Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn bacillus subtilis m1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊCH ĐẬU ĐEN LÊN MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊCH ĐẬU ĐEN LÊN MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt q trình học tập thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Dương Thị Ngọc Quỳnh MỤC LỤC Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh đái tháo đường (tiểu đường) người 1.1.1 Giới thiệu bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 1.1.3 Biến chứng bệnh đái tháo đường 1.1.4 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 1.1.5 Tình hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam 1.2 Enzyme chuyển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) 1.2.1 Giới thiệu α - glucosidase 1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase 1.2.3 Tính chất α-glucosidases 10 1.3 Chất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 10 1.3.1 Giới thiệu chất kìm hãm alpha – glucosidase 10 1.3.2 Phân loại hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase 11 1.3.2.1 Nhóm Disaccharides 11 1.3.2.2 Nhóm Iminosugars 12 1.3.2.3 Carbasugars pseudoaminosugars 14 1.3.2.4 Thiosugars 15 1.3.3 Cơ chế kìm hãm α – glucosidase AGIs tác dụng điều trị đái tháo đường type 15 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AGIs .18 1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AGIs giới 18 1.3.4.2 Tại Việt Nam 19 1.4 Nguồn thu nhận công nghệ sản xuất AGIs 20 1.4.1 Sản xuất AGIs theo phương pháp tổng hợp hóa học .20 1.4.2 Sản xuất AGIs theo đường tự nhiên .20 1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ động vật 20 1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ thực vật 21 1.4.2.3 Sản xuất AGIs từ vi sinh vật 24 1.5 Sản xuất AGIs từ đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis 25 1.5.1 Nguồn chất đậu đen 25 1.5.2 Nguồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis 26 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu 29 2.2 Môi trường 29 2.3 Hóa chất 30 2.4 Thiết bị 30 2.5 Phương pháp 31 2.5.1 Xác định số tính chất nguyên liệu đậu đen 31 2.5.2 Lên men khảo sát điều kiện lên men thích hợp thu hoạt chất kìm hãm α glucosidase 33 2.5.3 Xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase dịch chiết sau lên men .33 2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 35 2.5.5 Phương pháp xây dựng phương trình động học trình lên men thu hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 36 2.5.6 Thu hồi hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men chủng Bacillus subtilis M1 37 2.5.7 Khảo sát khả loại màu dịch lên men than hoạt tính 38 2.5.8 Xác định giá trị IC50 38 2.5.9 Tính toán thống kê 38 2.5.10 Hiệu suất thu hồi 38 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát đặc tính cơng nghệ ngun liệu đậu đen 40 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase Bacillus subtilis M1 40 3.2.1 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp .40 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 42 3.2.