Phân lập và thiết kế vector mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây arabidopsis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hùng Mạnh PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI Ở CÂY ARABIDOPSIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hùng Mạnh PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN Q TRÌNH PHÁT TRIỂN PHƠI Ở CÂY ARABIDOPSIS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Hồng Điệp tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội thầy cô giáo trường giảng dạy tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy giáo phịng thí nghiệm Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật, thầy cô giáo anh chị môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, thầy giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội truyền dạy kiến thức kĩ cho tơi suốt q trình học tập mái trường Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực tốt đề tài nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp tập thể lớp Sinh học thực nghiệm khóa 2012 - 2014, nhóm sinh viên phịng thí nghiệm, người sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Hùng Mạnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Arabidopsis 1.1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại 1.1.2 Sinh trưởng phát triển 1.1.3 Đặc điểm di truyền 1.1.4 Giá trị Arabidopsis .5 1.2 Tổng quan promoter 1.2.1 Khái niệm promoter 1.2.2 Phân loại promoter 1.2.3 Điều hòa gen sinh vật nhân chuẩn 11 1.2.4 Ứng dụng promoter công nghệ gen thực vật 15 1.3 Các gen ET thực vật .16 1.4 Sự phát sinh phơi hữu tính 17 1.4.1 Phát sinh phôi thực vật .17 1.4.2 Phát triển phôi Arabidopsis 18 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Các thiết bị thí nghiệm 21 2.1.2 Hóa chất mơi trường 21 2.1.3 Vi khuẩn 21 2.1.4 PlasmidpJET1.2/blunt 21 2.1.5 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Trồng Arabidopsis in vitro 22 2.2.2 Tách chiết ADN tổng số 23 2.2.3 PCR với mồi đặc hiệu 25 2.2.4 Điện di gel agarose 26 2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng 26 2.2.6 Phân tích trình tự promoter 29 2.2.7 Tạo Arabidopsis chuyển gen 29 2.2.8 Kiểm tra biểu gen gus 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Gieo trồng Arabidopsis in vitro 31 3.2 Phân tích trình tự promoter ET .33 3.3 Tách chiết ADN tổng số 35 3.4 Khuếch đại trình tự promoter ET 36 3.5 Tạo vector tái tổ hợp có chứa trình tự promoter ET 38 3.6 Tạo Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET 39 3.6.1 Tạo vector tái tổ hợp pBI121-ET 39 3.6.2 Colony PCR 40 3.6.3 Đưa promoter ET vào 41 3.7 Đánh giá Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET 41 KẾT LUẬN .44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ STT Tên viết tắt ADN Acid deoxyribonucleic Amp Ampicillin ARN Acid ribonucleic ARN pol ARN polymerase B1 Thiamine B3 Nicotinic acid B6 Pyridoxine Bp Base pairs CTAB Cetyltrimethylammonium bromide 10 dNTP Deoxyribonucleoside 5’ trisphosphates 11 E.coli Escherichia coli 12 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 13 ET Effector of transcription 14 Kb Kilo base 15 LB Lauria-Bertani 16 Mb Mega base 17 MS Murashige & Skoog, 1962 18 NaOAc Sodium Acetate 19 NaOCl Sodium hypochloride 20 PCR Polymerase Chain Reaction 21 rARN ribosomalARN 22 RNase Ribonuclease 23 snARNs Small nuclear ARN 24 SOC Super Optimal broth with Catabolic repressor 25 tARN transportARN 26 TE Tris-EDTA 27 UV Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng gieo hạt Arabidopsis in vitro 32 Bảng 3.2 