Xác định thành phần và khối lượng của plutionium trong nguồn pube bằng phương pháp gamma

kffj ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC o0o Lê Thị Liên NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ IN VITRO VÀ IN VIVO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ IN-VITRO VÀ IN-VIVO Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đình Thắng tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc chuyên ngành Sinh học thực nghiệm truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ, sinh viên Phòng Sinh học Nano Ứng dụng phịng Ung thư thực nghiệm - thuộc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein người giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơn tới đề tài mang mã số KLEPT-14-02 hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho tơi điều kiện tốt để hồn thành đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2016 Học viên Lê Thị Liên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Mơ hình nghiên cứu 1.1.1 Mơ hình nghiên cứu in vitro .2 1.1.2 Mơ hình nghiên cứu in vivo 1.2 Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) 1.2.1 Đặc điểm chung 1.2.2 Tác dụng hà thủ ô đỏ y học .4 1.2.3 Một số nghiên cứu giới 1.3 Melanin 1.3.1 Giới thiệu melanin 1.3.2 Melanocyte 1.3.3 Melanosome .7 1.3.4 Cơ sở hóa sinh q trình tổng hợp melanin 1.3.5 Cơ sở di truyền trình tổng hợp melanin 1.3.6 Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin 1.3.7 Các thị phân tử xác định mức độ biểu melanin 10 1.4 Sự hình thành sắc tố melanin sinh trƣởng cá ngựa vằn 11 1.4.1 Cá ngựa vằn 11 1.4.2 Sự hình thành sắc tố melanin trình phát triển cá ngựa vằn 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị .18 2.1.4 Dụng cụ vật tư tiêu hao 18 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Tách chiết hà thủ ô 18 2.2.2 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên khả sinh tổng hợp melanin mức độ in vitro 20 2.2.3 Khảo sát tác dụng dịch chiết lên khả sinh tổng hợp melanin mức độ in vivo 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết hà thủ ô đỏ 29 3.2 Kết nghiên cứu in vitro 29 3.2.1 Kết hoạt hóa nhân ni tế bào 29 3.2.2 Độc tính cao dịch chiết hà thủ ô đỏ sinh trưởng tế bào SK-MEL-28 30 3.2.3 Ảnh hưởng cao dịch chiết lên tăng sinh tổng hợp melanin tế bào SK-MEL-28 32 3.2.4 Con đường tác dụng cao dịch chiết HTO lên tổng hợp melanin .34 3.3 Kết in vivo 41 3.3.1 Thử độc tính methanol lên phát triển phơi cá ngựa vằn 41 3.3.2 Thử độc tính dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol lên phát triển phôi cá ngựa vằn .45 3.3.3 Đánh giá khả tăng sinh tổng hợp melanin dịch chiết hà thủ ô methanol lên cá ngựa vằn mức độ phiên mã 48 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm bật thời kì phát triển phơi cá ngựa vằn 13 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.3 Dụng cụ vật tư tiêu hao nghiên cứu 18 Bảng 2.4 Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng PCR nghí nghiệm in vitro 24 Bảng 2.6 Các đặc điểm gây chết q trình phơi nhiễm phơi 26 Bảng 2.7 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α 26 Bảng 2.8 Các thành phần phản ứng PCR thí nghiệm vi vitro 27 Bảng 2.9 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf 27 Bảng 2.10 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase 28 Bảng 3.1 Khối lượng cao dịch chiết thu từ bột khô rễ HTO đỏ 29 Bảng 3.2 Kết đo nanodrop RNA tổng số tách từ tế bào 35 Bảng 3.3 Dải nồng độ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 41 Bảng 3.4 Bảng thống kê dị dạng gây methanol 42 Bảng 3.5 Dải nồng độ dịch chiết hà thủ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 45 Bảng 3.6 Bảng thống kê dị dạng gây dịch chiết hà thủ ô methanol 46 Bảng 3.7 Môi trường phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn dùng cho thí