.3 Đặc điểm tế bào sinh dục Một đặc điểm tế bào sinh dục trưởng thành sinh vật nói chung nhiễm sắc thể đơn bội (n) Đây kết hai lần phân chia giảm nhiễm trước thụ tinh Các tế bào sinh dục trưởng thành đầy đủ quan nội bào tế bào soma Kích thước tế bào sinh dục trưởng thành thường lớn tế bào khác Trong giai đoạn phát triển định, chúng khơng cần giá thể bám dính Điều nuôi cấy in vitro thuận lợi tế bào soma Trong q trình phát triển ln xuất cấu trúc đặc thù dành cho chức thụ tinh (thể cực, màng thụ tinh…) 1.4 Sự thụ tinh động vật hữu nhũ Tinh trùng phóng vào âm đạo theo ống dẫn trứng Lúc trứng di chuyển khoảng 1/3 chiều dài ống dẫn trứng Tinh trùng gặp trứng, thụ tinh diễn tạo hợp tử (2n) Mỗi lần phóng tinh, số tinh trùng vào vòi trứng tới hàng trăm triệu, nhiên chừng vài ngàn tế bào vào tới vị trí thụ tinh Thế gặp trứng vài trăm tinh trùng Tiến hành thụ tinh có tinh trùng Tinh trùng tiết enzyme hyaluronidase phá màng suốt trứng, nhờ phần đầu tinh trùng chui vào trứng Lúc này, tinh trùng loại bỏ phần đuôi Trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo người động vật, việc thu nhận số lượng lớn tế bào sinh dục gồm tế bào trứng tinh trùng yêu cầu thiết yếu Các tế bào sinh dục thu nhận phải đảm bảo yêu cầu chất lượng nhằm đạt kết tốt cho thụ tinh in vitro Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Trứng thu nhận từ động vật kích hoạt kích dục tố gây rụng trứng gồm có PMSG (Pregnant-Mare’s-Serum-Gonadotrophin) hCG (Human Chorionic Gonadotrophin) từ buồng trứng động vật giết mổ Trứng thu nhận từ động vật kích hoạt kích dục tố trứng thành thục (trứng chín), tức sẵn sàng cho thụ tinh gặp tinh trùng Người ta thu trứng phương pháp nội soi động vật lớn Trong trường hợp thí nghiệm chuột, khơng thể tiến hành nội soi, người ta giết chuột để thu nhận trứng chín rụng từ ống dẫn trứng Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ (heo, bị…) trứng chưa chín, cần đưa trứng vào mơi trường ni chín Trong môi trường người ta cần bổ sung yếu tố dinh dưỡng loại hormone… để kích thích chín trứng Sự chín trứng có nghĩa có thay đổi hình thái học, sinh hóa tế bào chất, nhân tế bào phận khác, cho trứng có khả thụ tinh phát triển thành phôi Thời gian thành thục chín trứng non mơi trường nhân tạo thường từ 24-44 giờ, tùy theo loài Như vậy, thụ tinh nhân tạo thực cần hai yếu tố quan trọng thu nhận tế bào trứng tốt có khả thụ tinh tinh trùng tốt, khỏe 1.5 Các kỹ thuật cần thiết Trong hai thực tập này, sinh viên thực hai kỹ thuật: thu nhận tế bào trứng từ buồng trứng heo đánh giá số tiêu sinh lý tinh dịch heo Thu nhận tế bào trứng Thu nhận tế bào trứng từ buồng trứng vật: từ vật cịn sống (qua nội soi giải phẩu) từ lò mổ (cắt buồng trứng từ động vật bị giết) 1.5.1 Kỹ thuật để lấy trứng - Thu nhận buồng trứng từ lò mổ Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư - Mổ buồng trứng - Chọc nang trứng - Hút nang trứng - Cắt buồng trứng thành lát mỏng Các trứng chưa thụ tinh thường không đồng khó phát triển thành trứng chín, tỷ lệ thụ tinh chúng thấp Để thu nhận tế bào trứng có khả thụ tinh, người ta phải nuôi trứng vào môi trường thúc trứng chín có bổ sung số hormone 1.5.2 Đánh giá phân loại trứng Theo diện độ dày, mỏng tế bào hạt cumulus bao xung quanh trứng (tế bào cumulus tế bào có nhiều hạt hình thành sau trứng rụng vào ống dẫn) Trong môi trường nuôi cấy, lớp tế bào hình thành Các tế bào cumulus