XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH CỦA CÁC GEN TP53 VÀ GEN MDM2 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN KHÁNH CHI XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH CỦA CÁC GEN TP53 VÀ GEN MDM2 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ TRẦN KHÁNH CHI XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH CỦA CÁC GEN TP53 VÀ GEN MDM2 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Huy Thịnh PGS.TS Nguyễn Thị Hà HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài tơi nhận nhiều giúp đỡ Lãnh đạo quan, đơn vị, Thầy Cô, đồng nghiệp, bệnh nhân, bạn bè gia đình thân yêu Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng tri ân sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hà PGS TS BS Trần Huy Thịnh, người thầy, người hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt trình học tập, trực tiếp hướng dẫn tơi thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, trưởng Bộ mơn Hóa sinh người thầy tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy cô, đồng nghiệp, người tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực luận án: - Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học - Trường Đại học Y Hà Nội - PGS TS Phạm Thiện Ngọc - Ngun trưởng Bộ mơn Hóa Sinh tồn thể thầy cơ, cán Bộ mơn Hóa Sinh - Trường Đại học Y Hà Nội - PGS TS Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm Gen& Protein toàn thể cán nghiên cứu viên Trung tâm - GS TS Ngô Quý Châu, Giám đốc Trung tâm Hô hấp - Bệnh viện Bạch Mai toàn thể bác sỹ, điều dưỡng Trung tâm - GS TS Mai Trọng Khoa - Giám Đốc Trung Tâm Y học hạt nhân Ung Bướu Bệnh Viện Bạch Mai toàn thể bác sỹ, điều dưỡng Trung tâm - Toàn thể bác sỹ điều dưỡng Khoa Khám bệnh - Bệnh viện Bạch Mai Xin gửi lời cảm ơn đến bệnh nhân gia đình họ giúp tơi có số liệu luận án Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp học trị thân u giúp đỡ tơi trình học tập, nghiên cứu thực luận án Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, ni dưỡng tình u thương bố mẹ tôi, bố mẹ chồng ủng hộ, động viên chồng, hai em gia đình, người ln bên tơi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, tháng 02 năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Khánh Chi, nghiên cứu sinh khóa 32 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh Y Học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Cô Nguyễn Thị Hà Thầy Trần Huy Thịnh Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 18 tháng 02 năm 2019 Người viết cam đoan Trần Khánh Chi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair Cặp base CI : Confidence Interval Độ tin cậy DNA : Deoxyribonucleic Acid Dup16 : Duplication 16bp Thêm đoạn 16 cặp base GWAS : Genome-Wide Association Studies Các nghiên cứu so sánh mức toàn hệ gen MDM2 : Murine Double Minute NST : Nhiễm sắc thể RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn enzym RNA : Ribonucleic Acid SNPs : Single Nucleotide Polymorphisms Đa hình nucleotid đơn PAHs : Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Các hydrocarbon thơm đa vòng PCR : Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi khuếch đại gen Oncogene : Gen gây ung thư OR : Odds Ratio Tỷ suất chênh Tumor suppressor gene : Gen áp chế ung thư TP53 : Tumor Protein 53 Protein khối u có trọng lượng 53 kDa UTBM : Ung thư biểu mô UTPKTBN : Ung thư phổi không tế bào nhỏ Codon : Bộ ba mã hoá A, Ala : Alanin (GCT, GCC, GCA, GCG) D, Asp : Aspartic acid (GAT, GAC) G, Gly : Glycin (GGT, GGC, GGA, GGG) M, Met : Methionin (ATG) P, Pro : Prolin (CCT, CCC, CCA, CCG) R, Arg : Arginin (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG) S, Ser : Serin (TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC) V, Val : Valin (GTT, GTC, GTA, GTG) ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi loại ung thư thường gặp có tỷ lệ tử vong cao loại hình ung thư Theo số liệu thống kê cập nhật tình hình ung thư toàn giới Globocan 2012, ung thư phổi có tỷ lệ mắc tử vong hàng đầu nam giới, tỷ lệ mắc đứng thứ tỷ lệ tử vong đứng thứ nữ giới Cũng theo thống kê này, Việt nam quốc gia nằm nhóm nước có tỷ lệ mắc ung thư phổi cao nam giới đứng thứ nữ giới [1] Cho đến nay, phẫu thuật xem phương pháp điều trị hiệu ung thư phổi Tuy nhiên, khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi phát giai đoạn muộn, khơng cịn khả phẫu thuật, phương pháp hóa trị, xạ trị định hiệu hạn chế thường mang lại nhiều tác dụng không mong muốn, làm giảm chất lượng sống bệnh nhân [2] Chính việc phát sớm yếu tố nguy để có biện pháp theo dõi chẩn đốn sớm, can thiệp kịp thời đóng vai trị đặc biệt quan trọng nhằm ngăn ngừa phát sinh, phát triển ung thư đồng thời nâng cao hiệu công tác khám điều trị bệnh Nghiên cứu chế phân tử ung thư chứng minh tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn tới phát sinh, phát triển dạng tế bào ung thư thể Quá trình chuyển dạng tế bào sang ác tính thường đánh dấu kích hoạt gen gây ung thư đột biến gây bất hoạt gen áp chế ung thư dẫn đến tế bào khơng ngừng tăng sinh, biệt hóa kháng lại chết tế bào (apoptosis) [3] Cơ chế điều hồ gen đóng vai trị quan trọng rối loạn chế điều hoà khiến hệ thống enzym sửa chữa gen tế bào khắc phục dẫn tới việc tích lũy số lượng lớn đột biến, khởi phát trình ung thư Sự điều hồ gen thơng qua mức độ biểu gen, tương tác gen hoạt động gen đường tín hiệu tế bào Điều có liên quan chặt chẽ đến kiểu gen thể đa hình nucleotid đơn (single nucleotide polymorphisms - SNPs) nằm rải rác toàn chiều dài gen Chính khác biệt vài nucleotid SNPs gen làm thay đổi cấu trúc phân tử protein từ làm thay đổi tương tác hoạt động protein mã hố gen Các gen TP53 MDM2 nhóm gen nằm đường tín hiệu p53con đường đóng vai trị quan trọng việc trì tính ổn định gen tác động yếu tố có hại thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường hoạt động gen sinh ung thư Với biến đổi xảy gen TP53 hay gen MDM2 làm thay đổi q trình sinh lý tế bào dẫn đến nguy phát sinh, phát triển ung thư [4], [5], [6], [7] Bên cạnh đó, gen TP53 gen MDM2 gen đa hình, nhiều đa hình nucleotid đơn gen tìm thấy tạo kiểu gen (genotype) khác cộng đồng [8], [9], [10], [11] Tuy nhiên, khơng phải tất kiểu gen có khả thúc đẩy hình thành tiến triển ung thư Trên thực tế, người ta xác định số SNPs gen TP53 gen MDM2 có vai trị quan trọng bệnh sinh số loại ung thư, có ung thư phổi [12] Việc xác định SNPs có vai trò quan trọng việc đánh giá nguy mắc bệnh khả đáp ứng điều trị cá thể Tại Việt Nam, năm gần có số cơng trình nghiên cứu vai trò gen TP53 ung thư phổi, nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá tính đa hình gen TP53 vai trị gen MDM2 thông qua SNPs liên quan đến ung thư phổi Nghiên cứu: “Xác định tính đa hình gen TP53 gen MDM2 bệnh nhân ung thư phổi ” thực với mục tiêu chính: Xác định tỷ lệ kiểu gen số đa hình gen TP53 gen MDM2 bệnh nhân ung thư phổi người bình thường Phân tích mối liên quan số đa hình gen TP53 gen MDM2 với nguy ung thư phổi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Ung thư phổi 1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi  Tình hình ung thư phổi giới Những nghiên cứu dịch tễ học ghi nhận, ung thư phổi loại ung thư thường gặp có tỷ lệ tử vong cao loại hình ung thư Theo số liệu thống kê tình hình ung thư tồn giới (Globocan 2012), ước tính giới có khoảng 1,82 triệu ca ung thư phổi mắc khoảng 1,59 triệu ca tử vong ung thư phổi [1] Tại Hoa Kỳ, thống kê cập nhật năm 2016, ung thư phổi loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao tỷ lệ mắc đứng thứ hai hai giới Ước tính năm 2016, Hoa Kỳ có khoảng 224.390 trường hợp ung thư phổi phát khoảng 158.080 ca tử vong, chiếm đến 26,5% tổng số ca tử vong ung thư [13] Hình 1.1: Tỷ lệ mắc ung thư phổi nam giới chuẩn hóa theo tuổi (Global Cancer Facts & Figures 2012) 186 Bond GL., Hirshfield KM., Kirchhoff T., et al (2006) MDM2 SNP309 accelerates tumor formation in a gender-specific and hormone-dependent manner Cancer Res, 66, 187 Y.-W Ren, Z.-H Yin, Y Wan, et al (2013) P53 Arg72Pro and MDM2 SNP309 polymorphisms cooperate to increase lung adenocarcinoma risk in Chinese female non-smokers: a case control study Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 14 (9), 5415-5420 188 Hamard PJ Manfredi JJ (2012) Mdm2’s dilemma: to degrade or to translate p53 Cancer Cell, 21, 3-5 189 Pfeifer GP., Denissenko MF., Olivier M., et al (2002) Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smoking associated cancers Oncogene, 21, 7435–7451 190 Gajjar M., Candeias MM., Malbert-Colas L., et al (2012) The p53 mRNA-Mdm2 interaction controls Mdm2 nuclear trafficking and is required for p53 activation following DNA damage Cancer Cell, 21, 25–35 191 Roos WP Kaina B (2006) DNA damage-induced cell death by apoptosis Trends Mol Med, 12, 440-450 192 Y J Yoon (2008) MDM2 and p53 polymorphisms are associated with the development of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection Carcinogenesis, 29 (6), PHỤ LỤC PHIẾU THƠNG TIN BỆNH NHÂN I Thơng tin chung - Họ tên : - Năm sinh : - Địa : - Điện thoại : - Mã số hồ sơ : - Chiều cao:……………… … cân nặng :…………………… II Tiền 1.Hút thuốc : có Nam khơng Số bao-năm: ……… 2.Tiếp xúc với hóa chất : 3.Các bệnh lý khác mắc trước : III Tình trạng bệnh ung thư phổi (thời điểm vào nghiên cứu) 4.Thời điểm phát ung thư phổi : 5.Phân độ ung thư phổi : ……… (T…M…N…) 6.Loại mô bệnh học K phổi : carcinoma tế bào vảy carcinoma tế bào lớn Nữ carcinoma tế bào tuyến PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH DNA TỪ MÁU TỒN PHẦN THEO KIT PROMEGA PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR  Thành phần phản ứng: - 10 x buffer: 2μl - dNTP: 2μl - Taq polymerase: 0,2μl - Mồi xuôi/Mồi ngược: - DNA: 150 ng - Nước cất: 12.8 μl μl  Tổng thể tích phản ứng: 20μl  Chu trình phản ứng PCR sau: 94°C phút 94°C 30 giây 56°C 30 giây 72°C 30 giây 72°C phút 25 chu kỳ PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR  Cách làm gel agarose 1,5% (3%) - Cân 1,5g (3g) agarose hòa tan 10ml boric acid EDTA (TBE) (sử dụng lị vi sóng) Sau agarose tan hết, để nguội 55- 60°C, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giếng cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ 4- 6- 8- 12  Cách pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA): Tris 0,89M; acid boric 0,89M; EDTA 0,02M  Tiến hành kỹ thuật điện di Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh nhân Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) 10μl cDNA - 9μl Loading buffer 10X - 1μl Tổng số 10μl 10μl - Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel - Dùng pipet đầu côn nhỏ hút dung dịch ống đưa vào giếng (10μl/giếng) - Máy điện di 80- 100v (Mupid- Nhật Bản), điện di khoảng 30 phút - Sau điện di, gel ngâm vào Edithilium bromide 20 phút, rửa qua nước cất đưa vào soi đèn UV, chụp ảnh PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR-RELP - Khuếch đại gen với cặp mồi đặc hiệu (quy trình PCR) - Điện di kiểm tra - Thực cắt sản phẩm PCR với enzym đặc hiệu tương ứng Thành phần phản ứng cắt enzym: STT Thành phần Thể tích Sản phẩm PCR 10µl Đệm 10x 1.5µl Nước 2.5µl Enzym 1µl Tổng thể tích 15µl - Hỗn hợp ủ 370C 18-22 Sản phẩm cắt điện di gel 2-3% - Phản ứng cắt enzym đạt yêu cầu băng điện di rõ nét, khơng có băng phụ PHỤ LỤC QUY TRÌNH TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR TRÊN GEL AGAROSE Sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) Chuẩn bị dung dịch rửa màng (membrance wash solution) Thêm ethanol 95% vào lọ dung dịch rửa màng Lượng ethanol cho thêm vào phụ thuộc vào thể tích lọ dung dịch rửa màng (được quy định sẵn kit) Cắt phần gel agarose có chứa sản phẩm PCR mong muốn (hiển thị đèn chiếu UV) Ước lượng trọng lượng miếng gel Cho miếng gel vào ống có dung tích 1,5 ml, thêm vào 10 µl dung dịch bám màng (membrance binding solution) cho 10 mg trọng lượng miếng gel Nhẹ nhàng trộn hỗn hợp ống ủ ống 50-600C 10 phút quan sát thấy miếng gel tan hoàn toàn Ly tâm ống để toàn DNA tập trung xuống đáy ống Đặt cột lọc (SV Minicolum) vào ống thu thập Chuyển toàn hỗn hợp gel hòa tan vào cột lọc ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm phức hợp cột lọc-ống thu thập tốc độ 14 000 vòng/phút Gỡ cột lọc ra, đổ bỏ phần dung dịch ống thu thập Sau đặt cột lọc lại ống thu thập Thêm vào cột lọc 700 µl dung dịch giửa màng ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút phút Lặp lại bước Thêm vào cột lọc 500 µl dung dịch rửa màng ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút 10 Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml Thêm vào cột 50 µl Nuclease-Free Water Ủ nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút, phút 11 Bỏ cột lọc, dung dịch ống chứa DNA đích tinh Tiếp tục thực kỹ thuật cất giữ ống -200 PHỤ LỤC QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN TRỰC TIẾP Giải trình tự gen: theo qui trình sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Quy trình thực hiện: Cho vào ống dung tích 200 µl thành phần sau Thành phần Thể tích (µl) DNA đích tinh BigDye Terminator v3.0 Mồi xuôi (hoặc mồi ngược) µM 3,2 BigDye seq buffer 5X Nước cất 8,8 (Thực ống cho mẫu: ống cho mồi xuôi, ống cho mồi ngược) Chu trình nhiệt: phút 980C, sau 15 giây 980C, sau 10 giây 600C, phút 600C 30 chu kỳ Sau phản ứng kết thúc, tiến hành tinh sản phẩm Wizard PCR Clean-up System (promega) Tiến hành phân tích trình tự gen hệ thống ABI Prism 310 (Applied Biosysterms): Cho vào giếng µl DNA 15 µl formandedide Đặt giếng vào máy giải trình tự chạy chương trình MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Ung thư phổi 1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi 1.1.2 Bệnh nguyên, bệnh sinh ung thư phổi 1.1.3 Chẩn đoán ung thư phổi 18 1.1.4 Điều trị ung thư phổi 19 1.2 Tổng quan SNP 20 1.2.1 Định nghĩa SNP 20 1.2.2 Các loại SNPs 22 1.2.3 Vai trò ứng dụng SNPs Y học 22 1.2.4 SNPs ung thư phổi 23 1.3 Gen TP53 gen MDM2 25 1.3.1.Gen TP53 25 1.3.2 Gen MDM2 31 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng nghiên cứu 39 2.1.1 Nhóm bệnh 39 2.1.2 Nhóm chứng 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 39 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 40 2.2.3 Các số nghiên cứu 40 2.2.4 Trang thiết bị, hóa chất 41 2.2.5 Quy trình nghiên cứu 42 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 48 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 48 2.3.2 Thời gian nghiên cứu 48 2.4 Xử lý số liệu 48 2.5 Đạo đức nghiên cứu đề tài 48 2.6 Kinh phí thực đề tài 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu 51 3.1.1 Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu 51 3.1.2 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu 52 3.1.3 Tình trạng hút thuốc nhóm nghiên cứu 53 3.1.4 Đặc điểm mơ bệnh học nhóm ung thư phổi 53 3.2 Kết phân tích