Nghiên cứu thu nhận và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ lipase từ mủ quả vả và mủ quả sung

Lipase thu nhận từ thực vật có nhiều ưu điểm và được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm công nghiệp tẩy rửa công nghiệp thuộc da hóa mỹ phẩm … Trong nghiên cứu này lipase thô được thu nhận từ phần dịch lỏng của mủ quả vả và quả sung Chế phẩm enzym thô được khảo sát ảnh hưởng bởi một số yếu tố như nhiệt độ pH ion kim loại Một vài đặc tính hóa sinh của enzym lipase này đã được xác định thông qua sự xúc tác sinh học với cơ chất là p nitrophenyl pamitate p NPP Kết quả cho thấy lipase thu được có hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ 450C và pH tối thích là 9 đối với lipase từ mủ vả và pH 8 5 đối với lipase từ mủ sung Sự có mặt của ion kim loại Ca2 K Mg2 EDTA làm thay đổi hoạt độ của lipase từ mủ vả nhưng không đáng kể Trong khi đó sự có mặt của các ion kim loại trên đều làm giảm hoạt độ lipase từ mủ sung

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA * NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HOẠT ĐỘ LIPASE TỪ MỦ QUẢ VẢ VÀ MỦ QUẢ SUNG SVTH: ĐẶNG THỊ KHÁNH Đà Nẵng – Năm 2017 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Sinh viên thực hiện: Đặng Thị Khánh Số thẻ sinh viên: 107120131 Lớp: 12H2 Lipase thu nhận từ thực vật có nhiều ưu điểm ứng dụng nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, hóa mỹ phẩm,… Trong nghiên cứu này, lipase thơ thu nhận từ phần dịch lỏng mủ vả sung Chế phẩm enzym thô khảo sát ảnh hưởng số yếu tố như: nhiệt độ, pH, ion kim loại Một vài đặc tính hóa sinh enzym lipase xác định thông qua xúc tác sinh học với chất p-nitrophenyl pamitate (p-NPP) Kết cho thấy lipase thu có hoạt tính tốt nhiệt độ 450C pH tối thích lipase từ mủ vả pH = 8,5 lipase từ mủ sung Sự có mặt ion kim loại Ca2+, K+, Mg2+, EDTA làm thay đổi hoạt độ lipase từ mủ vả khơng đáng kể Trong có mặt ion kim loại làm giảm hoạt độ lipase từ mủ sung ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA HÓA NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: ĐẶNG THỊ KHÁNH Lớp: 12H2 Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên: 107120131 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Đề tài thuộc diện: Có ký kết thỏa thuận sỡ hữu trí tuệ kết thực Nội dung phần thuyết minh tính toán: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận Kiến nghị Các vẽ, đồ thị: Không Họ tên người hướng dẫn: Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 02/02/2017 Ngày hoàn thành đồ án: 22/05/2017 PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt hà Đà Nẵng, ngày 22 tháng 05 năm 2017 Trưởng mơn Người hướng dẫn LỜI NĨI ĐẦU Đồ án tốt nghiệp học phần đóng vai trị quan trọng trình học tập sinh viên Đây học phần cuối giúp sinh viên tổng hợp lại kiến thức học trước đó, đồng thời sở để giáo viên kiểm tra, đánh giá lực, kiến thức sinh viên Hiện thị trường enzym enzym lipase chiếm phần không nhỏ Enzym thu nhận từ động vật, thực vật vi sinh vật, ứng dụng nhiều ngành công nghiệp Lipase từ thực vật với nhiều ưu điểm nên quan tâm nghiên cứu gần Nhằm mục đích làm phong phú thêm nguồn lipase từ thực vật nên thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung” Đầu tiên cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Đặng Minh Nhật Trong thời gian nghiên cứu thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ việc chọn đề tài, cung cấp nhiều kiến thức, định hướng, góp ý chỉnh sửa giúp em nắm bắt nội dung hoàn thành đồ án cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô Phan Thị Việt Hà, cô giúp đỡ việc tìm tài liệu hỗ trợ nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa, thầy