có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho trứng chưa thụ tinh Khi gặp tinh trùng, lớp tế bào bị bong Trong thụ tinh in vitro, người ta phải tìm cách gỡ bỏ lớp tế bào không gây tổn thương trứng) Loại A: trứng có lớp tế bào cumulus bao kín xung quanh Loại B: trứng có lớp tế bào cumulus bao vây phần Loại C: trứng khơng có lớp tế bào cumulus bao quanh Thường dùng trứng loại A để nuôi cấy thụ tinh nhân tạo Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Trứng loại A Hình Trứng loại B Hình Trứng loại C Việc đánh giá, phân loại trạng thái trứng có tính ước lệ tương đối, nhiên thụ tinh in vitro, tiêu chuẩn quan trọng nhất, đồng thời dễ nhận biết Thu nhận đánh giá chất lượng tinh dịch Nội dung chủ yếu để đánh giá tinh dịch là: Lấy tinh: ngày, tháng, năm, lấy tinh; phương pháp lấy tinh; nhiệt độ không khí, q trình vận chuyển, bảo quản Đánh giá đại thể: lượng xuất tinh, màu sắc, mùi, độ keo dính, pH, tỷ lệ dị dạng … Thông thường, người ta có chế độ dinh dưỡng đặc biệt cho vật chọn lấy tinh trước vài ngày Đánh giá vi thể: nồng độ tinh trùng, tinh trùng dị hình, sức đề kháng tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, sức hoạt động tinh trùng Những đánh giá khác dùng nghiên cứu: tình trạng acrosome, áp suất thẩm thấu, lực đệm, độ nhớt tỷ trọng, hệ số hô hấp, sức sống bền, chuyển động… Giống di truyền, thể trạng vật (thường có phận chun mơn hóa việc đánh giá tinh trùng cho công nghệ tạo giống vật nuôi) Việc đánh giá tinh trùng cần tiến hành thật nhanh, xác cẩn thận CHUẨN BỊ 2.2 Mẫu vật Buồng trứng heo Tinh dịch heo 2.3 Hóa chất Dung dịch pha lỗng tinh trùng Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Thuốc nhuộm Eosin 1%, Nigrosine 10% Nước cất Alcol 2.4 Dụng cụ - thiết bị Kính hiển vi Kính soi Dao mổ Becher Lame lamelle Đĩa petri Ống hút Phòng đếm hồng cầu Ống trộn bạch cầu Kim 23 G Pipet thủy tinh TIẾN HÀNH 3.1 Thu nhận trứng từ buồng trứng Buồng trứng thu nhận từ lò mổ, đặt nước muối 0,9% ấm (25 – 300C), có bổ sung kháng sinh Chuyển nhanh phịng thí nghiệm Trứng sử dụng vịng từ – sau Rửa buồng trứng nhiều lần nước muối ấm đến máu, sau để buồng trứng vào nước muối giữ 380C điều kiện vô trùng đến sử dụng Sử dụng buồng trứng, giữ buồng trứng phía becher có chứa dung dịch nước muối sinh lý (khoảng 50 ml) dùng dao mổ tạo vết cắt dọc theo nang trứng thấy dung dịch buồng trứng chảy vào becher 10 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Cách kéo tiêu Hình Tinh trùng chết bắt màu thuốc nhuộm YÊU CẦU Thu nhận trứng từ buồng trứng, phân loại trứng A, B, C Xác định mật độ tinh trùng Xác định phần trăm tinh trùng sống, dị hình từ tiêu nhuộm Xác định pH tinh dịch 13 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư BÀI TẠO PHÔI ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ IN VITRO I MỤC ĐÍCH Thực phương pháp nhằm tạo phơi động vật hữu nhũ: bị, heo điều kiện in vitro II CƠ SỞ LÝ THUYẾT Ở động vật hữu nhũ, thụ tinh trình kết hợp tinh trùng (spermatozoa) đực tế bào trứng (oocyte) thể (1/3 ống dẫn trứng) để tạo nên hợp tử (zygote), hợp tử phát triển thành phôi (embryo) phôi phát triển thành cá thể Quá trình bao gồm hàng loạt biến đổi sinh lý, sinh hóa phức tạp tinh trùng trứng trước sau chúng kết hợp với Thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) trình kết hợp tinh trùng trứng để tạo thành hợp tử thực bên ngồi thể mẹ, phịng thí nghiệm Tuy xảy ngồi thể điều kiện cho q trình IVF