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –glucosidase .44 3.2.5 Nghiên cứu thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 45 3.3 Động học trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase mối tương quan với mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trình lên men 46 3.4 Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1 50 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng q trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase dịch lên men 50 3.4.2 Khảo sát q trình đặc dịch lên men chứa hoạt chất kìm hãm α - glucosidase .52 3.4.3 Khảo sát phương pháp sấy tạo sản phẩm dạng bột chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 55 3.5 Nghiên cứu khả kìm hãm α – amylase chế phẩm chứa AGI 57 3.6 Khảo sát khả tẩy màu than hoạt tính với sản phẩm lên men 58 3.7 Đề xuất qui trình lên men tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1 .61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ 4-NPG 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside AGIs (Alpha Glucosidase Inhibitors) Chất kìm hãm alpha - Glucosidase CFU (Colony forming unit) Đơn vị khuẩn lạc DNJ 1-deoxynojirimycin DNS Dinitrosalicylic acid ĐTĐTN Đái tháo đường thai nghén GLP Glucagon peptide HTKH Hoạt tính kìm hãm IC50 (half maximal inhibitory concentration) Nồng độ chất kìm hãm kìm hãm 50% hoạt tính α-glucosidase IGT Rối loạn dung nạp glucose WHO (World Health Organization) Tổ chức y tế giới XOS Xylooligosaccharides DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ phần trăm bệnh nhân đái tháo đường độ tuổi 20 – 79 phân chia theo khu vực giới Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất disaccharide…………………………………………………………… …12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase thuộc lớp Piperidines 13 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Iminosugars 14 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Carbasugars 15 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có chất Thiosugars .15 Hình 1.7 Ảnh hưởng chất kìm hãm α-glucosidase đến trình trao đổi đường thể 16 Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α-glucosidase acarbose 17 Hình 1.9 Cấu trúc hóa học salacinol kotalanol tách chiết từ Salacia 21 Hình 1.10 Khuẩn lạc B subtilis mơi trường TSA (A) hình thái tế bào, bào tử kính hiển vi điện tử độ phóng đại 1000 lần (B) 27 Hình 2.1 Phương trình tạo màu đường khử DNS acid 34 Hình 3.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp hoạt tính kìm hãm α – glucosidase 41 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: Nguồn nguyên liệu đậu đen lòng xanh trồng Việt Nam sử dụng đề tài có hàm ẩm 12,94%, hàm lượng Gluxit 53%, khoáng 3,2%, dung trọng 781g Đã khảo sát lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis M1 sinh hoạt chất kìm hãm α – glucosidase: môi trường chứa 5% đậu đen xay có hàm ẩm 80%, nhiệt độ lên men 37oC, pH ban đầu 7, ni lắc 150 vịng/phút, thời gian ngày HTKH α – glucosidase dịch lên men đạt 99% Đã khảo sát số điều kiện tách chiết hoàn thiện chế phẩm hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1, chế phẩm có HTKH α – glucosidase từ 90 - 97% với giá trị IC50 từ 0,0167 – 0.175mg/ml HTKH α – amylase từ 33 – 39% phụ thuộc phương pháp thu hồi Khơng nên sử dụng than hoạt tính để tẩy màu dịch lên men KIẾN NGHỊ Chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men chủng Bacillus subtilis M1 (IC50 0,0167mg/ml) có tiềm lớn ứng dụng sản xuất thực phẩm chức điều trị cho bệnh nhân ĐTĐ type Tuy nhiên điều kiện thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài dừng lại quy mơ sản xuất thí nghiệm Trong thời gian tới cần tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện cơng việc sau: - Hồn thiện cơng nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men chủng Bacillus subtilis M1 quy mô lớn - Đánh giá chất lượng sản phẩm dựa tiêu an toàn vệ sinh thực 64 phẩm, thử nghiệm độc tính thử nghiệm lâm sàng động vật người - Tinh xác định xác tên, cơng thức cấu tạo hoạt chất kìm hãm α – glucosidase thu từ chế phẩm đậu đen lên men Bacillus subtilis M1 Từ đưa hướng ứng dụng sản xuất hoạt chất kìm hãm