Các dung môi tồn dư được chia làm 3 nhóm: nhóm 1 (các dung môi phải tránh sử dụng, là các dung môi gây ung thư cho người hoặc có khả năng gây ung thư rõ rệt hoặc chất gây độc môi trườn[r]
(1)NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG OBIDOXIME CHLORIDE TỔNG HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU DƯỢC Vũ Ngọc Tốn1*, Nguyễn Minh Trí1, Lê Thị Hằng2, Lưu Quang Minh3
Tóm tắt: Obidoxime chloride thuốc giải độc đặc hiệu hệ thành phần ống tự tiêm giải độc chất độc phospho hữu Obidoxime chloride có lực liên kết với vị trí hoạt động enzyme, loại bỏ phosphorylat obidoxime, đồng thời tái sinh hoạt tính enzyme AChE Obidoxime chloride tổng hợp bằng phản ứng pyridine-4-aldoxime với bis(chloromethyl)ether dung môi chloroform Chất lượng obidoxime chloride sau tổng hợp tinh chế kiểm tra theo Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ (USP 38) Kết cho thấy, hoạt chất obidoxime chloride tổng hợp đáp ứng đầy đủ tiêu chất lượng làm nguyên liệu dược
Từ khóa: Obidoxime chloride; Oxime; Thuốc giải độc đặc hiệu; Phospho hữu cơ; chất độc thần kinh
1 MỞ ĐẦU
Chất độc phospho hữu phát huy tác động gây độc sở bất hoạt enzyme cholinesterase Enzyme có vai trị quan trọng việc thủy phân acetylcholine thành choline, làm chất dẫn truyền xung thần kinh [4, 5, 8] Chất độc phospho hữu sử dụng với hai mục đích làm hóa chất bảo vệ thực vật chất độc thần kinh Hóa chất bảo vệ thực vật họ phospho hữu có độc tính cao, dùng để diệt trừ sâu bệnh, bảo vệ mùa màng [8] Trên giới nước nay, hóa chất bảo vệ thực vật phospho hữu sử dụng phong phú đa dạng Từ năm 1942 đến có 50.000 chất tổng hợp, có khoảng 50 chất dùng phổ biến lĩnh vực nông, lâm nghiệp, [4] Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới, hàng năm có khoảng triệu vụ ngộ độc, có 300.000 người chết nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật
Chất độc thần kinh loại chất độc nguy hiểm số chất độc quân sử dụng chiến tranh đại, hoạt động chủ yếu chất ức chế acetylcholinesterase, gây triệu chứng cholinergic nghiêm trọng [2, 7] Một số chất độc thần kinh nguy hiểm phải kể đến sarin, tabun, soman, VX Trong đó, sarin loại chất độc sử dụng nhiều lịch sử, đặc biệt giai đoạn chiến tranh giới thứ thứ hai gây thương vong cho nhiều người [1, 3, 7] Vụ khủng bố sarin hệ thống tàu điện ngầm Thủ đô Tokyo Nhật Bản năm 1994 1995 [3], vụ ám sát Kim Jong Nam nghi sử dụng chất độc VX vào tháng năm 2017, cho thấy nguy vụ công sử dụng chất độc thần kinh tiềm ẩn
Obidoxime chloride loại thuốc giải độc đặc hiệu hệ nhiễm độc chất độc phospho hữu sử dụng rộng rãi số quốc gia như: Na Uy, Phần Lan, Đức, Hà Lan [5] Obidoxime chloride tổng hợp từ phản ứng pyridine-4-aldoxime với bis(chloromethyl)ether dung môi chloroform nhiệt độ 60 oC 30 phút Trong báo giới thiệu kết đánh giá chất lượng sản phẩm obidoxime chloride sau tổng hợp, tinh chế phương pháp quy định Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ USP 38
2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất
(2)chất tinh khiết khác nhập từ hãng Merck Obidoxime chloride (LUH6.VN) tổng hợp phịng thí nghiệm chúng tơi theo phương pháp nêu
2.2 Đánh giá chất lượng obidoxime chloride
2.2.1 Đánh giá tiêu định lượng
- Chuẩn bị dung dịch điều kiện sắc ký:
+ Chuẩn bị dung dịch thử: Cân lượng xác 10 mg sản phẩm vào bình định mức 100 mL, thêm 80 mL nước, siêu âm đến tan hoàn toàn Thêm nước tới vạch mức, lắc Lọc qua màng lọc cellulose acetate 0,45 µm
+ Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân lượng xác 10 mg obidoxime chloride chuẩn cho vào bình định mức 100 mL, thêm khoảng 80 mL nước, siêu âm đến tan hoàn toàn Thêm nước tới vạch mức, lắc Lọc qua màng cellulose acetate 0,45 µm
+ Điều kiện sắc ký: Cột phân tích C18 (250 x 4,6 mm; µm), nhiệt độ cột 30 oC, pha động acetonitrile:acid phosphoric 0,1 % (30:70), tốc độ dịng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL
+ Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch thử dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ
2.2.2 Đánh giá tiêu nhiệt độ nóng chảy
Chỉ tiêu nhiệt độ nóng chảy xác định theo hướng dẫn nêu Dược điển Việt Nam V Quy trình tiến hành cụ thể sau:
- Nghiền obidoxime chloride thành bột mịn sau làm khô 24 áp suất 1,5 đến 2,5 kPa với chất hút ẩm silicagel tinh khiết, sấy khô 100 - l05 oC
- Cho bột vào ống mao quản, lèn bột cách gõ nhẹ ống mao quản xuống mặt phẳng cứng để có lớp sản phẩm cao 4-6 mm
- Đun nóng bình đựng chất lỏng đến nhiệt độ thấp điểm chảy dự kiến chất thử khoảng 10 oC, điều chỉnh nhiệt độ cho nhiệt độ tăng oC l phút cho nhiệt độ tăng oC l phút thử chất không bền nhiệt
- Khi nhiệt độ đạt thấp điểm chảy dự kiến khoảng oC, lấy nhiệt kế ra, nhanh chóng buộc ống mao quản có sản phẩm vào nhiệt kế, cho lớp sản phẩm ngang với phần bầu thuỷ ngân nhiệt kế Đặt lại nhiệt kế vào bình Nhiệt độ mà nhìn thấy cột chất thử xẹp xuống, so sánh với điểm thành ống, xác định điểm bắt đầu nóng chảy nhiệt độ mà chất thử trở thành chất lỏng hoàn toàn, xác định điểm cuối chảy hay nhiệt độ chảy
2.2.3 Đánh giá tiêu hàm lượng kim loại nặng
Chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng xác định theo DĐVN V sau: - Chuẩn bị dung dịch thử:
+ Lấy xác 2,0 g obidoxime chloride chuyển vào chén nung thạch anh
+ Thêm 4,0 mL dung dịch MgSO4 25 % acid sulfuric 1M (TT) Trộn
một đũa thủy tinh nhỏ đun nóng cẩn thận
(3)+ Tiến hành nung nhiệt độ không 800 oC Để nguội, làm ẩm cắn vài giọt dung dịch acid sulfuric 1M (TT)
+ Bốc hơi, nung lại để nguội Toàn thời gian nung khơng q
+ Hịa tan cắn dung dịch acid hydrochloric 2M (TT) lần, lần dùng mL + Thêm 0,1 mL dung dịch phenolphtalein (TT), cho giọt amoniac (TT) đến có màu hồng
+ Để nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến dung dịch màu thêm dư 0,5 mL Lọc cần, pha loãng dung dịch với nước thành 20 mL
- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Dùng thể tích dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) thay cho chế phẩm Thêm mL dung dịch thử vào dung dịch thu
- Chuẩn bị dung dịch kiểm tra: Dùng lượng chế phẩm lượng dùng để chuẩn bị dung dịch thử thể tích dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) giống thể tích dùng để chuẩn bị dung dịch đối chiếu Thêm mL dung dịch thử vào 10 mL dung dịch thu
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: Hỗn hợp gồm 10 mL nước mL dung dịch thử - Tiến hành: Lấy 12 mL dung dịch trên, thêm mL dung dịch đệm acetat pH 3,5 (TT) Lắc thêm dung dịch thu vào 1,2 mL dung dịch thioacetamide (TT), lắc Quan sát dung dịch sau phút
2.2.4 Đánh giá tiêu giới hạn chloride
Chỉ tiêu giới hạn chloride xác định theo Dược điển Mỹ USP 38 Quy trình tiến hành cụ thể sau:
- Hịa tan xác 300 mg obidoxime chloride 150 mL nước, thêm 20 mL acid acetic băng 10 giọt p-tert-octylphenoxy nonaethoxyethanol chuẩn độ với thuốc thử bạc nitrate 0,1 N, xác định điểm kết thúc Tiến hành tương tự mẫu trắng Mỗi mL thuốc thử bạc nitrate 0,1 N tương ứng với 3545 mg Cl
2.2.5 Đánh giá tiêu dung môi tồn dư
- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: obidoxime chloride tan tốt nước, tiến hành pha dung dịch mẫu thử (1) cách hòa tan 0,2 g mẫu thử nước, pha loãng với nước tới 20,0 mL
- Chuẩn bị dung dịch dung mơi (b): Hịa tan lượng thích hợp dung mơi tồn dư nhóm dimethyl sulfoxide (TT) Pha loãng với nước thành 100,0 mL Tiếp tục pha loãng để thu dung dịch có nồng độ 1/20 giới hạn quy định tạp chất dung môi tồn dư
- Chuẩn bị dung dịch dung mơi (c): Hịa tan 1,0 g dung mơi có mẫu thử với dimethyl sulfoxide, sau pha lỗng thành 100,0 mL Tiếp tục pha loãng để thu dung dịch có nồng độ 1/20 giới hạn quy định Dược điển
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị giống cách chuẩn bị dung dịch dung môi (c) không thêm dung môi cần xác định (để kiểm tra vắng mặt pic nhiễu)
(4)- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (b) (nhóm 2): Lấy 1,0 mL dung dịch dung mơi (b) 5,0 mL chất pha lỗng thích hợp vào lọ đựng mẫu tiêm
- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (c): Lấy 1,0 mL dung dịch dung môi (c) 5,0 mL dung dịch mẫu thử vào lọ đựng mẫu tiêm
- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (d): Lấy 1,0 mL dung dịch mẫu trắng 5,0 mL chất pha lỗng thích hợp vào lọ đựng mẫu tiêm
Lưu ý: đóng kín tất lọ đựng mẫu dung dịch trước sử dụng Lắc để có dung dịch đồng
- Cách tiến hành hệ sắc ký A:
+ Tiêm mL pha dung dịch đối chiếu (b), ghi sắc ký đồ điều kiện cho hệ số phân giải acetonitrile methylen chloride xác định
+ Tiêm mL pha dung dịch thử lên cột phân tích hệ A Nếu sắc ký đồ thu không pic tương ứng với pic dung môi tồn dư sắc ký đồ cho dung dịch đối chiếu (b) mẫu thử đạt yêu cầu
2.2.6 Đánh giá tiêu tạp chất có liên quan - Chuẩn bị dung dịch điều kiện sắc ký:
+ Dung dịch thử: Cân xác 10 mg mẫu thử vào bình định mức 10 mL Thêm mL methanol, siêu âm 15 phút Để nguội định mức đến vạch methanol Lọc dịch qua màng cellulose acetate 0,22 µm thu dịch chạy sắc ký
+ Dung dịch chuẩn: Cân xác mg pyridine-4-aldoxime vào bình định mức 10 mL Hịa tan định mức đến vạch methanol Tiến hành pha loãng với methanol thu dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 50 - 200 ppb