phịng thí nghiệm tất bạn hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Sau cùng, tơi xin cảm ơn thầy hội đồng dành thời gian để đọc, nhận xét góp ý cho đồ án tơi Đà Nẵng, ngày 22 tháng 05 năm 2017 Sinh viên thực Đặng Thị Khánh i CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Nội dung, kết số liệu thực thu Các tài liệu tham khảo sử dụng trích dẫn rõ ràng theo tên tác giả, tên cơng trình, năm cơng bố Những nội dung hồn tồn thật, có sai sót nào, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Sinh viên thực (Chữ ký họ tên sinh viên) ii MỤC LỤC Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án Lời nói đầu cảm ơn i Lời cam đoan liêm học thuật ii Mục lục iii Danh sách bảng biểu, hình vẽ, sơ đồ v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 1.2 1.2.1 Tổng quan lipase .2 Định nghĩa Nguồn gốc Cấu trúc Cơ chế xúc tác Một số phản ứng đặc trưng .6 Ứng dụng lipase Tình hình nghiên cứu lipase ngồi nước 10 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước .10 1.3 Tổng quan vả, sung 12 1.3.1 Phân bố vả, sung 12 1.3.2 Hình thái sinh lý vả, sung .12 1.3.3 Cơng dụng, đặc tính dược lý vả, sung 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu .16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .16 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất sử dụng cho nghiên cứu .18 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp phân tích .21 2.2.3 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt tính lipase 21 2.2.4 Phương pháp đo quang .23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 iii 3.1 Thu nhận mủ từ vả, sung .24 3.2 3.3 Thu nhận chế phẩm enzym thô 24 Xác định hàm lượng protein tổng mủ vả 25 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ enzym lipase từ mủ vả, mủ sung……………… .26 3.4.1 3.4.2 3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ enzym .27 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung 29 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung 31 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC .39 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG, HÌNH VẼ Bảng 2.1 Tóm tắt bước tiến hành để xác định hoạt độ enzym lipase …….….22 Bảng 3.1 Số liệu xây dựng đường chuẩn…………………………………………….26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung…………… 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung………………… 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung……… 32 Hình 1 Cấu trúc khơng gian lipase .4 Hình Mơ hình chế xúc tác lipase bề mặt tiếp xúc hai pha dầu – nước Hình Mơ hình hoạt động lipase chất hịa tan khơng tan nước Hình Phản ứng thủy phân lipase .6 Hình Phản ứng este hóa lipase Hình Phản ứng trao đổi este Hình Phản ứng chuyển este .7 Hình Cây sung 13 Hình Cây vả 14 Hình Cây vả để thu nhận mủ…………………………………………………… 16 Hình 2 Cây sung để thu nhận mủ 16 Hình Thu nhận mủ vả .17 Hình Máy ly tâm .19 Hình Cân phân tích số 19 Hình Thiết bị đồng hóa 20 Hình Máy đo quang 20 Hình Mủ vả, mủ sung ………………………………………………………… 24 Hình Chế phẩm enzym lipase thô từ mủ vả 25 Hình 3 Phần gum tách từ mủ vả 25 Hình Đồ thị đường chuẩn phương pháp đo quang xác định hoạt độ 26 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ vả 28 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung .28 Hình Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả .30 Hình Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung 31 Hình Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả 33 Hình 10 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung 33 v Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung MỞ ĐẦU Lipase enzym thủy phân triglyxeride thành di-glyxeride, mono-glyxeride glyxerol