Hàm lượng độ tinh mẫu ADN tổng số 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vị trí promoter sinh vât nhân sơ sinh vật nhân chuẩn Hình 1.2 Biểu gen ET phân tích GenExpress 17 Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển phơi thực vật 18 Hình 1.4 Sự phát triển phơi hạt Arabidopsis trồng phịng thí nghiệm 19 Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển phơi Arabidopsis 20 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt 27 Hình 3.1 Cây Arabidopsis tuần tuổi điều kiện ni cấy in vitro 33 Hình 3.2 Trình tự promoter ET .34 Hình 3.3 Phổ điện di ADN tổng số tách chiết từ Arabidopsis 36 Hình 3.4 Phổ điện di sản phẩm PCR promoter ET 37 Hình 3.5 Khuẩn lạc E coli mơi trường LB đặc có 50µg/ml 38 Hình 3.6 Vector tái tổ hợp pBI121-ET sở vector pBI121 39 Hình 3.7 Phổ điện di sản phẩm colony - PCR 40 Hình 3.8 Phổ điện di kiểm tra Arabidopsis chuyển gen 42 Hình 3.9 Kết nhuộm X-gluc Arabidopsis tuần tuổi 43 MỞ ĐẦU Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống người, diện lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng sống Cơng nghệ sinh học đời đánh dấu bước tiến nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên người, đặc biệt phát triển công nghệ sinh học đại nhiều năm gần Sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, nhà khoa học cố gắng tạo trồng vật ni có suất chất lượng cao, thực phẩm, dược phẩm phục vụ chữa bệnh cho người Hiện nay, công nghệ tế bào kĩ thuật chuyển gen phát triển Việt Nam Việt Nam nước nơng nghiệp truyền thống, việc phát triển ứng dụng công nghệ sinh học tập trung chủ yếu vào nông - lâm - ngư nghiệp, với mục đích đưa nơng nghiệp nước ta trở thành nông nghiệp đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất để tăng chất lượng, suất sản phẩm, đồng thời giảm thiểu sức lao động người Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều, thuận lợi để nhiều loài động, thực vật tồn phát triển Theo nhà khoa học Việt Nam quốc gia đứng thứ 16 giới đa dạng sinh học, riêng ngành thực vật bậc cao có khoảng 12000 lồi thuộc 2500 chi 300 họ [12] Trong có nhiều lồi có giá trị, đáp ứng nhu cầu khác người lương thực thực phẩm, làm thuốc, cảnh,… Trong công nghệ chuyển gen thực vật, việc thiết kế vector biểu khâu quan trọng đóng góp lớn cho thành cơng cơng nghệ Vì việc tìm kiếm, phân lập promoter gen có giá trị có ý nghĩa vô quan trọng công tác nghiên cứu chọn lọc giống Để đạt hiệu cao công tác người ta thường nghiên cứu sinh vật mơ hình, có Arabidopsis Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) khơng có ý nghĩa mặt nơng nghiệp, nghiên cứu đóng vai trò quan trọng Arabidopsis chọn mơ hình nghiên cứu thực vật nhà khoa học giới sử dụng từ lâu Arabidopsis có gen nhỏ khoảng 125 Mb, hoàn toàn giải trình tự cơng bố năm 2000 Chu kỳ sinh trưởng Arabidopsis ngắn (khoảng 6-8 tuần), cho nhiều hạt dễ dàng nuôi trồng không gian hẹp hiệu việc sử dụng phương pháp chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium Sự hình thành phát triển hạt nhiều yếu tố quy định có hormone thực vật ABA, GA… hormone tham gia hoạt hóa nhiều gen liên quan đến phát triển hạt Từ lý trên, tiến hành thực đề tài: “Phân lập thiết kế vecter mang promoter liên quan đến q trình phát triển phơi Arabidopsis”, với mục tiêu cụ thể sau: Thiết lập nguồn mẫu Arabidopsis in vitro Nhân dịng trình tự promoter liên quan đến q trình phát triển phôi hạt Arabidopsis Đã thiết kế vector tái tổ hợp pBI121-ET có mang trình tự promoter ET tiến hành đưa vào Arabidopsis giống Columbia Bước đầu phân tích