nghiệm thử hoạt tính 48 Bảng 3.8 Kết tinh ARN tổng số 48 Bảng 3.9 Kết tổng hợp cADN 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây củ hà thủ ô đỏ .3 Hình 1.2 Cơng thức hóa học eumelanin pheomelanin Hình 1.3 Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin .7 Hình 1.4 Con đường tín hiệu điều khiển q trình sinh tổng hợp melanin .9 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển phôi cá ngựa vằn 14 Hình 2.1 Hình ảnh tế bào SK-MEL-28 20 Hình 2.2 Chu trình nhiệt PCR 27 Hình 3.1 Tế bào SK-MEL-28 (sau 24h hoạt hóa) .30 Hình 3.2 Tế bào sau bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ nồng độ khác 31 Hình 3.3 Biểu đồ đánh giá độc tính HTO đỏ 31 Hình 3.4 Tế bào sản sinh melanin nội bào ngoại bào 33 Hình 3.5 Sự khác biệt hàm lượng melanin sinh nồng độ dịch chiết HTO đỏ khác 33 Hình 3.6 Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số 34 Hình 3.7 Mức độ biểu gene giữ nhà GAPDH cDNA mẫu tế bào melanoma 36 Hình 3.8 Mức độ biểu gene MC1R cDNA mẫu tế bào melanoma 37 Hình 3.9 Mức độ biểu gene MITF (A) tyrosinase (B) cDNA mẫu tế bào melanoma .38 Hình 3.10 Mức độ biểu gene Nras (120bp) cDNA mẫu tế bào melanoma .39 Hình 3.11 Mức độ biểu gene ERK cDNA mẫu tế bào melanoma .40 Hình 3.12 Một số dị dạng quan sát phơi nhiễm methanol 43 Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót tỷ lệ dị dạng phơi nhiễm methanol phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 44 Hình 3.14 Một số dị dạng quan sát phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol .46 Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót tỷ lệ dị dạng phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô methanol phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 47 Hình 3.16 Kết điện di phân tích hình ảnh điện di Chú thích: A – Gen ef1α B – Gen mitf C – Gen tyrosinase 50 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN cADN : Acid ribonucleic : Complement acid deoxyribonucleic cAMP : Cyclic adenosine monophosphate CREB : response element-binding protein cAMP ĐC DMEM (protein bám vùng đáp ứng cAMP) : Đối chứng : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DOPA : Dihydroxyphenylalanine dpf : Day post fertilisation (ngày sau thụ tinh) ef1α : Elongation factor alpha (nhân tố kéo dài alpha) ERK EtAc : extracellular -signal -regulated kinases : Ethyl acetate Fw HTO mc1r MC1R MeOH : Forward Primer (Mồi xuôi) : Hà thủ ô : Melanocortin receptor : Melanocortin-1-receptor : Methanol MT NC n-hex OD OECD PBS Rv : Microphthalmia-associated transcription factor (nhân tố phiên mã liên kết với microphthalmia) : Môi trường : Đối chứng : n-hexane : Mật độ quang : Organisation for Economic Co-operation and Development : Phosphate – buffered saline : everse primer (Mồi ngược) PCR PKA SDS TRP1 TRP2 UV α-MSH : Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân gen) : Protein kinase A : Sodium dodecyl sulphate : Tyrosinase-related protein : Tyrosinase-related protein : Tia cực tím : α -Melanocyte-stimulating hormone mitf Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên MỞ ĐẦU Melanin loại sắc tố màu nâu đen, tìm thấy nhiều sinh vật sống, từ nấm, thực vật đến động vật có vú Nó có chức khác tất sinh vật [13] Ở người, melanin yếu tố định màu da, màu tóc Melanin tìm thấy mơ sắc tố nằm bên tròng đen mắt, tế bào thần kinh sắc tố mang khu vực não, chẳng hạn locus coeruleus chất đen [43] Rối loạn tổng hợp đường truyền dẫn melanin xem ngun nhân gây tượng tóc bị nhạt màu, nám, tàn nhang, đốm nâu sạm da Sự rối loạn sắc tố melanin gây nhiều nguyên nhân, bao gồm: yếu tố nội sinh (do di truyền) yếu tố ngoại sinh (chế độ dinh dưỡng không hợp lý, thường xuyên thức khuya, hút thuốc lá, bị stress, sốc tâm lý, tia UV ) [52] Ở thời điểm tại, chưa có số liệu thống kê cụ thể tỷ lệ bệnh nhân bị