mơi 14 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt…cùng số sinh học khác phải giống thể mẹ Các bước tạo phôi động vật hữu nhũ Chuẩn bị giao tử Thu nhận buồng trứng tiến hành phương pháp sau + Phương pháp chọc hút: dùng kim 18 G syringe ml chọc vào nang trứng hút + Phương pháp rạch múc: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng múc trứng + Phương pháp nghiền nát: buồng trứng cắt nhỏ lọc lấy tế bào trứng Sau thu nhận, phân loại chọn trứng A, B đem nuôi trưởng thành Chuẩn bị giao tử đực + Phương pháp swim-up: nguyên tắc phương pháp tinh trùng di động tốt tự bơi lên trên, thoát khỏi lớp tinh dịch phía + Phương pháp ly tâm theo thang nồng độ dung dịch Percoll: nguyên tắc phương pháp sau ly tâm dung dịch Percoll, thành phần khác tinh dịch phân tách thành lớp khác lớp tinh trùng di động tốt nằm lớp cuối đáy ống nghiệm Các phương pháp tạo phôi in vitro -Phương pháp IVF: thụ tinh ống nghiệm, theo trứng tinh trùng đặt chung với vi giọt môi trường, tinh trùng tự xâm nhập vào trứng -Phương pháp vi tiêm: tinh trùng tiêm trực tiếp vào bào tương trứng III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 1.1 Mẫu vật - Buồng trứng heo 15 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư - Mẫu tinh heo tươi 1.2 Dụng cụ - Kéo, kẹp - Kim tiêm 18G syringe - Đĩa petri nhựa 60 mm - Pipette Pasteur - Dây chuyền nước biển - Đầu tip xanh, đầu tip vàng 1.3 Hóa chất - Dung dịch muối sinh lý - Dầu khoáng Phương pháp 2.1 Phương pháp tạo vi giọt: với 100 µl/1 vi giọt (tinh trùng) đĩa 35mm Tạo vi giọt đĩa Phủ dầu khống (40µl/giọt) Bổ sung 60 µl giọt Vi giọt 100µl/vi giọt 16 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư 2.2 Phương pháp kéo pipette Pasteur Bước Bước Bước Pipette Pasteur dùng để chuyển trứng, chuyển phôi, phá cumulus Kéo pipette Pasteur lửa đèn cồn cho đầu pipette đường kính đầu kim phù hợp với mục đích sử dụng theo bước: Bước 1: Đưa pipette lên đèn cồn Bước 2: Đưa pipette đèn cồn kéo Bước 3: Bẻ đầu pipette kẹp 2.3 Phương pháp chọc hút buồng trứng Sử dụng syringe ml với đầu kim 18 G hút khoảng ml dung dịch thu trứng Sau đó, chọc kim tiêm vào nang trứng có đường kính từ đến 10 mm hút lấy dịch nang trứng Khi thu khoảng ml dịch nang trứng, chuyển dịch nang vào đĩa Tiếp tục thực thu hết dịch nang trứng buồng trứng 17 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Chọc nang Chuyển dịch nang vào trứng đĩa 2.4 Phương pháp swim-up tinh trùng Chuyển ml tinh dịch vào ống ly tâm Nhẹ nhàng bổ sung ml môi trường vào bên ống Để nghiêng 45oC nhiệt độ 37OC 30 phút, thu nhận nhẹ nhàng ml dịch bên Hình Thu nhận tinh trùng phương pháp swim up 2.5 Phương pháp chuyển tinh trùng vào trứng (phương pháp thụ tinh) Dùng pipette mouth có gắng pipette pastuer hút cụm trứng trưởng thành, nhanh chóng chuyển sang vi giọt tinh trùng chuẩn bị sẵn Các thao tác thực kính hiển vi đảo ngược 18 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Chú thích hình 1: KHV đảo ngược 2: pipette mouth 3: pipette Pastuer 4: Đĩa chứa giao tử IV YÊU CẦU Kéo pipette Pasteur với kích thước phù hợp tạo vi giọt Thu nhận nhận diện, phân loại trứng Thu nhận nhận diện tinh trùng Trình bày quy trình thụ tinh ống nghiệm Thực thao tác chuyển trứng, tinh trùng vào vi giọt Thực thao tác chuyển trứng từ vi giọt chứa trứng vào vi giọt chứa tinh trùng BÀI TÁCH TẾ BÀO TỪ MÔ ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRYPSIN CƠ SỞ LÝ THUYẾT Nuôi cấy sơ cấp (primaty culture) giai đoạn nuôi cấy với tế bào vừa tách từ mô hay quan Các tế bào thu lần nuôi sơ cấp gọi tế bào sơ cấp (primary cell) Các tế bào sơ cấp thường khơng hậu duệ nhiều tế bào ban đầu khác 19 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Để thực q trình ni cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu tách chúng thành tế bào riêng rẽ từ mảnh mô cho chúng bám vào giá thể phù hợp Việc tách tế bào thực biện pháp học hay enzyme để tạo thành dịch huyền phù tế bào Hầu hết loại tế bào động vật bình thường (trừ tế bào máu) cần bám vào giá thể để sống phát triển với hiệu cao nhất, nhiên, tế bào ung thư phát triển trạng thái lơ lửng mơi trường Có nhiều loại enzyme sử dụng để tách tế bào collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… trypsin dùng phổ biến hiệu tách tế bào cao giá rẻ Trypsin tách hồn tồn tế bào từ mơ cách thủy phân protein liên kết tế bào với Tuy nhiên trypsin làm tổn thương màng tế bào q trình tách, cần phải xác điịnh nồng độ enzyme thời gian tách tối ưu Các nhà khoa học thường mong muốn tiến hành nghiên cứu chức định mô hay tế bào hệ thống đơn giản Để thực điều này, người ta tìm cách tách tế bào khỏi mơ nội quan thể tiến hành nuôi cấy chúng điều kiện nhân tạo Đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Bằng kỹ thuật tách tế bào động vật, làm chủ dòng tế bào tạm thời hay liên tục, từ có ứng dụng quan trọng sau Tế bào sơ cấp tế bào tách lần đâu tiên chưa qua nuôi cấy Các tế bào tạo lớp đơn Người ta dùng tế bào lớp đơn để thực test vi sinh vật miễn dịch Mỗi lớp đơn tế bào sơ cấp thường nhiều chủng loại, tìm kiếm tế bào mầm lớp đơn phân lập đem cấy chuyền nhiều lần Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép thu lượng lớn tế bào đơn thời gian ngắn Nhờ đó, việc ni cấy sơ cấp có nhiều thuận 20 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư lợi tiết kiệm thời gian có tăng cường khả tiếp xúc tế bào với môi trường Tuy nhiên, điều kiện quan trọng cần ý phải làm giảm đến mức thấp tiếp xúc tế bào với trypsin hoạt động, nhằm giữ cho tỷ lệ sống tế bào cao tốt Do q trình tách tế bào trypsin 36,50C tế bào đơn cần thu 30 phút Trypsin loại cách ly tâm ức chế hoạt tính trypsin cho huyết vào mơi trường Quy trình tách tế bào cách ngâm mô trypsin 40C, 6-18 cho phép trypsin thấm vào khối mơ với hoạt tính trypsin thấp q trình phân giải tiến hành với thời gian ngắn nhiều (20-30 phút), 370C Mặc dù phương pháp sử dụng trypsin lạnh cho phép thu nhiều tế bào sống tế bào bị ảnh hưởng trypsin hơn, phương pháp sử dụng trypsin ấm sử dụng cách rộng rãi tốn thời gian phức tạp 21 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 2.1 Vật liệu Gan heo 2.2 Hóa chất Dung dịch PBS (Phosphate buffer salin) Dung dịch trypsin 1% 2.3 Dụng cụ thiết bị Erlen 50 ml Pipetman 100 – 1000 µl Pipetman 10 – 100 µl 22 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Đầu tip 100 – 1000 µl Kéo nhỏ Đĩa petri Becher 250 ml Pipette ml, ml, ml Bóp cao su Buồng đếm tế bào Máy vortex Máy sấy Máy lắc Lamelle TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Cân mẫu mô gan, mẫu g Rửa mẫu đĩa petri vô trùng dung dịch PBS lần, hút bỏ dịch rửa Cho mẫu gan vào erlen, cắt nhuyễn mô gan kéo Cho vào erlen đánh số 1,2, Erlen 1: 18 ml PBS + ml trypsin 1% Erlen 2: 15 ml PBS + ml trypsin 1% Erlen 3: 12 ml PBS + ml trypsin 1% Như vây, ta dung dịch trypsin có nồng độ 0,1, 0,25, 