trình tự promoter ET Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Arabidopsis 1.1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại Arabidopsis (tên Latin Arabidopsis thaliana) loài thực vật có hoa nhỏ thuộc họ Cải (Brassicaceae), Brassicales [38] Arabidopsis có nguồn gốc từ Châu Âu, Châu Á Tây Bắc Châu Phi Arabidopsis lần phát năm 1577 dãy núi Harz bác sỹ người Đức Johannes Thal (1542-1583) gọi Pilosella siliquosa Đến năm 1841, danh pháp đổi thành Arabidopsis thaliana nhà thực vật học người Đức Gustav Heynhold để vinh danh Thal Các lồi Arabidopsis tìm thấy tự nhiên khắp nơi Bắc bán cầu Arabidopsis tìm thấy độ cao từ mực nước biển dãy núi cao Himalayas, từ phía bắc Scandinavia đến Bắc Phi, bao gồm Cape Verde Islands vĩ độ 16 Nó tìm thấy Bắc Mỹ, bắt nguồn từ Châu Âu [38] 1.1.2 Sinh trưởng phát triển Arabidopsis có chu kì sống tương đối ngắn so sánh với lồi thực vật khác Tồn chu trình sống bao gồm nảy mầm hạt, tạo thành hình hoa thị, mọc thân chính, hoa thời sinh trưởng đến hình thành hạt khoảng đến tuần Arabidopsis có kích thước nhỏ, phát triển thành cụm hình hoa thị đường kính 2-10 cm, hoa dài mm, hạt trưởng thành đạt kích thước 0.5 mm chiều dài Lá bao phủ lông đơn bào nhỏ gọi trichomes thuận tiện cho nghiên cứu hình thái khác biệt tế bào Lá thật thứ có trichomes bề mặt lá, cịn lại có mặt Số lượng hình hoa thị hình thành phụ thuộc vào kiểu gen điều kiện môi trường với tương quan mạnh với thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc bắt đầu hoa [38] Hạt giống Arabidopsis nhỏ, có hình bầu dục Hạt giống nảy mầm cách dễ dàng, hạt sau thu hoạch cần xử lý lạnh vài ngày lưu trữ bảo quản thời gian để hạt có sức nảy mầm tốt Hạt thường yêu cầu ánh sáng để nảy mầm 3.5 Tạo vector tái tổ hợp có chứa trình tự promoter ET Sau tinh PCR Purification Kit (Norgen, Canada) , sản phẩm PCR khuếch đại promoter ET gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt đầu Do enzyme Taq polymerase nTaq-HOT tạo sản phẩm PCR có đầu dính, nên trình tự promoter ET phải xử lý cắt A để chuyển sang dạng đầu Quá trình xử lý cắt bỏ A ghép nối trình tự promoter ET vào vector pJET1.2/blunt thực với kít CloneJET PCR Cloning Kit (Fermentas) để tạo vector tái tổ hợp pJET1.2/blunt-ET Để kiểm tra kết gắn kết, vector tái tổ hợp pJET1.2/blunt-ET biến nạp vào vi khuẩn E coli theo phương pháp sốc nhiệt nuôi qua đêm 37oC Vector pJET1.2/blunt tự đóng vịng biểu enzyme giới hạn làm cho tế bào vi khuẩn không nhân lên bị chết Kết có tế bào E coli có chứa vector tái tổ hợp pJET1.2/blunt-ET sinh trưởng tạo khuẩn lạc màu trắng đục (Hình 3.5) Do vector pJET1.2/blunt chứa gen kháng ampicillin, nên bổ sung thêm phương cách để chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt-ET Hình 3.5 Khuẩn lạc E coli mơi trường LB đặc có 50µg/ml 38 3.6 Tạo Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET 3.6.1 Tạo vector tái tổ hợp pBI121-ET Trước tiên plasmid pJET1.2/blunt-ET cắt enzyme giới hạn ScaI BamHI để giải phóng trình tự promoter ET với đầu dính hình thành từ enzyme Tương tự, vector chứa gen GUS pBI121 cắt enzyme ScaI BamHI nhằm loại bỏ trình tự promoter 35S Phản ứng gắn trình tự promoter ET vào vị trí promoter 35S vector pBI121 có thành phần sau : 2x bufer µl Promoter ET µl pBI121 µl T4 ligase 0,5 µl Nước 2,5 µl Tổng số 10 µl Hình 3.6 Vector tái tổ hợp pBI121-ET sở vector pBI121 39 Phản ứng tiến hành nhiệt độ phịng khoảng 20 phút, sau dùng µl phản ứng để biến nạp vào vi khuẩn E coli theo phương pháp sốc nhiệt cấy trải mơi trường LB có chứa kháng sinh