α – glucosidase dạng thuốc điều trị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Hồng Ánh (2007), Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột dâu tằm giàu – deoxynojirimicin (DNJ) ứng dụng số sản phẩm đồ uống chức cho người bệnh tiểu đường, Báo cáo khoa học Viện điện Nông nghiệp Cơng nghệ sau thu hoạch Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý tảng đái tháo đường – tăng glucose máu, Nxb Y học, Hà Nội Bộ môn Nội - Trường Đại học Y Hà Nội (2005), "Bệnh đái đường", Bệnh học Nội khoa sau đại học, tr 214-229 Bộ môn Nội, Trường Đại học Y Hà Nội (2005), "Đái tháo đường thai nghén", Bệnh học Nội khoa sau đại học, tr 347-359 Đào Thị Dừa, Nguyễn Hải Thuỷ (2008), "Nghiên cứu chất lượng sống bệnh nhân đái tháo đường", Tạp chí Y học thực hành, 616 + 617, tr 349-357 Nguyễn Văn Đạt, Ngơ Văn Tám (1974), Phân tích lương thực thực phẩm Nguyễn Phú Khang (2008), Bệnh học nội khoa tập II, Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội Đỗ Thị Nguyệt Quế, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Nguyễn Duy Thuần, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Thị Kim Quế (2009), “Bước đầu đánh giá tác dụng hạ glucose huyết rễ chóc máu (Salacia cochinchinesis ) chuột nhắt bị tăng glucose huyết streptozocin”, Tạp chí Dược học, 399, tr 28-32 Nguyễn Hải Thuỷ, Đào Thị Dừa (2003), "Đặc điểm bệnh lý bàn chân đái tháo đường nội trú Bệnh viện Trung ương Huế", Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ II, tr 102-105 10 Tierney, Mc Phee, Papadakis (2002), “Đái tháo đường”, Chẩn đoán điều trị y học đại, Nxb Y học, Hà Nội, tr 733-800 66 11 Nguyễn Thị Hoài Trâm (2007) “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức bổ sung từ vi sinh vật” Báo cáo tổng kết đề tài Viện Công nghiệp Thực phẩm 12 Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Dỗn Diên (2000), Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa học & Kỹ Thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng anh 13 Chiasson J.L., Josse R.G., Gomis R., Hanefeld M., Karasik A., Laakso M., STOP-NIDDM Trial Research Group (2002), “Acarbose for prevention of type diabetes mellitus: the STOP-NIDDM randomised trial”, Lancet, 359, 2072–2077 14 Eduardo Borges de Melo, Adriane da Silveira Gomes and Ivone Carvalho (2006), “α- and β-Glucosidase inhibitors: chemical structure and biological activity”, Tetrahedron, 62, 10277–10302 15 F.Ye, Z Shen and M Xie (2002), “Alpha-glucosidase inhibition from a Chinese medical herb (Ramulus mori) in mormal and diabetic rats and mice” Phytomed Phytomedicine, 9, pp 161 – 166 16 Falk Anne, Kaspar Kala (2006), “Methods of use and nutritional compositions of touchi extract”, Patent No WO 2007/140230 A2 17 Hilmar Bischoff (1995), “The mechanism of α-Glucosidase inhibition in the management of diabetes”, Clinical and Investigative Medicine, 18, 303-311 18 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami (2001), “Fermented soybean – derived Touchi-extract with anti-diabetic effect via α-glucosidase inhibitory action in a long-term administration study with Kkay mice”, Life sciences, 70, pp 219 – 227 19 Hiroyuki Nakai, Masayuki Okuyama, Young-Min Kim, Wataru Saburi, Jintanart Wongchawalit, Haruhide Mori, Seiya Chiba & Atsuo Kimura (2005), “Molecular analysis of α-glucosidase belonging to GH-family 31”, Biologia, Bratislava, 60/Suppl 16, 131—135 67 20 Kameda Y., Asano N., Yoshikawa M., et al (1984), “Valiolamine, a new α – glucosidase inhibiting aminocyclitol produced by Streptomyces hygroscopicus”, J Antibiot, 37, pp 1301-1307 21 Kenji Yoshikawa, Kazuya Yamamoto and Shigetaka Okada (1994), “Classification of some α – Glucosidases and α – Xylosidases on the basic of substrate specificiy”, Biosei Biotech Biochem., 58 (8), 1392 – 1398 22 Kevan C Herold M.D (2004), “Treatment of type diabetes mellitus to preserve insulin secretion”, Endocrinol Metab Clin N Am, 33, pp 93 – 111 23 Kitabchi A.E., Guillermo E.U., Murphy M.B., et al., 2001, “Management of hyperglycemic crises in patients with diabetes” Diabetes Care, 24, pp: 131-153 24 Klich M A (2002), “Biogeography of aspergillus species in soil and litter”, Mycologia, 94, pp 21-27 25 Kwon O S., Park S H., Yun B S., et al (2000), “Cyclo (Dehydroala-L-Leu) an α-glucosidase inhibitor from Penicillium sp F70614, The journal of antibiotics, 53 (9), pp 954-958 26 Kwon Y I., Vattem DA, Shetty K (2006) Clonal herbs of Lamiaceae species against diabetes and hypertension Asia Pac J Clin Nutr 15: 424-432 27 Kwon, Y I., Son, H J., Moon, K S., et al (2002), “Novel alpha-glucosidase inhibitors, CKD-711 and CKD-711a produced by Streptomyces sp CK-4416” The Journal of antibiotics, 55, pp 462-466 28 Kyung D K., Yong S.C., Ji H S., et al (2011), “ Identification of the Genes Involved in – deoxynorijimycin synsthesis in Bacillus subtilis Mori 3k-85”, The Journal of Microbiology, Vol 49., No 3, pp 431-440 29 Li, Y., Wen, S., Kota, B., Peng, G., Li, G Q., Yamahara, J and Roufogalis, B (2005), “Punica Granatum flower extract, a potent α – glucosidase inhibitor improves postprandialhyperglycemia in Ethnorphamacol, 99, pp 39-44 68 Zucker diabetic fatty rats”, J 30.Naoki Asano (2003), “Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use”, Glycobiology, Vol 13(10), pp 93-104 31 Nguyen, H T., Kim, S M (2009), “Three compounds with potent α – glucosidase inhibitory activity purified from sea cucumber Stichopus Japonicas”, Spise2009, pp 112-122, Ho Chi Minh City University of Technology 32 Niloufar Choubdar (2008), Synthesis of – substituted derivatives of the naturally occurring glycosidase nihibitor, salacinol and its nitrogen analogues, Thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy, Simon fraser university 33 Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata (2007), “αglucosidaza inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris)”, Food Chemistry, 103, 1319–1323 34 Nippon Supplement Inc - Research and Development Department (1999) , Safety Test of Touchi Extract after Bolus Administration in Healthy Subjects Research and Development Department, Osaka, Japan 35 Qui, L and X Ding, (2007), “Evolution of proteolytic tasty components during preparation of Douchiba, a traditional Chinese soy-fermented appetizer” Food Technol Biotechnol., 45, pp 85-90 36 R J Nash, A Kato, C.-Y Yu, G W J Fleet, (2011 ), “Iminosugars as therapeutic agents: Recent advances and promising trends”, Future Med Chem., 3, 1513-1521 37 Schimidt, D D., Former, W., Muller, L., Junge, B., Wingender, W., and Truscheit, E (1977), “Alpha-glucosidase inhibitor, new complex oligosaccharides of microbial origin”, Naturwissenshaften, 64, pp 535 – 536 38 Shashank R Joshi, Rakesh M Parikh A K Das (2007), “Insulin History, Biochemistry, Physiology and Pharmacology”, Journal of the Association of Physicians of India, Vol 55, 19 – 25 69 39 Stein D C., Kopec L K., Yasbin R E (1984), “Characterization of Bacillus subtilis DSM 704 and its production of 1-deoxynojirimycin”, Applied and Enviromental Microbiology, 48 (2), pp 280-284 40 UK Prospective Diabetes Study Group (1998), “Effect of intensive blood glucose control with metformin on complications in overweight patients with type diabetes (UKPDS 34)”, Lancet; 352, 854–865 41 UK Prospective Diabetes Study Group (1998), “Intensive blood glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type diabetes (UKPDS 33)”, Lancet, 352, 837–853 42 Vargas-Torres, A.; Osorio-Díaz, P.; Tovar, J.; Paredes-López, O.; Ruales, J.; Bello-Pérez, L.A (2004), “Chemical composition, starch bioavailability and indigestible fraction of common beans (Phaseolus vulgaris L.)” Starch Stärke, 56, pp 74–78 43 Volker G., Thuy Anh T.T., Ralph T et al (1986), “ Diferent effects of the glucosidase inhibitors 1-deoxynojirimycin, N-methyl-1-1-deoxynojirimycin and castanospermine on the glycosylation of rat α1-proteinase inhibitor and α1-acid glycoprotein”, Biochem J., 236, 853-860 44 Ward O.P., Shallmey M., Singh A (2003), “Developments in the use of Bacillus species for industrial production” Published on the NRC Research press webside at http://cjm.nrc.ca on 14 January 2004 45 Yamaki, K., Mori, Y (2006), “Evaluation of alpha-glucosidase inhibitory activity in coloured food: A trial using slope factors of regression curves”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53, 229-231 46 Yaqiong Liu, Lijun Wang, Yongqiang Cheng, Masayoshi Saito, Kohji Yamaki , Zhihong Qiao and Lite Ly (2009), “Isoflavone content and Anti- acetylcholinesterase activity in Commercial Douchi (a Traditional Chinese Salt- 70 fermented Soybean Food)”, Japan Agricultural Research Quarterly, 43(4), pp 301307 47 Yoshikawa M., Murakami T., Shimada H., Matsuda H., Yamahara J., Tanabe G., Muraoka O., (1997), “Salacinol, potent antidiabetic principle with unique thiosugar sulfonium sulfate structure from the ayurvedic traditional medicine Salacia reticulata in Sri Lanka and India”, Tetrahedron Letters, Vol 38, N 48, pp 8367-8370 48 Zhu Y P., Yamaki K Cheng Y Q., Yoshihashi T., Kameyama M O., Li X T., Mori Y and Li L T (2010), “Purification and Identification of 1-Deoxynojirimycin (DNJ) in Okara Fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese Traditional Food (Meitaoza)”, J Agric Food Chem., 58, pp 4097–4103 49 Zhu Y P, Fan J.F., Cheng Y Q and Li L T (2008), “ Improvement of the antioxidant activity of Chinese traditional fermented okara (Meitauza) using Bacillus subtilis B2”, Food Control, 19, pp 654-661 50 Zhu Y P., Yin L P., Cheng Y Q., Yamaki K (2008), “Effects of sources of carbon and nitrogen on production of α - glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2”, Food Chemistry, 109, pp 737-742 Tài liệu internet 51 http://en.wikipedia.org/wiki/Acarbose 52 http://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-14825/magnesi-stearat.aspx 53 http://www.timbacsy.com/magnesi-stearat/ 54 http://www.doricovn.com/khoang-san-phi-kim/bot talc.html?page=shop.browse&category_id=12 55 http://www.scribd.com/doc/28061937/Diabetes-Statistics-2011 56 http://www.rcsb.org-/pdb/home/home.do 57 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283607014271 71 58 http://en.wikipedia.org/wiki/Phaseolus_vulgaris 59.http://www.whfoods.com/genpage.php?pfriendly=1&tname=foodspice&dbid=2# descr 60 http://en.wikipedia.org/wiki/Voglibose 61 http://www.dbpia.co.kr/Journal/ArticleDetail/920836 72 PHỤ LỤC Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp DNS Thí nghiệm tiến hành với nồng độ đường khác thể tích phản ứng với DNS, so màu bước sóng 575nm Kết thể qua bảng PL1 Bảng PL1 Kết xây dựng đường chuẩn glucose STT Nồng độ đường (mg/ml) Giá trị OD 575nm 0,25 0.931 0,2 0.737 0,15 0.529 0,1 0.32 0,05 0.09 y = 4.198x - 0.1083 R² = 0.9991 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Hình PL1 Phương trình đường chuẩn glucose Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp tạo hoạt chất kìm hãm α – glucosidase Bacillus subtilis M1 Bảng PL2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng thời gian lên men đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase Hoạt tính kìm hãm (%) Mơi trường ngày MT1 ngày 0,3 ± 0,0 34,45±0,5 71,25±1,2 56,38±0,2 43,62±1,5 41,22±1,3 MT2 ± 0,0 35,79±2,5 55,73±1,5 MT3 ± 0,0 MT4 ± 0,0 14,31±2,1 39,76±0,5 69,42±0,4 79,56±0,5 78,61±0,5 MT5 ± 0,0 29,89±1,1 58,95±1,0 71,54±0,8 78,08±0,8 76,55±0,8 ĐC ± 0,0 5,70±1 ± 0,0 77,93±1 28,52±1,2 65,32±1,5 0,84±0,1 ± 0,0 84,42±1,8 82,46±2 78,19±2 72,43±1,6 0,4±0,2 0,14±0,1 Bảng PL3 Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase pH Hoạt tính kìm hãm (%) 74,40±1,5 5,5 75,67±1,6 79,35±1,2 6,5 84,44±0,8 88,40±1 7,5 88,54±1,4 80,20±0,5 8,5 76,52±0,8 Bảng PL4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase Tốc độ lắc (vịng/phút) 50 100 150 Hoạt tính kìm hãm (%) 39,52±1,2 51,65±2,0 89,52±1,1 Bảng PL5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase dịch lên men Thời gian lên men (ngày) Hoạt tính kìm hãm (%) 0 ± 0,0 10,26 ± 1,6 36,02 ± 4,3 85,73 ± 2,1 94,5 ± 0,5 96,5 ± 0,8 99,42 ± 0,0 99,39 ± 1,7 Xây dựng phương trình động học trình tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase mối tương quan với mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trình lên men Bảng PL6 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase dịch lên men theo thời gian lên men Môi trường lên men Thời gian lên men (ngày) LB MT3 MT4 0 ± 0,0 ± 0,0 ± 0,0 50,6 ±1,5 10,26 ±1,6 14,31 ± 2,1 76,08 ± 2,3 36,02 ± 4,3 39,76 ± 0,5 72,47 ± 1,6 85,73 ± 0,1 98,99 ± 0,4 71,75 ± 0,0 94,5 ± 0,5 99,42 ± 0,2 71,75 ± 0,0 98,5± 0,8 99,42 ± 0,1 71,74 ± 0,0 99,42 ± 0,0 99,56 ± 0,1 71,62 ± 1,2 99,39 ± 0,7 99,61 ± 0,5 Bảng PL7 Mật độ vi khuẩn dịch lên men theo thời gian lên men Môi trường lên men Thời gian lên men (ngày) LB MT3 MT4 1.106 ± 1,2 1.106 ± 1,2 1.106 ± 1,2 1 108 ± 1,1 4.9.107 ± 1,5 1.6.108 ± 2,9 1.2 108 ± 2,1 1.4.108 ± 2,1 4.9.109 ± 1,3 6.7.107 ± 2,3 1.76.109 ± 1,1 1.1.1010 ± 2,1 107 ± 1,8 8.6 109 ± 2,2 1.5 1010 ± 2,3 1.8 107 ± 2,5 1.05 1010 ± 2,4 1.45 1010 ± 1,7 1.3 107± 2,4 1.5 1010 ± 1,5 1010 ± 2,5 1.2 107 ± 1,8 109 ± 1,6 1.8 1010 ± 1,8 Bảng PL8 Giá trị pH dịch lên men theo thời gian lên men Môi trường lên men Thời gian lên men (ngày) LB MT3 MT4 7 7,56 5,37 5,93 8,31 6,01 5,71 8,50 6,33 6,05 8,77 6,45 6,2 8,87 6,67 6,43 8,88 7,44 6,6 8,88 8,05 7,01 Xác định giá trị IC50 mẫu chế phẩm hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men chủng Bacillus subtilis M1 Bảng PL9 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase mẫu chế phẩm nồng độ khác Nồng độ mẫu (mg/ml) Phần trăm kìm hãm (%) Đơng khô – MT3 (kết tủa cồn) Đông khô – MT3 (không kết tủa cồn) Sấy phun – MT3 (không kết tủa cồn) Đông khô – MT4 (không kết tủa cồn) 99,85 99,82 97,27 97,06 98,74 98,29 95,01 93,64 96,21 98,35 82,08 93,23 0,5 93,83 92,82 70,09 80,68 0,25 84,58 82,04 60,59 61,66 0,1 79,52 72,38 35,43 51,65 0,01 44,76 60,84 17,12 38,40 0,001 6,01 9,72 4,33 3,00 ... dung luận văn với đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1? ?? cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực... tế trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men vi khuẩn Bacillus subtilis M1? ?? Đề tài thực với mục đích... 2.5.2 Lên men khảo sát điều kiện lên men thích hợp thu hoạt chất kìm hãm α - glucosidase Để thu hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, đề tài sử dụng phương pháp lên men