đa hình kiểu gen TP53 54 3.2.1 Đa hình thêm 16bp vùng intron gen TP53 54 3.2.2 Đa hình kiểu gen SNP R72P gen TP53 55 3.2.3 Xác định số SNP khơng có vị trí cắt enzym giới hạn 62 3.3 Kết phân tích đa hình kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 68 3.3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen mang SNP 309T>G gen MDM2 68 3.3.2 Kết xác định kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 phương pháp PCR-RFLP 68 3.3.3 Kết kiểm tra kiểu gen vị trí SNP 309T>G gen MDM2 phương pháp giải trình tự gen 69 3.3.4 Kết phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 nhóm nghiên cứu 71 3.3.5 Các kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 nguy mắc ung thư phổi 73 3.4 Mối liên quan đa hình kiểu gen TP53 gen MDM2 với nguy mắc ung thư phổi 74 3.4.1 Mối liên quan đa hình gen TP53 nguy mắc ung thư phổi theo số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư phổi 74 3.4.2 Mối liên quan đa hình gen MDM2 SNP 309T>G nguy mắc ung thư phổi theo số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư phổi 76 3.4.3 Nguy mắc ung thư phổi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P gen MDM2 SNP 309T>G 79 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 82 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 82 4.1.1 Đặc điểm tuổi mắc bệnh nhóm bệnh nhân ung thư phổi 82 4.1.2 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu 83 4.1.3 Tiền sử hút thuốc 85 4.1.4 Kết mô bệnh học nhóm bệnh nhân ung thư phổi 87 4.2 Đa hình gen TP53 nhóm nghiên cứu 89 4.2.1 Đa hình gen thêm 16bp vùng intron gen TP53 90 4.2.2 SNP R72P gen TP53 91 4.2.3 Một số SNP khơng có vị trí cắt enzym giới hạn gen TP53 94 4.3 Đa hình gen MDM2 nhóm nghiên cứu 98 4.4 Mối liên quan đa hình gen TP53 gen MDM2 với nguy mắc ung thư phổi 103 4.4.1 Mối liên quan đa hình gen TP53 nguy mắc ung thư phổi theo số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư phổi 104 4.4.2 Mối liên quan đa hình gen MDM2 SNP 309T>G nguy mắc ung thư phổi theo số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư phổi 108 4.4.3 Kết hợp đa hình kiểu gen SNP R72P SNP309 MDM2 với nguy ung thư phổi 112 KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 116 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại SNP 47 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu 51 Bảng 3.2: Tình trạng hút thuốc nhóm nghiên cứu 53 Bảng 3.3: Đặc điểm mơ bệnh học nhóm ung thư phổi 53 Bảng 3.4: Kết phân tích đa hình thêm 16bp vùng intron gen TP53 nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng 55 Bảng 3.5: Tỷ lệ kiểu gen SNP R72P gen TP53 nhóm nghiên cứu 59 Bảng 3.6: Tỷ lệ phân bố kiểu gen SNP TP53-R72P nhóm bệnh chứng 59 Bảng 3.7: Các kiểu gen SNP R72P gen TP53 nguy mắc ung thư phổi 61 Bảng 3.8: Độ tuổi trung bình bệnh nhân ung thư phổi mang kiểu gen TP53 SNP R72P 62 Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen số SNP khơng có vị trí cắt enzym giới hạn P34P (CCC → CCA), P36P (CCG → CCT), P47S (CCG → CTG) 64 Bảng 3.10: Tần số kiểu gen codon 360 gen TP53 66 Bảng 3.11: Tỷ lệ kiểu gen codon 217 gen TP53 67 Bảng 3.12: Tỷ lệ kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 nhóm nghiên cứu 71 Bảng 3.13: Tỷ lệ phân bố kiểu gen SNP MDM2-309T>G nhóm bệnh chứng 71 Bảng 3.14: Độ tuổi trung bình bệnh nhân ung thư phổi mang kiểu kiểu gen SNP MDM2-309T>G 72 Bảng 3.15: Các kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 nguy mắc ung thư phổi 73 Bảng 3.16: Mối liên quan đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P nguy mắc ung thư phổi theo giới 74 Bảng 3.17: Mối liên quan đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P nguy mắc ung thư phổi theo mô bệnh học 75 Bảng 3.18: Mối liên quan đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P nguy mắc ung thư phổi theo trình trạng hút thuốc 76 Bảng 3.19: Mối liên quan đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G nguy mắc ung thư phổi theo giới 76 Bảng 3.20: Mối liên quan đa hình kiểu gen MDM2 SNP309T>G nguy mắc ung thư phổi theo mô bệnh học 77 Bảng 3.21: Mối liên quan đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G nguy mắc ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc 78 Bảng 3.22: Nguy mắc ung thư phổi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P gen MDM2 SNP 309T>G với hút thuốc 79 Bảng 3.23: Kết hợp đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P SNP 309T>G MDM2 với nguy ung thư phổi 80 Bảng 4.1: Tỷ lệ kiểu gen SNP 309T>G MDM2 bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng số nghiên cứu giới 100 Bảng 4.2: Kết phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 nguy mắc ung thư phổi theo chủng tộc nghiên cứu Gui 102 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Tỷ lệ mắc ung thư phổi nam giới chuẩn hóa theo tuổi Hình 1.2: Tỷ lệ mắc ung thư phổi nữ giới chuẩn hóa theo tuổi Hình 1.3: Các đường tín hiệu phân tử bệnh sinh ung thư phổi Hình 1.4: Con đường tín hiệu phát triển ung thư phổi thơng qua RTKs 10 Hình 1.5: Các đường gây apoptosis gen TP53 11 Hình 1.6: Các đường hoạt hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mơ 12 Hình 1.7: Dung hợp gen EML4-ALK đảo đoạn NST 14 Hình 1.8: Cấu tạo ALK-TK đường hoạt hóa thụ thể ALK-TK 14 Hình 1.9: Hiện tượng đa hình nucleotid đơn 22 Hình 1.10: Cấu trúc phân tử protein p53 26 Hình 1.11: Cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào p53 qua trung gian p21 28 Hình 1.12: Các SNPs vùng mã hóa khơng mã hóa gen TP53 29 Hình 1.13: Cấu trúc phân tử protein MDM2 31 Hình 1.14: Vai trị điều hịa p53 MDM2 32 Hình 1.15: Đa hình SNP 309 T/G 34 Hình 2.1 Mơ tả hình ảnh điện di xác định đa hình gen thêm 16bp vùng intron gen TP53 43 Hình 2.2: Xác định kiểu gen R72P kỹ thuật PCR-RFLP 45 Hình 2.3: Xác định kiểu gen SNP309 gen MDM2 kỹ thuật PCR-RFLP 46 Hình 3.1: Tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi theo nhóm tuổi 52 Hình 3.2: Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu 52 Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen vùng intron gen TP53 gel agarose 3% 54 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP R72P gen TP53 gel agarose 1,5% 56 Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen TP53 mang SNP R72P enzym BstUI mẫu nghiên cứu 57 Hình 3.6: Kết giải trình tự exon gen TP53 chứa SNP R72P tương ứng với kiểu gen GC (R72P R/P), CC (R72P P/P), GG (R72P R/R) 58 Hình 3.7: Phân bố kiểu gen SNP TP53-R72P nhóm bệnh chứng 60 Hình 3.8: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon gen TP53 mang SNP: P34P, P36P, P47S 62 Hình 3.9: Hình ảnh kết giải trình tự exon gen TP53 mang SNP: P34P, P36P, P47S tương ứng với kiểu gen C/C, G/G, C/C 63 Hình 3.10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 gen TP53 chứa SNP G360A gel agarose 1,5% 64 Hình 3.11: Kết giải trình tự exon 10 xác định kiểu gen SNP G360A gen TP53 65 Hình 3.12: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon gen TP53 chứa SNP V217M gel agarose 2% 66 Hình 3.13: Kết giải trình tự exon xác định kiểu gen SNP V217M gen TP53 67 Hình 3.14: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP 309T>G gen MDM2 68 Hình 3.15: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP 309T>G enzym MspA1i mẫu nghiên cứu 69 Hình 3.16: Kết giải trình tự đoạn gen chứa SNP 309T>G gen MDM2 tương ứng kiểu gen T/T, T/G, G/G 70 Hình 3.17: Phân bố kiểu gen SNP MDM2-309T>G nhóm bệnh chứng 72