axit béo nhờ hoạt động bề mặt phân pha dầu nước Lipase enzym linh hoạt, sử dụng để xúc tác nhiều loại phản ứng khác nhau, có khả chịu kiềm, chịu nhiệt Vì lipase ứng dụng nhiều ngành công nghiệp khác như: công nghệ thực phẩm, cơng nghiệp hóa học, cơng nghiệp mỹ phẩm, cơng nghiệp da, y dược ngành công nghiệp khác [1] Lipase phân bố động vật, thực vật vi sinh vật, song công nghiệp nguồn thu nhận lipase lớn từ vi sinh vật, nhiên enzym từ động vật thực vật góp phần làm cho nguồn enzym trở nên phong phú [1] Lipase từ thực vật chiếm phần nhỏ công nghiệp sản xuất enzym với nhiều ưu điểm giá thành thấp, enzym cố định tự nhiên, dễ dàng chấp nhận sử dụng trực tiếp chất xúc tác sinh học dạng chế phẩm thô, nên gần enzym lipase từ thực vật quan tâm nghiên cứu phổ biến [19] Ở nước ta sung vả trồng nhiều nơi, bắt gặp vùng miền nào, chúng trồng chủ yếu để lấy làm thực phẩm, mủ chúng sử dụng để chữa số bệnh Tuy nhiên nghiên cứu hai loại chưa có nhiều với mục đích khảo sát để làm phong phú thêm nguồn lipase thu nhận từ thực vật nên chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung” Hoạt độ enzym lipase xác định phương pháp đo quang bước sóng 410nm Trong đề tài này, tập trung vào nội dung sau: - Xác định hàm lượng protein mủ vả - Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzym lipase thô từ mủ vả, mủ sung - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH ion kim loại đến hoạt độ chế phẩm enzym lipase thô từ mủ vả, mủ sung SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase 1.1.1 Định nghĩa Lipase hay triacylglyxerol acylhydrolase (EC 3.1.1.3) thủy phân liên kết este tri-, di-, monoglyxeride để tạo sản phẩm diacylglyxeride, monoacylglyxeride, glyxerol axit béo Hai enzym lipase estease phân giải liên kết este, lipase enzym hoạt động bề mặt phân pha thủy phân chất béo nhũ hóa, cịn estease có tác dụng phân giải chất khơng có hoạt tính bề mặt Một lipase thực thụ cắt este huyền phù glycerine với axit béo chuỗi dài triolein tripalmitin Lipase serine hydrolase Lipase biểu thị hoạt tính dịch nước chứa chất hòa tan Ngược lại, estease biểu thị động học Michaelis-Menten bình thường dung dịch Trong tế bào nhân chuẩn, lipase tham gia vào bước khác q trình đồng hóa lipit bao gồm tiêu hóa mỡ, hấp thụ, tạo cấu trúc đồng hóa lipoprotein (Balashev et al., 2001) [2] 1.1.2 Nguồn gốc Lipase phân bố rộng rãi từ động vật, thực vật vi sinh vật Ở động vật có vú, lipase đóng vai trị chìa khóa q trình tiêu hóa lipit (lipase tuyến tụy, dày), q trình đồng hóa dị hóa (lipase ruột, gan, lyosome lipoprotein) Ngồi lipase động vật chia làm ba nhóm dựa vào phân bố hoạt tính chúng lipase tiết vào đường ruột tổ chức chuyên hóa (các lipase tiêu hóa thực phẩm), lipase tuyến sữa mô Trong thực vật, lipase tìm thấy mơ dự trữ hạt chứa dầu như: hạt thầu dầu, hạt ngũ cốc, hạt hướng dương, chủ yếu tìm thấy trình nảy mầm Trong trình ngủ nghỉ, lipase khơng hoạt động hạt thầu dầu, có hoạt động trình nghỉ Lipase vi sinh vật phân bố rộng rãi từ vi khuẩn, nấm men đến nấm Hầu hết lipase ứng dụng thương mại có nguồn gốc vi khuẩn Vi sinh vật tổng hợp lipase tìm thấy mơi trường phong phú nước thải công nghiệp, nhà máy chế biến dầu thực vật, sữa, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa (Sztajer et al., 1988), than đá, suối nước nóng (Wang et al., 1995) [2] 1.1.3 Cấu trúc Cũng enzym khác, lipase thu từ mơ, quan động, thực vật vi sinh vật Các lipase có tính chất chung, song chúng khác số tính SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Để đưa enzym lipase vào sử dụng thực tế việc xác định đặc tính quan trọng Hoạt độ lipase phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ chất, nồng độ enzym, pH, nhiệt độ, chất kìm hãm, chất hoạt hóa…Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase như: pH, nhiệt độ ion kim loại 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ enzym Nhiệt độ yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt độ enzym Khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng đến giới hạn vận tốc đạt cực đại, tiếp tục tăng vận tốc enzym giảm Nhiệt độ mà enzym hoạt động mạnh gọi nhiệt độ tối ưu Mỗi enzym có vùng hoạt động khác Để xác định nhiệt độ tối ưu lipase, giữ nguyên giá trị pH = hàm lượng chất, thay đổi giá trị nhiệt độ từ 30°C đến 60°C Sau thời gian ủ phút, tiến hành xác định hoạt độ lipase phương pháp đo quang Kết nhiệt độ tối ưu cho hoạt động phân giải lipit lipase khảo sát trình bày bảng 3.1 hình 3.4, hình 3.5: Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Nhiệt độ (0C) Hoạt độ lipase từ mủ vả (UI/ml) Hoạt độ lipase từ mủ sung (UI/ml) 30 49,8b Không khảo sát 35 51,6b 499,2c 40 54,6b 630,9b 45 63a 828,6a 50 24c 433,3c 55 18,6c 275,1d 60 14,4c Không khảo sát *Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 27 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung 70 63a Hoạt độ UI/ml 60 49.8b 51.6b 54.6b 50 40 30 24c 20 18.6c 14.4c 10 25 30 35 40 45 Nhiệt độ 50 55 60 65 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ vả 900,000 828.6a 800,000 Hoạt độ UI/ml 700,000 630.9b 600,000 499.2c 500,000 433.3c 400,000 275.1d 300,000 200,000 100,000 0,000 30 35 40 45 Nhiệt độ 50 55 60 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung ➢ Nhận xét Đồ thị cho thấy hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung tăng dần nhiệt độ tăng từ 350C đến 450C, sau giảm dần tiếp tục tăng nhiệt độ từ 450C đến 600C Hoạt độ lipase từ mủ vả đạt giá trị cao 63 UI/ml 450C, hoạt độ lipase mủ sung đạt giá trị cao 828,58 UI/ml 450C Điều tuân theo quy luật phản ứng enzym nghĩa nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng enzym tăng nhiệt độ tăng cao protein enzym bị biến tính làm cho enzym bị vơ hoạt Nhiệt độ tối ưu giống công bố Houda Lazreg-Aref cộng [10] SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 28 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung ➢ Giải thích kết Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ enzym có tác động trực tiếp đến cấu trúc khơng gian hình thể trung tâm hoạt động enzym Từ 35 ÷ 450C hoạt độ enzym lipase tăng dần, điều giải thích dựa vào động học phản ứng enzym Khi nhiệt độ tăng làm cho động enzym chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều Các phức chất enzym – chất hình thành nhiều hơn, vận tốc phản ứng thủy phân tăng theo đạt cực đại tương ứng nhiệt độ tối ưu điểm khảo sát 450C Từ 45 ÷ 600C hoạt độ enzym lipase giảm dần enzym có chất protein nên tăng nhiệt độ đến giới hạn nhiệt độ tối ưu vận tốc phản ứng enzym bị giảm Khi vùng nhiệt độ tối ưu (450C), tác dụng nhiệt độ cao enzym bị biến tính Trong q trình xử lý nhiệt độ cao, trước tiên số liên kết hydro mạng lưới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc lipase bị đứt gãy, dẫn đến cấu trúc lipase bị biến đổi, enzym bị biến tính duỗi mạch để lộ nhóm chức kị nước đồng thời tăng cường lực tĩnh điện nhóm chức mạch bên, nhóm chức trái dấu hút ngược lại, nhóm chức dấu đẩy Nếu xử lý enzym nhiệt độ cao phá vỡ liên kết hydro enzym chất Kết lớp hydrate bao quanh enzym bị phá vỡ, hình thể trung tâm hoạt động enzym khơng cịn phù hợp với chất nên hoạt lực enzym giảm dần Mức độ giảm dần hoạt động enzym phụ thuộc vào tăng nhiệt độ bị hồn tồn hoạt tính gọi nhiệt độ tới hạn, enzym có khả phục hồi lại hoạt độ 3.5.2 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung pH