0,4% tương ứng với erlen 1, 2, Lắc erlen mẫu máy lắc Sau 15, 30, 45 phút, lấy mẫu erlen xác định mật độ tế bào gan dung dịch buồng đếm 23 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Hình Tế bào động vật phòng đếm NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Thời gian phải xác suốt q trình lắc đếm mật độ tế bào - Rửa máu để tránh đếm nhầm tế bào máu buồng đếm YÊU CẦU -Nhận diện tế bào gan - Tính mật độ tế bào gan buồng đếm hồng cầu - Xác định nồng độ trypsin thời gian tối ưu để tách tế bào gan từ mơ theo quy trình trypsin ấm lạnh 24 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư BÀI THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN TỪ TỦY XƯƠNG CHUỘT NHẮT TRẮNG I MỤC ĐÍCH Tiếp cận với kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Xây dựng quy trình thu nhận tế bào đơn từ tủy xương II CƠ SỞ LÍ THUYẾT Trong tủy xương có chứa nhiều loại tế bào quan trọng cho thể loại tế bào máu, tế bào tạo máu, tế bào gốc trung mô Thu nhận tế bào đơn từ tủy xương nhằm mục đích chuẩn bị nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào mong muốn sau III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 1.1 Mẫu vật Chuột nhắt trắng: chuột trưởng thành hay chưa trưởng thành, khỏe mạnh 1.2 Dụng cụ - Kéo - Kẹp - Kim tiêm CC - Khay inox - Bơng gịn - Găng tay - Becher 50 ml - Ống li tâm 15 ml 25 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư 1.3 Hóa chất - Cồn 700 - Dung dịch PBS Phương pháp Giết chuột - Đặt chuột lên giá, giết chuột cách kéo giãn đốt sống cổ Thu nhận xương đùi xương cẳng chân - Đặt chuột nằm ngửa lên khay (lưng tiếp xúc với khay) - Sát trùng vùng da bụng chuột cồn 700C - Cắt ngang bụng chuột đường ngắn chừng 1-2 cm, tiến hành kéo hai vùng da hai bên vết cắt phía đầu chuột, tiếp tục kéo mạnh để tuột hết lớp da bao phủ hai chân chuột đến gót chân - Tiến hành cắt hai chân chuột khớp háng gót chân Đến bước thu hai chân hoàn tồn da, lơng với chân có xương đùi xương cẳng chân - Tiến hành rửa hai chân dung dịch PBS 2-3 lần trước tách phần khỏi phần xương - Dùng kẹp kéo để loại bỏ phần bao quanh xương đùi chuột (rửa mẫu 3-4 lần bước này) - Cắt rời đoạn xương đùi khỏi xương cẳng chân Thu nhận tủy xương chuột - Dùng kim tiêm ml hút môi trường nuôi tế bào D’MEM 10% FBS bơm dịch môi trường xuyên vào tủy xương để dội rửa thu tế bào tủy xương - Dội rửa đoạn xương lần Như vậy, tổng tích thu chứa tế bào tủy xương sau dội rửa ml 26 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư Thu nhận tế bào - Chuyển toàn huyền phù tế bào vào ống li tâm - Li tâm tốc độ 2.500 vòng 10 phút - Thu nhận cặn tế bào bỏ dịch - Huyền phù tế bào lại ml PBS, xác định mật độ tế bào - Chỉnh mật độ tế bào 5.105 - 106 tế bào/ml dung dịch PBS - Cho huyền phù tế bào mơi trường ni cấy vào đĩa/bình ni tế bào - Chuyển đĩa/bình ni tế bào vào tủ ni cấy 370C, 5% CO2 - Quan sát ghi nhận thay đổi quần thể tế bào tủy xương chuột nhắt trắng nuôi cấy in vitro theo thời gian IV YÊU CẦU THỰC TẬP Thực thao tác bắt chuột giết chuột cách kéo giãn đốt sống cổ Thực thao tác thu nhận xương đùi chuột Thực thao tác thu nhận tủy xương chuột Thực thao tác thu nhận quần thể tế bào tủy xương chuột Thực thao tác đếm điều chỉnh mật độ tế bào mật độ tế bào thích hợp Quan sát ghi nhận phát triển quần thể tế bào tủy xương chuột nhắt trắng nuôi cấy in vitro theo thời gian 27 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư