Thiết kế vector baculovirus chứa gen m1 của virus h1n1 bước đầu tạo vaccine thế hệ mới

Tóm tắt luận văn Vũ Thị Thanh Nhàn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 Tóm tắt luận văn Vũ Thị Thanh Nhàn ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Duy Kháng Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus cúm 1.1.2 Đặc điểm phân đoạn gen virus 1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm tế bào vật chủ 1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng virus cúm 1.4.1 Hemagglutinin (HA) 1.1.4 Neurominidase (NA) 10 1.1.4.3 Matrix protein ( M1) virus cúm 11 1.1.5 Tình hình dịch bệnh H1N1 14 1.2 Vaccine phòng chống cúm 15 1.2.1 Đại cƣơng vaccine 15 1.2.2 Tổng quan VLPs 18 1.3 Hệ thống biểu Baculovirus 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Vector tách dòng 23 2.2.2 Vector biểu tế bào côn trùng 24 2.2.3 Hóa chất sinh phẩm 25 2.2.4 Trang thiết bị: 25 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 26 2.3.1 Tách chiết RNA tổng số 26 2.3.2 Kiểm tra RNA quang phổ kế 26 2.3.3 Tổng hợp cDNA 27 2.3.4 Nhân gen M1 virus cúm A/H1N1 PCR 28 2.3.5 Điện di gel agarose 29 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 2.3.6 Tách dòng gen 30 2.3.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli 30 2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 31 2.3.9 Kiểm tra DNA plasmid enzym giới hạn 32 2.3.10 Thu đoạn DNA từ gel agarose 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số 34 3.2 Thiết kế hộp gen M1 virus cúm A/H1N1 34 3.3 Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1 35 3.3.1 Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1 36 3.3.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α 36 3.3.3 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli 37 3.3.4 Chọn lọc vector tái tổ hợp cắt với enzym giới hạn 38 3.4 Tinh plasmid tái tổ hợp 40 3.5 Kết xác đinh trình tự 41 3.6 Thiết kế vector biểu baculovirus mang hộp gen M1 44 3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-HisTOPO 45 3.6.2 Thiết kế vector biểu pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng việt Amp Ampicillin APS Amonium persulphate Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid Ka Kanamycin Kb Kilo base kDa, Da Kilo Dalton, Dalton LB Lauria-betani medium mRNA Messeger RNA OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonuclecic Acid v/p Vịng/phút v/v Thể tích/thể tích w/v Trọng lƣợng/thể tích X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactopyranosite ĐẶT VẤN ĐỀ Những thập niên trƣớc, giới có thời gian sống yên ổn với bệnh loại virus gây nhờ thành vaccine, thuốc kháng sinh Nhƣng từ năm 1970 có nghiên cứu cảnh báo xuất vi siêu vi trùng gây đại dịch khả kháng vaccine thuốc Sau đó, từ năm Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 1980 đến cộng đồng y tế giới phải đƣơng đầu với nhiều dịch bệnh xảy nhƣ dịch AIDS dịch bệnh khác kể SARS, cúm gà H5N1, cúm lợn H1N1, dịch bị điên, Ebola v.v Theo dự đốn bệnh dịch tiếp tục phát triển hậu từ việc thay đổi khí hậu mơi trƣờng giới Bệnh cúm A/ H1N1 bệnh nhiễm trùng đƣờng hơ hấp cấp tính virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, số quốc gia khác Ban đầu thấy nhiễm lợn nhƣng sau phát loại virus nhiễm nhiều đối tƣợng động vật khác Virus đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác dựa kháng nguyên HA NA có bề mặt hạt virus Nhóm virus cúm A có 17 loại kháng nguyên HA (từ H1 đến H17) loại kháng nguyên NA (từ N1 đến N9) [25] Sự tái tổ hợp hai loại kháng nguyên tạo nhiều phân type cúm khác độc tính khả gây bệnh Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến gen/ hệ gen (đặc biệt gen mã hóa NA HA) trao đổi gen kháng nguyên với trình xâm nhiễm, tồn lây truyền loài vật chủ để tạo biến thể [30] Các vaccine truyền thống mang lại kết hữu ích cho việc ngăn ngừa chống dịch bệnh, nhiên, việc sử dụng thuốc chế hoạt động biến đổi virus A/H1N1 tế bào vật chủ gây hạn chế tính hiệu vaccine Ngồi chi phí cho sản xuất vaccine cao thời gian tƣơng đối dài Do vấn đề cấp thiết cần phải phát triển cơng nghệ nhanh chóng tạo vaccine hệ nhằm đối phó với hiểm họa cho cộng đồng tƣơng lai VLPs (Virus like particles) vaccine hƣớng công nghệ sản xuất vaccine hệ có nhiều tính ƣu việt so với vaccine hệ trƣớc Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Từ yêu cầu cấp thiết từ thực tế, thực đề tài : “Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 virus H1N1, bước đầu tạo vaccine hệ mới” Đề tài đƣợc thực phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm 1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus cúm Bệnh cúm bệnh lồi chim động vật có vú siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây Họ Orthomyxoviridae đƣợc phát hiện, bao gồm nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác kháng nguyên bề mặt capsid: virus cúm A B Hemagglutinin, virus cúm C Hemagglutinin Esterase Fusion, Thogotovirus Glycoprotein Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hình khối đa diện, đơi có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nm, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1 A) Kết phân tích thành phần hóa học cho thấy hạt virus có chứa khoảng 0,8 1,1% RNA; 70 – 75% protein; 20 – 24% lipid – 8% carbonhydrate [25] Hệ gen virus cúm A RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác virus gồm: HA, NA, M (M1 M2), NP, NS (NS1 NS2), PA, PB1, PB1 - F2 PB2 [7] Mỗi phân đoạn RNA virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đƣờng kính – 10 nm, đƣợc bao bọc nucleoprotein có chất lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1 B) Mỗi RNP kết hợp với protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trình phiên mã chép RNA virus Các phân đoạn hệ gen virus cúm A nối với cầu nối peptide tạo dạng vòm giới hạn cuối phân đoạn tạo thành sợi RNA có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền có cấu trúc xoắn α bên vỏ virus [25] Bao bọc hạt virus lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đƣợc gắn protein màng virus, đóng vai trị bảo vệ vật chất di truyền RNA Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn virus Bề mặt vỏ đƣợc bao phủ glycoprotein phân bố dày đặc Mỗi glycoprotein có kích thƣớc dài khoảng 10 – 14 nm, đƣờng kính – nm Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trị quan trọng q trình xâm nhiễm virus haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) Các phân tử HA NA phân bố không đồng (cứ – phân tử HA có phân tử NA) [25] Ngồi bề mặt vỏ cịn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép hoạt động nhƣ kênh vận chuyển ion Xen hạt virus vỏ lớp protein M1 (matrix) B A Hình 1.1: Virus cúm A/H1N1 chụp kính hiển vi (A) hình ảnh mơ cấu trúc ribonucleoprotein (B) Virus cúm A/H1N1 tƣơng đối nhạy cảm với tác nhân vật lí hóa học Ngun nhân lớp vỏ ngồi có chất lớp lipid kép nên dễ bị phá hủy dung mơi hịa tan lipid, chất tẩy rửa chất sát trùng Các hạt virus tồn thích hợp khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn 100 o C 60 oC 30 phút, bị bất hoạt oC 30 ngày, tồn thể ngƣời – ngày 1.1.2 Đặc điểm phân đoạn gen virus Virus cúm có hệ gen RNA sợi đơn âm gồm phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ – theo thứ tự giảm dần kích thƣớc phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1.2) Trong hệ gen phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; có độ dài tƣơng đối ổn Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn định có tính bảo thủ cao Hai phân đoạn mã hóa cho protein bề mặt virus (HA NA) có độ dài khơng ổn định đặc trƣng theo chủng virus [7] Hình 1.2: Mơ hình cấu trúc virus cúm A/H1N1  Phân đoạn có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PB2 Enzym có khối lƣợng phân tử khoảng 84 kDa, tiểu đơn vị thành phần phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Tính thích nghi nhiệt độ thể lồi vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 protein PB2  Phân đoạn có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym PB1 PB1 có khối lƣợng phân tử khoảng 87 kDa, tiểu đơn vị xúc tác phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trình tổng hợp RNA virus [5] Gần đây, nhà khoa học phát thêm protein PB1 - F2 đƣợc mã hóa khung đọc mở khác phân đoạn [24]  Phân đoạn có kích thƣớc 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA PA có khối lƣợng phân tử khoảng 83 kDa, tiểu đơn vị enzym polymerase chịu trách nhiệm kéo dài phiên mã RNA trình tổng hợp RNA virus Phân đoạn gen có tính bảo tồn cao  Phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm Phân đoạn gồm hai tiểu phần HA1 HA2 có độ dài thay đổi tuỳ Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 47 KTRPILSPLTKGILGFVFTLTV 68 95 RAVKLYK 101 111 GAKEVALSYSTGALASCMG 129 138 VTTEVAFGLVCATCEQ 153 177 NRMVLAS 183 233 LLENLQA 239 Kết bảng cho thấy, protein M1 dịch mã từ gen đƣợc khuếch đại tạo dịng có định kháng ngun (epitopes) Thơng tin cần thiết cho việc thiết kế vector biểu thu nhận protein tái tổ hợp Đối với số gen virus, lúc biểu thành cơng tồn gen để thu nhận protein tái tổ hợp Việc thăm dò chọn vùng epitope để thu nhận protein có tính đặc hiệu tính sinh miễn dịch cao cần thiết 3.6 Thiết kế vector biểu baculovirus mang hộp gen M1 Đoạn DNA chứa hộp gen M1 đƣợc tách khỏi vector pCRM1 BamH I Hind III, phân tách gel agarose 1% thu nhận lại kit gel Fermentas (Đức) Sản phẩm tinh sau đƣợc gắn vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO vị trí enzym tƣơng ứng BamH I Hind III nhờ T4 DNA ligase tạo nên vector tái tổ hợp pBluBacM1 Nhƣ vậy, hộp gen M1 đƣợc gắn vào vùng xen gen lacZ ORF 1629 Đây hai vị trí xảy trao đổi chéo trình tự tƣơng đồng pBluBac4.5/V5-His-TOPO DNA baculovirus để tạo virus baculovirus tái tổ hợp Qúa trình đƣợc mơ hình 3.8 44 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Hình 3.8: Sơ đồ minh họa trình thiết kế vector biểu baculovirus mang gen M1 3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-HisTOPO Vector pCRM1 vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đƣợc xử lý đồng thời enzym giới hạn BamH I Hind III Sản phẩm cắt đƣợc điện di phân tách gel agarose 1% Cắt lấy phần gel mang hộp gen M1 vector mở vòng, tinh lại nhờ kit gel Fermentas (Đức) sau điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết điện di cho thấy, hai đoạn DNA đƣợc tinh thành công, thể băng DNA có kích thƣớc khoảng 775 bp (hộp gen M1) băng có kích thƣớc khoảng 5000 bp (vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vòng) đƣờng chạy tƣơng ứng (hình 3.9) 5000bp 45 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Hình 3.9: Kiểm tra gen M1 vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO xử lý BamH I Hind III sau tinh gel agarose 1% 1: thang DNA chuẩn 1kb (fermentas) 2: gen M1 3: vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO 3.6.2 Thiết kế vector biểu pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1 Để tạo vector biểu baculovirus mang hộp gen M1, tiến hành ghép nối đoạn gen M1 với vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vòng thu đƣợc nhờ ezyme T4 DNA ligase Phản ứng ghép nối (ligation) đƣợc tiến hành 140C 16 Sản phẩm lai đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α theo phƣơng pháp sốc nhiệt Các thể biến nạp sau đƣợc cấy trải mơi trƣờng LB đặc có bổ sung Ampicilin 100 µg/ml Trên mơi trƣờng có dịng mang vector tái tổ hợp sinh trƣởng đƣợc khuẩn lạc mọc đƣợc Chúng chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy để tách plasmid kiểm tra có mặt hộp gen M1 điện di gel agarose xử lý với enzym giới hạn BamH I Hind III Kết (hình 3.10A) cho thấy plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc lớn plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc khơng mang gen ngoại lai cắt BamH I Hind III cho hai đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 5000 bp 755 bp tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc hộp 46 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn gen M1 (hình 3.10B) Nhƣ khẳng định chúng tơi thiết kế thành công vector baculovirus mang hộp gen M1 virus cúm A/H1N1 Các plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen M1 kí hiệu pBluBacM1 Tuy nhiên việc phân tích enzyme giới hạn cho ta biết plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen ngoại lai nhƣng khơng thể biết gen có gắn vào theo chiều hay ngƣợc chiều Song song với phân tích enzyme cắt giới hạn, dòng plasmid pBluBacM1 đƣợc kiểm tra lại PCR với cặp mồi “lai” với mồi xuôi (Polyhedrin forward sequencing primer) bám vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mồi ngƣợc (M1pBac-R) bám vào hộp gen M1 Bằng cặp mồi với plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen M1 gắn chiều cho sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thƣớc theo tính tốn khoảng 900bp (780bp gen M1 120bp vector) 10 11 12 13 14 15 16 17 5000bp 900bp 775bp A B Hình 3.10: Điện di plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp kiểm tra khả mang gen M1 A: Đƣờng chạy 1-6 plasmid tách từ đĩa biến nạp sản phẩm lai gen M1 plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO 47 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Đƣờng chạy plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc không mang gen B: ĐC 8-13 plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp đƣợc cắt enzym BamH Ivà Hind III Đƣờng chạy 14 thang DNA chuẩn 1kb Đƣờng chạy 15-17 sản phẩm PCR nhân đoạn gen M1 từ plasmid pBluBacM1 clone 1, 3, cặp mồi PFSP-F M1pBac-R Kết điện di (đƣờng chạy 15-17, hình 3.11B) cho thấy dịng plasmid mang hôp gen M1 gắn chiều Các plasmid đƣợc sử dụng cho nghiên cứu để tạo vaccine VLP virus cúm A/H1N1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã thiết kế đƣợc hộp gen M1 virus cúm A/H1N1 mang đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu gen hệ thống tế bào côn trùng bao gồm trình tự Kozak, mã khởi đầu mã kết thúc Đã tạo dịng xác đinh trình tự hộp gen mã hóa protein M1 virus cúm A/H1N1 Đã phân tích đƣợc trình tự đoạn gen mã hóa protein M1 phục vụ cơng tác nghiên cứu protein M1 Qua kết luận trình tự gen mã hóa protein M1 tạo dịng có độ tƣơng đồng cao (99,5% đến 100%) với trình tự cơng bố Thiết kế thành công vector biểu baculovirus (pBluBac4.5/V5-His-TOPO) mang hộp gen M1 KIẾN NGHỊ Đƣợc tiếp tục hƣớng nghiên cứu đề tài để tiến tới phát triển đƣợc vaccine VLP cúm A/H1N1 Việt Nam 48 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt: [1] Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1997), sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội [2] Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình.(2008) Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype tương đồng kháng nguyên – miễn dịch – vaccine Tạp chí cơng nghệ sinh học 6(4).tr 529 – 560 [3] Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Vă Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Trần Bình (2004) Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2(1):1- [4] Văn Thị Nhƣ Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phƣớc Hải, Trƣơng Văn Dung, Trƣơng Nam Hải, Biểu gen HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 Escherichia coli Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2007; 5(3): 313-320 [5] Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội [6] Tô Long Thành (2004) Bệnh cúm gia cầm người vấn đề phịng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XI, số 3, trang 76-83 [7] Phạm Văn Ty (2005) Virus học Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng anh: 49 Luận văn thạc sĩ sinh học [8] Vũ Thị Thanh Nhàn RNAon R, Ben-Yedidia T (2009) Preclinical efficacy of a virus-like particlebased vaccine against avian influenza H5N1 Future Microbiol 4:503-5 [9] Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology DNA potential drug targets Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93 Review [10] Bosch F X., M Orlich, H D Klenk, R Rott (1979), “The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogencity of influenza viruses”, Virolory, 95, pp 197-207 [11] Bosch FX, Garten W, Klenk HD, Rott R (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 DNA HA2 determines proteolytic cleavability pathogenicity of avian influenza viruses Virology 113: 725-735 DNA [12] Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Atmad A (2007) Influenza virus-like particles elicit broader immuno responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin Vaccine 25: 38713878 [13] Chackerian B (2007) Virus-like particles: flexible platforms for vaccine development Expert Rev Vaccines (3): 381-390 [14] Crawford AM, Miller LK (1998) Characterization of an early gene accelerating expression of late genes of the baculovirus Autographa carlifornia nuclear polyherosis virus J Virology 62: 2773-2781 [15] De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza J Clin Virol 41(1): 1-6 