có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym, enzym hoạt động mạnh dải pH khác Ở giá trị pH mà enzym hoạt động mạnh gọi pH tối ưu pH môi trường phản ứng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzym ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất, độ bền cấu trúc protein enzym có nguồn gốc protein nên pH thay đổi ảnh hưởng tới độ phân ly nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động enzym - OH, - SH Để xác định pH phản ứng tối ưu, giữ nguyên giá trị nhiệt độ tối ưu vừa tìm hàm lượng chất, chọn hệ đệm thay đổi giá trị pH từ 6-10 Sau thời gian ủ phút, tiến hành xác định hoạt độ lipase phương pháp đo quang Kết pH tối ưu cho hoạt động phân giải lipit lipase khảo sát thể bảng 3.2 hình 3.6, hình 3.7: SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 29 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung Hoạt độ lipase từ mủ vả (UI/ml) 8d Hoạt độ lipase từ mủ sung (UI/ml) 1,3e 6,5 13,5d 148,3e 20,7d 178,4e 7,5 33,9d 551,5c 46,9b 820,4b 8,5 52,3b 1089,2a 58,6a 883,6b 9,5 47,8b 741,3c 10 37c 219,5d pH *Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) 70 58.6a 60 52.3b Hoạt độ UI/ml 50 47.8b 46.9b 40 37c 33.9d 30 20.7d 20 13.5d 10 8d 5,5 6,5 7,5 pH 8,5 9,5 10 10,5 11 Hình Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 30 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung 1200,000 1089.2a Hoạt độ (UI/ml) 1000,000 883.6b 820.4b 800,000 600,000 741.3c 551.5c 400,000 219.5d 178.4e 200,000 148.3e 1.3e 0,000 5,5 6,5 7,5 pH 8,5 9,5 10 10,5 Hình Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung Nhận xét Kết hình 3.6 cho thấy pH tăng dần từ đến hoạt độ lipase từ mủ vả tăng dần, hình 3.7 cho ta thấy tăng pH từ đến 8,5 hoạt độ lipase từ mủ sung tăng dần, sau hoạt độ lipase giảm dần pH tăng đến 10 Trên hình 3.6, dễ dàng nhận thấy lipase từ mủ vả đạt hoạt độ cao 58,6 UI/ml pH = 9, hình 3.7 cho thấy lipase từ mủ sung đạt hoạt độ cao 1089,171 UI/ml pH = 8,5 Ta nhận thấy hoạt độ lipase từ mủ sung cao hoạt lực lipase từ mủ vả Giá trị pH cao kết Houda Lazreg-Aref cộng [10] Giải thích kết Khi pH thay đổi từ –10 hoạt tính lipase tăng dần đạt cao pH = 8,5 hay pH = Điều giải thích dựa vào trạng thái ion hóa enzym chất, pH tăng đồng thời trạng thái ion hóa enzym chất thay đổi theo hướng hình thành phức hợp enzym – chất bền dẫn đến làm tăng vận tốc phản ứng Sau khoảng pH = - 9, hoạt lực enzym giảm nhanh ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động enzym, làm thay đổi điện tích cần thiết cho tạo thành phức hợp enzym – chất trì cấu hình khơng gian enzym nên tương tác với chất 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 31 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Lipase ứng dụng nhiều ngành công nghiệp sản xuất bột giặt nên khả giữ hoạt tính có mặt ion hỗn hợp quan trọng Tùy vào nồng độ loại ion mà làm tăng, giữ hay làm giảm hoạt tính enzym Ion kim loại thường ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Đối với lipase ion kim loại khơng tham gia hình thành cấu trúc, tác dụng chủ yếu giữ vững cấu hình khơng gian, tăng tốc độ phản ứng thông qua tạo phức với chất tham gia cầu nối kết hợp chất với enzym Để nghiên cứu ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt tính lipase, thực khảo sát với ion Ca2+, Mg2+, K+, Mn2+, EDTA, đối chứng điều kiện tối ưu ➢ Chuẩn bị mẫu thí nghiệm có chứa ion kim loại: Hỗn hợp phản ứng gồm 4860 µl dung dịch B 540 µl dung dịch A, 60µl dung dịch ion kim loại 600 µl enzym thơ 60 µl ion Ca2+, Mg2+, K+, Mn2+, EDTA, dùng dạng muối clorua 0,1 M cho khảo sát ảnh hưởng ion kim loại Các muối clorua chuẩn bị sẵn, ta khảo sát ảnh hưởng ion tới hoạt độ enzym lipase