kanamicin Những tế bào vi khuẩn E coli có mang vector tái tổ hợp pBI121-ET sinh trưởng mơi trường có kanamicin hình thành khuẩn lạc màu trắng đục 3.6.2 Colony PCR Để kiểm tra nhanh xem tế bào vi khuẩn sinh trưởng môi trường có ampicillin có chứa plasmid tái tổ hợp pBI121-ET hay không, dã sử dụng phương pháp colony PCR Lấy ngẫu nhiên số khuẩn lạc màu trắng đục làm khuôn cho phản ứng PCR Sử dụng cặp mổi EF1/ER1 nhân dịng trình tự promoter ET tiến hành chu trình nhiệt tương tự Kết phản ứng PCR thể hình 3.7 Các băng ADN khuếch đại từ khuẩn lạc lựa chọn có kích thước khoảng 1500 bp phù hợp với kích thước promoter ET Điều chứng tỏ khuẩn lạc chọn nhẫu nhiên chứa plasmid mang trình tự promoter Một ba khuẩn lạc chọn cho nuôi cấy để tách plasmid pBI121-ET M Kb 2,0 1,5 1,0 Hình 3.7 Phổ điện di sản phẩm colony - PCR M: Smart Ladder DNA (Erogentec, Bỉ) 1, 2, 3: Thứ tự colony chọn để tiến hành PCR 40 3.6.3 Đưa promoter ET vào Plasmid pBI121-ET tách từ khuẩn lạc kiểm tra dương tính với PCR biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 theo phương pháp Sambrook Russell (2001) ] Sau cấy trải mơi trường YEB đặc có chứa kháng sinh 50 mg/l kanamicin, 25 mg/l rifammycin nuôi tủ ấm 28oC ngày Chỉ tế bào vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid pBI121-ET có chứa gen chọn lọc sinh trưởng mơi trường có kanamicin Lựa chọn khuẩn lạc Agrobacterium để nuôi cấy tiến hành chuyển vào Arabidopsis cách nhúng hoa theo phương pháp Clough and Bent (1998) [68] Đây hệ Arabidpopsis T0, tiếp tục ni trồng phịng thí nghiệm Sau khoảng 4-5 tuần, hạt chín già cần thêm tuần để thu hạt khô Do tỷ lệ chuyển gen đích vào Arabidopsis theo phương pháp Clough and Bent thấp nên đa số hạt thu hạt kiểu dại (khơng chứa gen đích), cần tiếp tục sàng lọc để thu nhận hạt mang trình tự promoter ET 3.7 Đánh giá Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET Hạt Arabidopsis hệ T1 thu bao gồm loại: loại hạt chuyển gen loại hạt kiểu dại chiếm đa số Hạt khử trùng gieo môi trường MS có chứa kháng sinh kanamicin nồng độ 50 mg/l Do hạt chuyển gen có chứa trình tự promoter ET sinh trưởng được, cịn hạt kiểu dại khơng nảy mầm nảy mầm hình thành sớm bị vàng dần chết Để khẳng định thêm thu thực chuyển gen, tách ADN tổng số ngẫu nhiên dùng làm khuôn cho phản ứng PCR Sử dụng mồi ER2 (5’-GGTTGGGGTTTCTACAGGACGTAA-3’) làm mồi ngược, bắt cặp vào trình tự khởi đầu gen GUS mồi xi F1 với chu trình nhiệt tương tự khuyếch đại promoter ET Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% cho thấy mẫu mang trình tự promoter ET (Hình 3.8) Như vậy, chúng tơi đưa thành công cấu trúc chứa promoter ET-GUS vào Arabidopsis dùng Arabidopsis cho thí nghiệm 41 M Kb 2,0 1,5 1,0 Hình 3.8 Phổ điện di kiểm tra Arabidopsis chuyển gen M: Smart Ladder DNA (Erogentec, Bỉ) 1, 2, 3: Các sản phẩm PCR từ mẫu ADN khác tách từ chuyển gen Theo tác giả Rumen Ivanov cộng (2008) [66], gen ET có vai trị quan trọng q trình hình thành phát triển hệ thống mạch dẫn cây, đặc biệt trì trạng thái khơng phân hóa tế bào mô phân sinh (mạch tượng tầng) Vì tế bào này, hoạt động promoter ET tăng cường so sánh với tế bào khác Arabidposis mang trình tự promoter ET-GUS Trên sở đó, để bước đầu đánh giá hoạt tính promoter ET, chúng tơi tiến hành nhuộm X-gluc chuyển gen kiểu dại Dưới điều khiển promoter ET, gen GUS biểu tạo protein βglucuronidase (GUS) enzyme phản ứng với chất X-gluc tạo thành chất kết tủa chỗ có màu xanh chàm Kết hình 3.9 cho thấy Arabidopsis mang promoter ET xuất màu xanh chàm hệ thống mạch dẫn cây, kéo dài từ rễ, qua thân đến hệ mạch Đặc biệt đầu rễ đỉnh sinh trưởng, nơi tập trung mô phân sinh hoạt động mạnh có bắt màu đậm Điều chứng tỏ promoter ET thể hoạt tính tế bào mô phân sinh hệ mạch dẫn Kết phù hợp với nhận xét trước tác giả Ivanov cộng (2008) [64] 42 Tuy nhiên, hạn chế thời gian đồng thời thiếu số thiết bị hóa chất thí nghiệm, nên chúng tơi chưa tiến hành thí nghiệm phân tích hay nhuộm X-gluc phôi hay nội nhũ để đánh giá hoạt động promoter ET cấu trúc A B Hình 3.9 Kết nhuộm X-gluc Arabidopsis tuần tuổi A : Arabidopsis kiểu dại B : Cây Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET 43 KẾT LUẬN Từ kết thu nói trên, chúng tơi đưa số kết luận sau: Dùng dung dịch NAOCl với nồng độ 0,5% thời gian phút loại bỏ hồn toàn vi sinh vật khỏi hạt Arabidopsis Sau 3-4 ngày gieo mơi trường MS, có khoảng 92% hạt nảy mầm phát triển thành Tách chiết ADN tổng số với chất lượng tốt từ Arabidopsis nuôi cấy in vitro, đảm bảo độ sach với giá trị A260/280 từ 1,82 đến 1,95 Đã thiết kế vector tái tổ hợp pBI121-ET có mang trình tự promoter ET tiến hành đưa thành công vào Arabidopsis giống Columbia Bước đầu phân tích Arabidopsis mang cấu trúc promoter ET-GUS đánh giá hoạt động promoter hệ thống mạch dẫn mô phân sinh KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân tích hoạt tính promoter ET qua nhuộm X-gluc cấu trúc phôi, nội nhũ giai đoạn phát triển khác để khẳng định promoter có liên quan đến q trình phát triển phơi/hạt Arabidopsis 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Lý Anh, Hồ Thị Thu Thanh, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Tấn Hưng (2009), “Nghiên cứu nuôi cấy in-vitro hoa đào Nhật Tân (Prunus persica L.)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 7(4), tr.387-393 Lê Hồng Điệp, Ngô Thị Trang (2012), “Arabidopsis - thực vật mô hình cho thực vật bậc cao”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 28, tr.19-27 Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương, Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Xuân Hội (2014), “Thiết kế vector biểu mang gen OsNAC1 điều khiển promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số 4, tr.1-10 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter ứng dụng cơng nghệ gen thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1), tr.118 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hồng Hà (2010), “Tách dịng đánh giá hoạt động promoter cảm ứng khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(4), tr.1809-1814 Võ Thị Thương Lan (2011), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo Dục Việt Nam Trần Thị Lệ (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro hoa mắt mèo (Torenia fournieri L.)”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 57 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo Dục Việt Nam Nguyễn Đình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Vân Thùy, Huỳnh Hữu Đức (2008), “Nghiên cứu phương pháp khử trùng mầm chồi từ trưởng thành số giống điều (Anacardium occidentale L.) cao sản”, Science & Technology Development, 11(07) 45 10 Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội 11 Đỗ Lê Thăng (2008), Giáo trình Di truyền học, NXB Giáo Dục 12 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 13 Chu Văn Mẫn (2011), Tin học công nghệ sinh học, NXB Giáo Dục Việt Nam 14 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lí học thực vật, NXB Giáo Dục Tiếng Anh 15 Adams M D., S E Celniker, R A Holt, C A Evans, J D Gocayne, P G Amanatides, and P Brokstein (2000), “The genome sequence of Drosophila melanogaster”, Science, 287(5461), pp.2185-2195 16 Alberts B., A Johnson, J Lewis, M Raff, K Roberts and P Walter (2002), Molecular biology of the cell, Garland Science, New York, 4, pp.36 17 Benfey P N., Chua N H (1990), “The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, 250(4983), pp.959966 18 Berg J M., J L Tymoczko and L Stryer (2002), Biochemistry, New York 19 Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis genome: a foundation for plant research”, Genome Research, 15(12), pp.1632-1642 20 Brandenberg O., A Sensi, K Ghosh, A Sonnino, Z Dhlamini, A Sensi, and Z Dhlamini (2011), Biosafety resource book: Introduction to molecular biology and genetic engineering 21 Choi H I., J H Hong, J O Ha, J Y Kang and S Y Kim (2000), “ABFs, a family of ABA-responsive element binding factors”, Journal of Biological Chemistry, 275(3), pp.1723-1730 22 Conkling M A., C L Cheng, Y T Yamamoto and H M Goodman (1990), “Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant Physiology, 93(3), pp.1203-1211 46 root-specific genes from 23 Dickman M B (2004), “Can model plants help banana improvement through biotechnology”, Info Musa, 33, pp.6-11 24 Draper C K., Hays J B (2000), “Replication of chloroplast, mitochondrial and nuclear DNA during growth of unirradiated and UVB-irradiated Arabidopsis leaves”, The Plant Journal, 23(2), pp.255-265 25 Featherstone M (2002), “Coactivators in transcription initiation: here are your orders”, Current opinion in genetics & development, 12(2), pp.149-155 26 Franỗois O., M G Blum, M Jakobsson and N A Rosenberg (2008), “Demographic history of European populations of Arabidopsis thaliana”, PLoS genetics, 4(5), e1000075 27 Froger A., Hall J E (2007) “Transformation of plasmid DNA into E.coli using the heat shock method”, Journal of visualized experiments: JoVE, (6) 28 Glasel J.A (1995), “Validity of Nucleic Acid Purities Monitored by A260/A280 Absorbance Ratios”, Biotechniques, 18, pp.62-63 29 González J., F Reyes, C Salas, M Santiag, Y Codriansky, N Coliheuque and H Silva (2006), “Arabidopsis thaliana: A model host plant to study plantpathogen interaction using Chilean field isolates of Botrytis cinerea”, Biological research, 39(2), pp.221-228 30 Haas B J., J R Wortman, C M Ronning, L I Hannick, R K Smith, R Maiti, and C D Town (2005), “Complete reannotation of the Arabidopsis genome: methods, tools, protocols and the final release”, BMC biology, 3(1), 31 Hall A E., A Fiebig and D Preuss (2002), “Beyond the Arabidopsis genome: opportunities for comparative genomics”, Plant Physiology, 129(4), pp.14391447 32 Hays J B (2002), “Arabidopsis thaliana, a versatile model system for study of eukaryotic genome-maintenance functions”, DNA repair, 1(8), pp.579-600 33 Higo K., Y Ugawa, M Iwamoto and T Korenaga (1999), “Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999”, Nucleic acids research, 27(1), pp.297-300 47 34 Ho M W., A Ryan and J Cummins (1999), “Cauliflower mosaic viral promoter-a recipe for disaster?”, Microbial Ecology in Health and Disease, 11(4), pp.194-197 35 Hohn T., Fütterer J (1992), “Transcriptional and translational control of gene expression in cauliflower mosaic virus”, Current opinion in genetics & development, 2(1), pp.90-96 36 Huang J W., J T Chen, W P Yu, L F Shyur, A Y Wang, H Y Sung, and J C Su (1996), “Complete structures of three rice sucrose synthase isogenes and differential regulation of their expressions”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60(2), pp.233-239 