Review [16] Eric Ka – wai Hui, Subrata Barman, Domimic Ho – Ping Tang, Bryan FRNAce DNA Debi P Nayak, YRKL sequence of Influenza virus M1 funtion as the domain motif DNA interracts with VPS28 DNA CDc42 [17] Fedson DS (2005) Preparing for pDNAemic vaccination: an international policy agenda for vaccine development J Public Health Policy 26: 4-29 50 Luận văn thạc sĩ sinh học [18] Vũ Thị Thanh Nhàn Galarza JM, Latham T, Cupo A (2005) Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge Viral Immunol 18: 244-251 [19] Grgacic EV, DNAerson DA (2006) Virus-like particles: passport to immune recognition Methods 40:60-5 [20] Joel R Haynes , Leslie Dokken , James A Wiley , DNArew G Cawthon , John Bigger, Allen G Harmsen, Charles Richardson (2009) Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge Vaccines 27: 530-541 [20] J S Malik Peiris, Menno D de Jong, DNA Yi Guan( 2007), Avian Influenza Virus: a Threat to Human Health, p 243-267, Vol 20, No [21] Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW (2009) Influenza viruslike particles as pDNAemic vaccines Curr Top Microbiol Immunol 333:26989 [22] Kozak M (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs Nucleic Acids Res 15:8125–8148 [23] Neirynck S, Deroo T, Saelens X, VanlDNAschoot P, Jou WM, Fiers W (1999) A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein Nat Med (10): 1157-1163 [24] Nicholson KG (2009) Influenza DNA vaccine development: a continued battle Expert Rev Vaccines 8: 373-374 [24] M.Uiprasertkul et al, Apoptosis DNA Pathogensis of Avian Influenza A (H5N1) Virus in Humans, Emerging Infectious Diseases, 13 (5):708-712 (2007) [25] Murphy B.P, Webster R.G ( 1996), Orthhomyxoviruses, In Flields BN, Knipe DM, Howley, fields virology, 3rd ed, Lippincott- Raven Publisher, Philadenphia, PA,pp 1397 - 1445 51 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn [26] Peter pushko, Terrence M Tumpey, Fang Bu, John knell, Robin Robinson, Gale Smith (2005) Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, DNA M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice Vaccines 23: 5751-5759 [27] Qiao C, Tian G, Jiang Y, Li Y, Shi J, Yu K, Chen H (2006) Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China Ann N Y Acad Sci 1081: 182-192 [28] Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB (2006) Evolution DNA adaptation of H5N1 influenza virus in avian DNA human hots Indonesia DNA Vietnam Virology 350: 68-258 [29] Song JM, Hossain J, Yoo DG, Lipatov AS, Davis CT, Quan FS, Chen LM, Hogan RJ, Donis RO, Compans RW, Kang SM (2010) Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles Virology 405:165-75 [30] Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis 4: 436-441 [31] Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm-Breschkin JL, Zambon M, Hayden FG Evaluation of neuraminidase enzyme assays using different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility network J Clin Microbiol 2003; 41: 742-750 [32] Wiley, D C., I A Wilson, DNA J J Skehel 1981 Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin DNA their involvement in antigenic variation Nature 289:373-378 52 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết so sánh trình tự gen mã hóa protein M1 phân lập Việt Nam với trình tự cơng bố ngân hàng gen quốc tế Alignment DB:ID Source Length Identity% Similar% Overlap E() Influenza A EM_VI:AY770077 virus 1027 (A/chicken/ 100.000 100.000 716 2.6e197 Influenza A EM_VI:AY684709 virus 1027 (A/chicken/ 100.000 100.000 716 2.6e197 53 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Influenza A EM_VI:DQ997536 virus 1027 (A/duck/Sha 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:AY950237 virus 1027 (A/chicken/ 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:AY950239 virus 1027 (A/Chicken/ 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:AY950240 virus 1027 (A/Chicken/ 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:DQ997258 virus 1027 (A/swine/He 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:AY950241 virus 1027 (A/Chicken/ 99.860 99.860 716 8.4e197 Influenza A EM_VI:AY676045 virus strain 1002 (A/d 99.860 99.860 716 8.5e197 10 Influenza A EM_VI:AY651415 virus (A/feral 984 pi 99.860 99.860 716 8.5e197 11 Influenza A EM_VI:AY575898 virus 969 (A/Dk/HK/82 99.860 99.860 716 8.6e197 12 Influenza A EM_VI:AY651378 virus 999 (A/Ck/Indon 99.721 99.721 716 2.8e196 54 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 13 Influenza A EM_VI:AY575901 virus 984 (A/Ck/HK/YU 99.721 99.721 716 2.8e196 14 Influenza A EM_VI:AY651407 virus 984 (A/Ck/HK/YU 99.721 99.721 716 2.8e196 15 Influenza A EM_VI:AY651414 virus (A/grey 983 her 99.721 99.721 716 2.8e196 16 Influenza A EM_VI:DQ320992 virus 972 (A/chicken/ 99.721 99.721 716 2.8e196 17 Influenza A EM_VI:AY651410 virus 954 (A/Ck/HK/SS 99.721 99.721 716 2.8e196 18 Influenza A EM_VI:AY585398 virus 760 (A/duck/Gua 99.721 99.721 716 3e196 19 Influenza A EM_VI:AY651416 virus (A/tree 958 spa 99.860 99.860 714 3.2e196 20 Influenza A EM_VI:AY950243 virus 1027 (A/swan/Gua 99.720 99.720 715 5.4e196 21 Influenza A EM_VI:DQ997171 virus 1027 (A/duck/Hub 99.581 99.581 716 9.1e196 22 Influenza A EM_VI:AB212057 virus(A/Hong 1027 Kong 99.581 99.581 716 9.1e196 55 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 23 Influenza A EM_VI:DQ997170 virus 1027 (A/duck/Hub 99.581 99.581 716 9.1e196 24 Influenza A EM_VI:AY737292 virus 1027 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.1e196 25 Influenza A EM_VI:DQ366333 virus 1027 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.1e196 26 Influenza A EM_VI:AY575900 virus 1007 (A/Ck/HK/61 99.581 99.581 716 9.2e196 27 Influenza A EM_VI:AY575894 virus 1004 (A/HK/213/0 99.581 99.581 716 9.2e196 28 Influenza A EM_VI:AY575893 virus 1001 (A/HK/212/0 99.581 99.581 716 9.2e196 29 Influenza A EM_VI:AY651403 virus 999 (A/Ck/HK/YU 99.581 99.581 716 9.2e196 30 Influenza A EM_VI:DQ094265 virus 998 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 31 Influenza A EM_VI:AY651406 virus 984 (A/Ck/HK/FY 99.581 99.581 716 9.2e196 32 Influenza A EM_VI:DQ320987 virus 983 (A/migrator 99.581 99.581 716 9.2e196 56 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 33 Influenza A EM_VI:AY651376 virus 982 (A/Ck/Indon 99.581 99.581 716 9.2e196 34 Influenza A EM_VI:DQ492916 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 35 Influenza A EM_VI:DQ320998 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 36 Influenza A EM_VI:DQ492932 virus 981 (A/mallard/ 99.581 99.581 716 9.2e196 37 Influenza A EM_VI:DQ492920 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 38 Influenza A EM_VI:DQ492918 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 39 Influenza A EM_VI:AY575897 virus 981 (A/G.H/HK/7 99.581 99.581 716 9.2e196 40 Influenza A EM_VI:DQ492933 virus 981 (A/duck/Vie 99.581 99.581 716 9.2e196 41 Influenza A EM_VI:DQ492941 virus 981 (A/mallard/ 99.581 99.581 716 9.2e196 42 Influenza A EM_VI:AY651374 virus 981 (A/Ck/Indon 99.581 99.581 716 9.2e196 57 Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 43 Influenza A EM_VI:DQ492921 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 44 Influenza A EM_VI:DQ492915 virus 981 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.2e196 45 Influenza A EM_VI:DQ320985 virus 981 (A/migrator 99.581 99.581 716 9.2e196 46 Influenza A EM_VI:DQ320986 virus 966 (A/migrator 99.581 99.581 716 9.3e196 47 Influenza A EM_VI:AY651417 virus 966 (A/teal/Chi 99.581 99.581 716 9.3e196 48 Influenza A EM_VI:DQ492907 virus 956 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.3e196 49 Influenza A EM_VI:DQ492917 virus 956 (A/chicken/ 99.581 99.581 716 9.3e196 50 Influenza A EM_VI:DQ492908 virus 956 (A/quail/Bo 99.581 99.581 716 9.3e196 58 ... đề tài : ? ?Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 virus H1N1, bước đầu tạo vaccine hệ mới? ?? Đề tài đƣợc thực phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt... ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ THANH NHÀN THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS H1N1, BƢỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30... Nhân gen M1 virus cúm A /H1N1 PCR cDNA virus cúm A /H1N1 đƣợc sử dụng làm khn để nhân dịng gen mã hóa protein M1 với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F M1pBac-R đƣợc thiết kế dựa trình tự gen M1 cơng bố Genbank,