Tiến hành ủ hỗn hợp điều kiện tối ưu vòng phút Sau đo quang bước sóng 410 nm ghi lại độ hấp thụ dung dịch ➢ Chuẩn bị mẫu đối chứng không chứa ion kim loại: Tiến hành tương tự khác hỗn hợp phản ứng không chứa dung dịch ion kim loại Sau phút ủ nhiệt độ 45°C, cho kết bảng 3.3 thể hình 3.8, hình 3.9: Bảng 3.4 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả, mủ sung Ion Control Ca2+ Mg2+ K+ Mn2+ EDTA Hoạt độ lipase từ mủ vả (UI/ml) 0,265b 0,3b 0,339b 0,251b 0,954a 0,311b Hoạt độ lipase từ mủ sung (UI/ml) 828,58a 512,328b Không khảo sát 248,785c 472,796b 37,95d *Ghi chú: Trong cột, giá trị đánh dấu chữ giống khác khơng có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 32 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung 1,200 0.954a Hoạt độ UI/ml 1,000 0,800 0,600 0,400 0.300b 0.251b 0.339b 0.311b 0.265b 0,200 0,000 K+ Ca2+ Mg2+ Mn2+ EDTA Control Ion Hình Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả 900,000 828.580a 800,000 Hoạt độ UI/ml 700,000 600,000 512.328b 500,000 472.796b 400,000 300,000 248.785c 200,000 100,000 37.950d 0,000 K+ Ca2+ Mn2+ Ion EDTA Control Hình 10 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung Nhận xét Hình 3.8 cho thấy ion Ca2+, Mg2+, K+, EDTA làm thay đổi hoạt lực lipase từ mủ vả không đáng kể, nhiên ion Mn2+ lại làm tăng hoạt lực mức lớn gấp nhiều lần Hình 3.9 cho thấy ion kim loại làm giảm hoạt độ lipase từ mủ sung, EDTA làm cho enzym gần hoạt lực SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 33 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung Giải thích kết Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cấu trúc lipase cho thấy lipase enzym kim loại Tác động ion kim loại đến lipase q trình xúc tác phản ứng theo nhiều cách khác nhau: - Tham gia vào việc giữ vững ổn định cấu dạng không gian cần thiết phân tử lipase để đảm bảo thực phản ứng enzym - Có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng thông qua việc tạo thành phức với chất - Tham gia làm cầu nối kết hợp chất với trung tâm hoạt động enzym Vì mà ion kim loại ảnh hưởng tới hoạt độ enzym theo hướng có lợi, khơng có lợi không ảnh hưởng ➢ Từ kết trên, nhận thấy hoạt độ lipase từ mủ vả thấp so với hoạt độ lipase từ mủ sung Cần lưu ý tới hàm lượng nước mủ mà hàm lượng nước mủ sung mủ vả Nếu muốn so sánh với hoạt độ lipase mủ đu đủ [6] cần tinh để có kết xác hơn, chế phẩm enzym thô nằm phần không tan nước mủ đu đủ, mủ vả mủ sung chế phẩm enzym thơ lại nằm phần dịch lỏng mủ SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 34 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu, chúng tơi thu số kết sau: ➢ Đã xác định hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym thô từ mủ vả đạt 68,93% ➢ Đã xác định hàm lượng protein tổng số mủ vả 3,6 µg/µl ➢ Đã đánh giá ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt độ enzym lipase: nhiệt độ, pH, ion kim loại ➢ Đã xác định lipase từ mủ vả, mủ sung enzym chịu nhiệt, chịu kiềm tốt Lipase từ mủ vả hoạt động tối ưu 450C pH = Lipase từ mủ sung hoạt động tối ưu 450C pH = 8,5 ➢ Các ion kim loại làm thay đổi hoạt độ lipase từ mủ vả khơng đáng kể Cịn mủ sung, ion kim loại làm giảm hoạt độ lipase thu nhận từ SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 35 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung KIẾN NGHỊ Qua trình nghiên cứu cho phép đề xuất số ý kiến việc tiếp tục nghiên cứu sau: - Nghiên cứu thời gian tốc độ ly tâm để thu lipase có hoạt lực cao - Nghiên cứu tủa, tinh enzym lipase từ mủ vả, mủ sung để đưa kết luận xác hoạt độ enzym từ hai nguyên liệu SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 36 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước [1] Đặng Thị Thu Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipaza Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Bộ Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội 2004 [2] Quyền Đình Thi Phân lập số vi khuẩn nấm Việt Nam có khả sinh tổng hợp lipaza mới, nghiên cứu tái tổ hợp ứng dụng chúng công nghệ sinh học Viện khoa học công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 2009 [3] Bùi Hồng Quân, Nguyễn Đức Lượng Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipaza từ Pichia Anomala Vtcc Y0787 sử dụng ma trận plackett-burman phương pháp đáp ứng bề mặt - phương án cấu trúc có tâm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số 2009 [4] Dương Minh Lam, Vũ Thị Lý “Nghiên cứu tuyển chọn Bacillus sinh lipaza kiềm từ rừng ngập mặn”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, số 50 2011 [5] Nguyễn Ngọc Sương Mai Thu nhận khảo sát đặc tính số enzym hydrolase ứng dụng dược phẩm Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 2014 [6] Đặng Minh Nhật, Phan Thị Việt Hà, Trần Thị Bích Hà Nghiên cứu chiết tách khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Đà Nẵng 2016 [7] Lại Mai Hương, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzym lipaza từ vi sinh vật, Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 2008 Tài liệu tham khảo nước [8] Houda Lazreg-Aref, Habib Mosbah, Abdelwaheb Fekih, Massoud Mars, Khaled Said Purification and Biochemical Characterization of Lipase from Ficus carica latex of tinisian east coát zidi variety 2012 [9] Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian T Thermostable alkaline tolerant lipaza from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research 2011 [10] Fernanda Wiermann Paques Characterization of the lipaza from Carica papaya residues, Braz J Food Technol, Page 20-27 2008 [11] Muhannad I Massadeh* and Fatima M Sabra Production and characterization of lipaza from Bacillus stearothermophilus African Journal of Biotechnology Vol 10, Page 139-146 2011 [12] Christoph Brunschwiler Direct measurement of rice bran lipaza activity for inactivation kinetics and storage stability prediction Journal of Cereal Science, Page 272-277 2013 [13] Slim Abdelkafi, Nathalie Barouth Carica papaya lipaza: A naturally immobilized enzym with interesting biochemical properties Plant foods hum nutri Vol 66, Page 6770 2011 [14] Teixeira DM, Pata˜o RF, Coelho AV, Teixeira da Costa C Comparison between sample disruption methods and solid-liquid extraction (SLE) to extract phenolic compounds from Ficus carica leaves J Chromatogr A 1103:22–28 2006 SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 37 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung [15] Houda Lazreg Aref, Habib Mosbah, Abdelwaheb Fekih, Abdelraouf Kenani Purification and Biochemical Characterization of Lipase from Tunisian Euphorbia peplus Latex 2014 [16] Guiseppe Mazza Ficus auriculata Consultado el 14 de febrero de 2012 [17] Gilani AH, Mehmood MH, Janbaz KH, Khan AU, Saeed SA, Ethnopharmacological studies on antispasmodic and antiplatelet activities of Ficus carica J Ethnopharmacol 119:1–5, 2008 [18] Vaya J, Mahmood S, Flavonoid content in leaf extracts of the fig (Ficus carica L.), carob (Ceratonia siliqua L.) and pis- tachio (Pistacia lentiscus L.) BioFactors 28:169–175 2006 [19] Sgarbieri VC, Gupte SM, Kramer DE, Whitaker JR Ficus enzymes: I Separation of the proteolytic enzymes of Ficus carica and Ficus glabrata latices J Biol Chem 239:2170–2177, 1964 [20] Sonali Seth, Debamitra Chakravorty, Vikash Kumar Dubey, Sanjukta Patra, An insight into plant lipaza research – challenges encountered, Protein expression and purification Vol 95, page 2-3 2013 [21] P Villeneuve, M Pina, A Skarbek, J Graille, T.A Foglia Specifycity of Carica latex in lipase-catalyzed interesterification reactions 1997 Tài liệu website [22] http://vietbao.vn/Suc-khoe/11-loi-ich-cua-trai-va/2131636823/526/, truy cập ngày 12/05/2017 [23] https://www.foodnk.com/tim-hieu-nhanh-ve-he-enzyme-trong-nguyen-lieu-thuysan.html, truy cập ngày 27/05/2017 SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 38 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung PHỤ LỤC 1.1 Phương pháp Bradford 1.1.1 Dụng cụ thiết bị hóa chất a Dụng cụ thiết bị - Máy đo quang phổ kế - Cân phân tích - Lọ penicillin - Cốc 250 ml - Viết marker - Khăn lau - Pipette ml, 10 ml - Giấy thấm - Cuvette thủy tinh - Bình tia b Hóa chất - Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin cân phân tích, pha 1ml nước cất Lắc cho tan Khi dùng pha loãng 100 lần, dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml Trong thí nghiệm pha ml để sử dụng (lấy lọ penicillin rửa thật khơ cho vào 3960 µl nước cất, sau thêm 40 µl dung dịch albumin Lắc đều) - Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần 100 ml sau: + Coomassie Brilliant Blue G 250: 0,01 g + Ethanol tuyệt đối: ml + Phosphoric acid 85%: 10 ml + Coomassie Brilliant Blue G250 làm tan ethanol sau đem lọc Bổ sung phosphoric acid chỉnh tới 100 ml nước cất Lắc trước dùng 1.1.2 Tiến hành + Dựng đường chuẩn - Lập lọ penicillin đánh số theo thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, - Bổ sung thành phần vào lọ penicillin theo bảng sau: SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 39 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung STT Nước cất (ml) 0,9 Albumin 0,1 mg/ml (ml) Nồng độ BSA (µg/ml) Thuốc thử Bradford (ml) 5 0,8 0,7 0,6 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 10 20 30 40 50 5 5 - Lắc để yên phút - Tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm ghi nhận giá trị đo OD ống - Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang 0,4 y = 0,0073x + 0,0047 R² = 0,996 0,35 0,3 OD 595 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 10 20 30 40 Nồng độ BSA (µg/ml) 50 60 Đường chuẩn tương quan nồng độ protein mật độ quang + Định lượng protein mẫu thu - Song song với mẫu dựng đường chuẩn ta tiến hành định lượng protein - Cho vào lọ ml dịch chiết protein - Bổ sung tiếp ml thuốc thử Bradford - Lắc để yên phút - Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 595 nm ghi nhận giá trị đo OD ống Mẫu đo phải có giá trị OD595 khoảng OD595 đường chuẩn Nếu giá trị đo lớn giá lớn đường chuẩn, tiến hành pha loãng mẫu Lấy dịch pha loãng tiến hành phản ứng định lượng SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 40 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung 1.1.3 Tính tốn Dựa vào đường chuẩn dựng giá trị OD đo mẫu để suy nồng độ protein cần tìm Chú ý: Nhớ tính kết pha lỗng SVTH: Đặng Thị Khánh GVHD: PGS.TS Đặng Minh Nhật Th.S Phan Thị Việt Hà 41 ... hoạt độ 26 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ vả 28 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung .28 Hình Ảnh hưởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ vả .30 Hình Ảnh hưởng. .. Việt Hà 23 Đề tài: Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ mủ vả mủ sung CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận mủ từ vả, sung Mủ thu nhận vào lúc sáng sớm, khoảng... pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung 31 Hình Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ vả 33 Hình 10 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung 33 v Đề tài: Nghiên cứu thu