37 Koornneef M., Meinke D (2010), “The development of Arabidopsis as a model plant”, The Plant Journal, 61(6), pp.909-921 38 Koornneef M., Scheres B (2001), “Arabidopsis thaliana as an experimental organism”, eLS 39 Lescot M., P Déhais, G Thijs, K Marchal, Y Moreau, Y Van de Peer, and S Rombauts (2002), “PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences”, Nucleic acids research, 30(1), pp.325-327 40 Li S., L M Anderson, J M Yang, L Lin and H Yang (2007), “DNA transformation via local heat shock”, Applied physics letters, 91(1), 013902 41 Liu L., Y Zhou, M W Szczerba, X Li and Y Lin (2010), “Identification and application of a rice senescence-associated promoter”, Plant physiology, 153(3), pp.1239-1249 42 Loivamäki M., F Gilmer, R J Fischbach, C Sörgel, A Bachl, A Walter and J P Schnitzler (2007), “Arabidopsis, a model to study biological functions of isoprene emission?”, Plant Physiology, 144(2), pp.1066-1078 43 Maniatis T., E.F Fritsch, and J Sambrook (1982), Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY 44 Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms”, Journal of molecular biology, 3(2), pp.208-218 48 45 Martínez-Zapater J., Salinas J (1998), Arabidopsis protocols, Humana Press 46 McCourt P., Keith K (1998), “Sterile techniques in Arabidopsis”, Arabidopsis Protocols, Humana Press, pp.13-17 47 Meinke D W., J M Cherry, C Dean, S D Rounsley and M Koornneef (1998), “Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis”, Science, 282(5389), pp.662-682 48 Meyerowitz E M (2001), “Prehistory and history of Arabidopsis research”, Plant physiology, 125(1), pp.15-19 49 Noad R J., D S Turner and S N Covey (1997), “Expression of functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic acids research, 25(6), pp.1123-1129 50 Noh Y S., Amasino R M (1999), “Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12”, Plant molecular biology, 41(2), pp.181-194 51 Page D R., Grossniklaus U (2002), “The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana”, Nature Reviews Genetics, 3(2), pp.124-136 52 Pang P P., Meyerowitz E M (1987), “Arabidopsis thaliana: a model system for plant molecular biology”, Nature BioTechnology, 5(11), pp.1177-1181 53 Tajrishi M M., Tuteja N (2011), “Isolation and in silico analysis of promoter of a high salinity stress-regulated pea DNA helicase 45”, Plant signaling & behavior, 6(10), pp.1447-1450 54 Tester M., Bacic A (2005), “Abiotic stress tolerance in grasses From model plants to crop plants”, Plant Physiology, 137(3), pp.791-793 55 The Arabidopsis Genome Initiative (2000), “Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana”, Nature, 408, pp.796-815 56 The C elegans Sequencing Consortium (1998), “Genome sequence of the nematode C elegans: A platform for investigating biology”, Science, 282, pp.2012-2046 49 57 Turner D S., D G McCallum and S N Covey (1996), “Roles of the 35S promoter and multiple overlapping domains in the pathogenicity of the pararetrovirus cauliflower mosaic virus”, Journal of virology, 70(8), 4514 58 Yin Y., L Chen and R Beachy (1997), “Promoter elements required for phloem- specific gene expression expression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal, 12(5), pp.1179-1188 59 Yu W P., A Y Wang, R H Juang, H Y Sung and J C Su (1992), “Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic DNA”, Plant molecular biology, 18(1), pp.139-142 60 Clarke J.D (2002), “Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) DNA