Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ (SSTT) phổ biến nhất (chiếm 60%-80%). Theo WHO, AD là một trong năm nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, là gánh nặng toàn cầu về sức khỏe cũng như kinh tế xã hội. Bài viết trình bày đánh giá mối quan hệ kiểu gen - kiểu hình của bệnh nhân Alzheimer người Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 TƯƠNG QUAN KIỂU GEN, KIỂU HÌNH TRONG BỆNH ALZHEIMER Nguyễn Thị Tuyết Lan1, Đặng Thị Minh Trang1, Đỗ Nông Xuân Mai1, Tống Mai Trang2, Trần Công Thắng3, Phan Ngọc Minh1, Giang Hoa1, Đỗ Thị Thanh Thủy1, Trương Đình Kiệt1 TĨMTẮT Đặt vấn đề: Bệnh Alzheimer (AD) dạng sa sút trí tuệ (SSTT) phổ biến (chiếm 60%-80%) Theo WHO, AD năm nguyên nhân gây tử vong hàng đầu toàn giới, gánh nặng toàn cầu sức khỏe kinh tế xã hội Hiện nay, nghiên cứu tìm dấu ấn sinh học AD quan tâm, mục đích để phát sớm bệnh Alzheimer Tuy nhiên, làm khiêm tốn, đến AD bệnh khơng thể chữa khỏi khó dự phịng cách hiệu Trong nghiên cứu này, thực giải trình tự hệ mẫu DNA gen từ máu ngoại vi bệnh nhân AD Việt Nam để khảo sát tương quan kiểu gen kiểu hình Sự thành cơng nghiên cứu cung cấp phổ biến thể gen liên quan đến thể khởi phát sớm muộn bệnh Alzheimer, tạo tiền đề cho nghiên cứu mở rộng, hướng đến mục đích phát sớm để điều trị hiệu bệnh Mục tiêu: Đánh giá mối quan hệ kiểu gen - kiểu hình bệnh nhân Alzheimer người Việt Nam kỹ thuật giải trình tự gen hệ Đối tượng - Phương pháp: Mẫu máu bệnh nhân AD thu nhận bệnh viện Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh, tách chiết DNA kit Magjet Whole blood DNA, tạo thư viện lai-bắt giữ phân đoạn DNA gen mục tiêu kit New England Biolabs (Mỹ), sau giải trình tự hệ thống giải trình tự hệ Illumina (Mỹ) Kết quả: Trong 101 bệnh nhân AD, có 51 (50,5%) trường hợp khởi phát sớm (EOAD) 50 (49,5%) trường hợp khởi phát muộn (LOAD), độ tuổi khởi phát trung bình bệnh nhân EOAD 57 tuổi LOAD 73 tuổi Ở nhóm EOAD, nghiên cứu ghi nhận có mối liên quan đột biến APP/PSEN1 với bệnh Alzheimer (p=0,03) độ tuổi khởi phát nhóm mang đột biến APP/PSEN1 so với nhóm mang đột biến APOE (p=0,01) Ở thể LOAD, nhóm mang đồng hợp alen APOE e4 có độ tuổi khởi phát sớm so với nhóm mang e4 dị hợp alen APOE nhóm khơng mang alen APOE e4 (p=0,057) Kết luận: Kết cho thấy có mối liên hệ kiểu gen khác độ tuổi khởi phát hai nhóm bệnh Alzheimer Đối với nhóm EOAD, diện biến thể gen APP/PSEN1 làm tăng độ tuổi khởi phát bệnh nhân EOAD Đối với nhóm LOAD, diện đồng hợp alen APOE e4 bệnh nhân thúc đẩy tiến trình khởi phát bệnh sớm so với nhóm mang dị hợp hay khơng mang alen Từ khóa: bệnh Alzheimer (AD), sa sút trí tuệ (SSTT), bệnh Alzheimer khởi phát sớm (EOAD), bệnh Alzheimer khởi phát muộn (LOAD), biến thể, kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) Viện Di truyền Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Thần kinh, Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 3Bộ môn Thần Kinh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thị Tuyết Lan ĐT: 0937130391 Email: lan.mgi@suckhoeditruyen.vn Chuyên Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử 171 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học ABSTRACT INVESTIGATE THE ASSOCIATION BETWEEN GENOTYPE AND PHENOTYPE OF ALZHEIMER DISEASE Nguyen Thi Tuyet Lan, Dang Thi Minh Trang, Do Nong Xuan Mai, Tong Mai Trang, Tran Cong Thang, Phan Ngoc Minh, Giang Hoa, Do Thi Thanh Thuy, Truong Dinh Kiet * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 171-177 Background: Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia, (accounting for 60% - 80%) According to WHO, AD is one of the top five causes of death worldwide It is also a global burden on health as well as on socioeconomic status Currently, biomarkers of AD researches are highly interested, aiming for AD early detection However, what we have done is still modest, and AD is still incurable and difficult to prevent In this study, we perform new generation sequencing on genomic DNA samples from the blood of Vietnamese AD patients to investigate the association between genotype and phenotype The success of the study will provide the proliferation of genotypes related to the early-onset and late-onset Alzheimer's disease, paving the way for extensive research, aiming for early detection for more effective treatment of radicals this disease Objectives: Evaluate the association between genotype - phenotype of Alzheimer's patients in Vietnam using new-generation sequencing (NGS) Method: Blood from Alzheimer patients was collected at University Medical Center HCMC and used to extract genomic DNA with Magjet Whole blood DNA kit, then preparing library and hybridization-capturing DNA fragments of targeted genes using New England Biolabs kit (USA), loading for sequencing in Illumina next-generation sequencing system Results: In 101 Alzheimer patients, there were 51 (50.5%) early-onset cases (EOAD) and 50 (49.5%) lateonset cases (LOAD), the mean age of EOAD patients was 57 years old, and LOAD patients was 73 years old In the EOAD group, the study recorded the association between APP/PSEN1 mutations and Alzheimer’s disease (p=0.03) and between the age of onset of the APP/PSEN1 group with the APOE groups (p = 0.01) Besides, in the LOAD, the group having homozygote APOE e4 alleles had an earlier onset age than those with heterozygous APOE e4 allele and non-APOE e4 allele patients (p=0.057) Conclusion: These results showed a relationship between different genotypes and onset age in the two groups of Alzheimer's disease In the EOAD group, the presence of APP/PSEN1 variants increased the onset age of EOAD patients In the LOAD group, the attendance of the homozygote APOE e4 alleles stimulated the earlier onset age of the disease than the heterozygous or non-allele group Key words: Alzheimer disease (AD), dementia, Early-Onset Alzheimer Disease (EOAD), late-onset Alzheimer disease (LOAD), genetic variants, next-generation sequencing (NGS) sa sút trí tuệ Năm 2019, số người mắc ĐẶT VẤN ĐỀ Alzheimer Mỹ khoảng 5,8 triệu người đến Bệnh Alzheimer (AD) gây thay đổi năm 2050 số tăng lên 14 triệu Chi phí bất thường não, chủ yếu ảnh hưởng đến trí chăm sóc cho bệnh nhân Alzheimer toàn nhớ, giảm nhận thức, rối loạn thời gian không giới năm 2019 ước tính 290 tỉ la Mỹ, dự báo gian, khả trí tuệ khác Theo thống kê bệnh khơng ngăn chặn kiểm sốt, Mỹ năm 2019, 65 giây lại có thêm đến năm 2050 số tăng lên 1,1 nghìn tỉ trường hợp bệnh phát đô la(1) người già tử vong có người chẩn đốn 172 Chun Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử Nghiên cứu Y học Dựa độ tuổi khởi phát, bệnh Alzheimer chia thành hai loại, khởi phát sớm (EOAD) trước 65 tuổi khởi phát muộn (LOAD) sau 65 tuổi Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu AD thực chưa thực quan tâm đến tính chất riêng biệt hai nhóm khởi phát này(2-4) Hiện nay, nghiên cứu gen bệnh nhân Alzheimer mối quan tâm hàng đầu nhờ phát triển kỹ thuật giải trình tự hệ (Next-generation sequencing – NGS), cho phép phân tích đồng thời nhiều gen lúc Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực giải trình tự hệ DNA gen từ mẫu máu ngoại vi bệnh nhân Alzheimer để khảo sát tương quan kiểu gen kiểu hình bệnh Alzheimer Việt Nam Sự thành công nghiên cứu cung cấp phổ biến thể gen liên quan đến thể AD khởi phát sớm muộn, tạo tiền đề cho nghiên cứu mở rộng, hướng đến mục đích phát sớm để điều trị hiệu bệnh ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu máu ngoại biên bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh Alzheimer theo tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn thần kinh nhận thức DSM- thu nhận Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh từ tháng 05/2019 tới tháng 04/2020 Tiêu chuẩn chọn mẫu Bệnh nhân chẩn đoán xác định mắc Alzheimer theo tiêu chuẩn DSM-5; đồng ý tham gia nghiên cứu; khơng truyền máu vịng tháng trước thu nhận mẫu máu cho nghiên cứu; có thơng tin lâm sàng, bệnh mãn tính tiền sử gia đình, kết chụp MRI Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân (BN) không đồng ý tham gia nghiên cứu (NC) Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu cắt ngang Cỡ mẫu Quá trình nghiên cứu thu nhận 101 mẫu máu bệnh nhân Alzheimer Các biến số Độ tuổi khởi phát nhóm đột biến gen APP/PSENs APOE (e4/e4, e4/e_, e_/e_) Tách chiết DNA từ mẫu máu: DNA mẫu máu thu nhận ly trích kit Magjet Whole blood DNA (Thermo Scientific, Đức) phân chia vào tube, lưu trữ -200C thực giải trình tự Chuẩn bị thư viện làm giàu phân mảnh DNA: DNA sau tách chiết sử dụng để tạo thư viện (phân mảnh DNA, chỉnh sửa đầu mút, gắn adaptor, index PCR) kit Ultra II FS library preparation (New Englands Biolab, Mỹ) NEBnext Multiplex Oligos Dual (NEBnext) Qui trình thực theo hướng dẫn kit Sản phẩm phải đạt hàm lượng 500 ng để đảm bảo đủ lượng DNA cho bước Lai bắt giữ gen mục tiêu: Sản phẩm PCR từ bước tạo thư viện tiếp tục lai với hỗn hợp mẫu dò gắn biotin đặc hiệu cho gen mục tiêu Mẫu dò thiết kế dựa trình tự mRNA gen mục tiêu tổng hợp IDTDNA (Mỹ) Sau đó, thơng qua tương tác streptavidin-biotin, sử dụng hạt từ Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (ThermoFisher) để bắt giữ phân mảnh DNA gen mục tiêu Phản ứng lai sử dụng hóa chất thực theo huớng dẫn kit xGen library hybridization (IDTDNA, Mỹ) DNA sau bắt giữ nhân lần PCR để đạt nồng độ cần thiết cho giải trình tự hệ 10 nM Giải trình tự hệ thống giải trình tự hệ NextSeq (Ilumina, Mỹ): Thư viện đạt chuẩn nồng độ 10nM biến tính giải trình tự kit Nextseq 500/550 High Output hệ thống NextSeq 550 (Illumina, Mỹ) Chuyên Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử 173 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Phân tích kết giải trình tự: Dữ liệu giải trình tự lưu gửi lên máy chủ để phân tích kết Kết giải trình tự hệ đạt hàng triệu cặp trình tự DNA có kích thước 75 nucleotit Từng trình tự DNA sau xếp lên gen người chuẩn National Center of Biotechnology Information (NCBI) để xác định vị trí trình tự gen người(5) Vị trí trình tự cặp trình tự cho phép xác định biến đổi xảy vùng gen mục tiêu Phần mềm phân tích xây dựng dựa trình tự vị trí nucleotit để xác định biến đổi di truyền xảy Toàn phần mềm viết dựa phương pháp phân tích tối ưu hố Viện nghiên cứu Broad thuộc Đại học Harvard – Mỹ(6) Kết phân tích ghi nhận biến thể di truyền vùng gen mục tiêu Phân loại biến đổi di truyền: biến thể phát phân loại làm nhóm đột biến: (1) lành tính (benign), (2) gần giống lành tính (likely benign), (3) gây bệnh (pathogenic), (4) gần giống gây bệnh (likely pathogenic) (5) không rõ chức (variant of uncertain significance - VUS) Trong đó, nhóm (1) (2) biến thể khơng làm gia tăng nguy mắc bệnh AD, nhóm (3) (4) lại làm tăng nguy mắc AD thể khởi phát muộn Nhóm (5) biến thể chưa có chứng khoa học đầy đủ việc xác định vai trò biến thể liên quan đến nguy gây bệnh Sự phân loại đột biến dựa sở liệu thông tin lâm sàng biến thể Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học Mỹ (Clinvar database, NCBI, Mỹ) sở liệu đột biến liên quan bệnh Alzheimer (www.alzforum.org) Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Stata® phiên 13.0 (StataCorp Inc., Texas, Hoa Kỳ) 174 Nghiên cứu Y học Thống kê mơ tả: tần số, tỉ lệ %, trung bình ± độ lệch chuẩn, khoảng tin cậy Thống kê phân tích: phép kiểm Chi bình phương, phép kiểm định xác Fisher’s Sự khác biệt xem có ý nghĩa thống kê p