bạc tóc sớm, nákm, tàn nhang, sạm da chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu melanin chế sinh tổng hợp melanin từ tìm phương pháp điều trị [52] Ngày nay, việc chữa bệnh dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Từ lâu, nguồn dược liệu có sẵn tự nhiên dân gian sử dụng làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, chẳng hạn bệnh tim, hen suyễn, ho, thấp khớp, tiểu đường, cho thấy có kết khả quan [3] Bên cạnh đó, nhiều kết nghiên cứu cho thấy rằng, loại thuốc có nguồn gốc thảo dược có tác hại sức khỏe người, thuốc tổng hợp hóa học lại dễ gây tác dụng phụ không mong muốn [3] Các nước phương Đông, đặc biệt Việt Nam, nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm, mà hệ thống thực vật tương đối đa dạng phong phú, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc chữa bệnh từ loại thảo dược Theo kinh nghiệm dân gian, ông cha ta biết dùng hà thủ để chữa bạc tóc sớm Hà thủ có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp melanin Để trả lời câu hỏi này, chúng thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng dịch chiết hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) lên khả psinh tổng hợp melanin mức độ in vitro in vivo” với mục đích: Phân tích ảnh hưởng dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh tổng hợp melanin mơ hình tế bào mơ hình phơi cá ngựa vằn Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Liên CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Mơ hình nghiên cứu 1.1.1 Mơ hình nghiên cứu in vitro thử nghiệm tế bào Phương pháp nghiên cứu sinh học thực nghiệm cho phép người nghiên cứu sử dụng thành phần, hay phận sinh vật (thường quy mô tế bào hay vi khuẩn) dạng cô lập khỏi mơi trường thơng thường nó, để nghiên cứu phân tích chi tiết trước thực sinh vật sống Nói cách khác, thử nghiệm thường gọi "thí nghiệm ống nghiệm" [54] Viê ̣c các tế bào đô ̣ng vâ ̣t có thể nuôi cấ y , trì sự tăng sinh các chai , điã ngày càng dễ dàng các phòng thí nghiê ̣m đã mở hướng mới quan trọng công cuô ̣c tìm kiế m các hoa ̣t chấ t có vai trò quan tr ọng lĩnh vực y học Có thể thấy ưu điểm mơ hình nghiên c ứu này là khả tự đô ̣ng hóa cao , rút ngắn thời gian nghiên cứu cho phép quan sát tr ực tiếp diễn biế n tra ̣ng thái bê ̣nh lí của tế bào Đồng thời, nhà nghiên cứu thao tác lúc nhiều dòng tế bào khác , nhiề u hơ ̣p chấ t khác với dải nồ ng đô ̣ rô ̣ng Tuy nhiên, mô hình này có nhươ ̣c điể m tương tác tế bào với hợp chấ t chỉ theo mô ̣t chiề u , thiế u sự tương tác giữa các tế bào với ̣ miễn dich ̣ cũng của ̣ miễn dich ̣ với chấ t thử nghiê ̣m ; điề u kiê ̣n làm viê ̣c phải hoàn toàn vơ trùng địi hỏi ki ̃ thuâ ̣t và kinh nghiê ̣m cao của người làm thí nghiê ̣m , chi phí cho thí nghiê ̣m đắ t tiề n 1.1.2 Mơ hình nghiên cứu in vivo thử nghiệm cá ngựa vằn Phương pháp in vivo dùng để thí nghiệm dùng mơ sống hay tồn thể sống làm đối tượng thử nghiệm Các phương pháp� dạng Trên hình 3.12 rõ, nồng độ 0,95%, methanol gây dị dạng phôi (ấu thể) mức độ nhẹ: phù màng bao tim tổn thương liên quan đến mạch máu (hình 3.12A) Trong đó, nồng độ cao 1,95%, phôi (ấu thể) cá ngựa vằn mang tổ hợp nhiều kiểu hình dị dạng: phù màng bao tim, phù màng noãn 44 ...u tyrosinase Đồng thời định lượng phần mềm phân tích hình ảnh băng điện di, giếng có hàm lượng ef1α lớn (9,30; 11,57) hàm lượng giảm dần giếng 4, (hình 3.16b-A) với gen mitf tyrosinase, hàm lượng tăng dầ... Các thành phần phản ứng PCR nghí nghiệm in vitro 24 Bảng 2.6 Các đặc điểm gây chết q trình phơi nhiễm phơi 26 Bảng 2.7 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α 26 Bảng 2.8 Các thành phần. .. chế sinh tổng hợp melanin từ tìm phương pháp điều trị [52] Ngày nay, việc chữa bệnh dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Từ lâu, nguồn dược liệu có sẵn tự nhiên dân