Miniprep for Plant DNA Isolation” Arabidopsis: A Laboratory Manual CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10(1101), pp 51-77 61 Ellerström, M., W Reidt, R Ivanov, J Tiedemann, M Melzer, A Tewes, T Moritz, H P Mock, F Sitbon, L Rask and H Bäumlein (2005), “Ectopic expression of EFFECTOR OF TRANSCRIPTION perturbs gibberellinmediated plant develomental processes”, Plant Molecular Biology 59, pp 663681 62 Kilian, J., D Whitehead, J Horak, D Wanke, S Weinl, O Batistic, C D'Angelo, E Bornberg-Bauer, J Kudla and K Harter (2007), “The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses”, Plant J, 50(2), pp 347-363 63 Kobra Nalbandi, Bahram Baghban Kohnehrouz, Khalil Alami Saeed (2013), “Cloning and Functional Characterization of Promoter Elements of the D Hordein Gene from the Barley by Bioinformatic Tools”, International Scholarly and Scientific Research &Innivation, 7(2), pp.152-157 64 Le Qing Qu, Yan Ping Xing, Wen Xian Liu, Xiu Ping Xu and Yan Ru Song (2008), “Expression pattern and activity of six glutelin gene promoters in transgenic rice”, Journal of Expermental Botany, 59(9), pp.2417-2424 50 65 Omodele Ibraheem, Chrisiaan E.J Botha, Graeme Bradley (2010), “In silico analysis of cis-acting regulatory elements in 5’ regulatory regions of sucrose transporter gen families in rice (Oryra sativa Japonica) and Arabidopsis thaliana”, Computationnal Biology and Chemistry, 34(2010), pp 268-283 66 Rumen Ivanov, Jens Tiedemann, Andreas Czihal, Anna Schallau, Le Hong Diep, Hans-Peter Mock, Bernhrd Claus, Annegret Tewes, Helmut Baumlein, (2008), “EFFECTOR OF TRANSCRIPTION2 is involed in xylem differentiation and includes a functional DNA single strand cutting domain”, Developmental Biology, 313(2008), pp 93-106 67 Sambrook, J and D W Russell Eds (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor LAboratory Press 68 Seven J Clough, Andrew F Bent (1998), “Floral dip: a simplified method for Agrobacterrium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana” The Plant Journsl, 16(6), pp 735-743 69 Yong-Chun Zuo, Qian-Zhong Li (2011), “Identification of TATA and TATAless promoters in plant genomes by integrating diversity measure, GC-Skew and DNA geometric flexibility”, Genomics, 97(2011), pp.112-120 70 Weigel, D and J Glazebrook Eds (2002) Arabidopsis: A Laboratory Manual New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 51 PHỤ LỤC Môi trƣờng MS STT Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) NH4 NO3 1650 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KNO3 1900 KH2PO4 170 ZnSO4.7H2O 8,6 Na2EDTA.2H2O 37,3 MnSO4.1H2O 27,8 H3PO3 6,2 10 FeSO4.7H2O 27,8 11 KI 0,83 12 CoCl2.6H2O 0,025 13 CuSO4.5H2O 0,025 14 Na2MoO4 0,25 Môi trƣờng SOC STT Thành phần Khối lƣợng (g/l) Cao nấm men Tryptone 20 NaCl 0,58 KCl 0,186 Glucose 2M (Cho vào dung dịch có đầy đủ ml thành phần sau hấp khử trùng) ... vecter mang promoter liên quan đến trình phát triển phôi Arabidopsis? ??, với mục tiêu cụ thể sau: Thiết lập nguồn mẫu Arabidopsis in vitro Nhân dịng trình tự promoter liên quan đến q trình phát triển. .. NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hùng Mạnh PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI Ở CÂY ARABIDOPSIS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:... trưởng rễ  Phôi muộn: phát triển mô học mạnh mê, bao gồm việc thiết lập đỉnh sinh trưởng rễ chồi Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển phơi thực vật 1.4.2 Phát triển phôi Arabidopsis Sự phát triển