- Điều kiện sắc ký: Cột Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm), Pha động: Kênh A: acid formic 0,1%, kênh B: ACN, tốc độ dịng: 0,3 mL/ phút, thể tích tiêm: 10 µL, nhiệt độ cột: 30 oC
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mẫu chuẩn obidoxime chloride (USP)
Mẫu chuẩn obidoxime chloride nhập hãng Santa Cruz Biotechnology, CAS No 114-90-9 Công thức phân tử C14H16Cl2N4O3, khối lượng phân tử 359,21 g/mol Công
thức cấu tạo obidoxime chloride sau:
N+ N OH
O
N+ N OH
2Cl
(5)Chỉ tiêu chất lượng mẫu chất nhập Bảng
Bảng 1. Chỉ tiêu chất lượng chất chuẩn obidoxime chloride
Chỉ tiêu chất lượng Yêu cầu
1 Ngoại quan Dạng bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy, oC Từ 207 đến 211 Hàm lượng kim loại nặng, %,
không lớn 0,002
4 Dung môi tồn dư Không
5 Hàm lượng chloride, % Từ 19,0 đến 21,0 Định lượng, %, không nhỏ 96,0
3.2 Đánh giá chất lượng obidoxime chloride tổng hợp
3.2.1 Đánh giá tiêu ngoại quan
Ngoại quan sản phẩm obidoxime chloride đánh giá cách quan sát trực tiếp mắt thường Kết cho thấy, sản phẩm thu sau tổng hợp tinh chế dạng bột, màu trắng sáng
3.2.2 Đánh giá tiêu nhiệt độ nóng chảy
Ghi nhiệt độ nóng chảy phương pháp đơn giản thuận tiện để kiểm tra độ tinh khiết hợp chất Nếu nhiệt độ nóng chảy giới hạn quy định Dược điển, cho thấy, sản phẩm có độ tinh khiết cao Nhiệt độ nóng chảy thực tế đo PTN mẫu obidoxime chloride 207 - 211oC Kết cho thấy, nhiệt độ nóng chảy mẫu thử trùng khớp với vùng nhiệt độ nóng chảy mẫu chuẩn
3.2.3 Đánh giá tiêu hàm lượng kim loại nặng
Các kim loại nặng cho độc hại có ảnh hưởng bất lợi trình trao đổi chất thể Dược điển Việt Nam V Dược điển hành quy định cụ thể hàm lượng kim loại nặng cho phép có mặt loại thuốc lưu hành
Tiến hành xác định hàm lượng kim loại nặng theo quy trình nêu cần lưu ý, sử dụng natri sulfide thay cho thioacetamide (tác nhân thường sử dụng) Tính thích hợp phép thử cần phải quan tâm, dung dịch đối chiếu phải có màu nâu nhạt so sánh với dung dịch mẫu trắng dung dịch kiểm tra phải có màu đậm màu dung dịch đối chiếu
Cách đánh giá kết quả: Màu nâu dung dịch thử (nếu có) khơng đậm màu dung dịch đối chiếu Nếu khó đánh giá kết quả, lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetate 0,45 µm khơng có dẫn cụ thể khác Tiến hành lọc chậm với áp lực lên piston nhẹ nhàng liên tục, sau đó, so sánh màu sắc vết màng lọc thu từ dung dịch
Kết kiểm tra cho thấy, màu sắc dung dịch thử nhạt màu so với màu sắc dung dịch chì chuẩn Điều có nghĩa, hàm lượng kim loại nặng có mẫu chất tổng hợp khơng vượt q mức 0,002 %
3.2.4 Đánh giá tiêu dung môi tồn dư
(6)trên động vật, khơng độc cho gen tác nhân gây độc khơng hồi phục độc tính thần kinh gây qi thai), nhóm (các dung mơi có độc tính thấp người, khơng cần xác định liều gây tác hại cho sức khỏe)
Quá trình tổng hợp obidoxime chloride chúng tơi có sử dụng dung môi chloroform, ethanol, acetone diethyl ether Trong số dung mơi sử dụng có chloroform thuộc dung mơi nhóm (hạn chế sử dụng), cịn dung mơi khác thuộc nhóm (độc tính thấp) Đối với chloroform, sử dụng phương pháp sắc ký khí để xác định Trên sắc ký đồ dung mơi nhóm phân tích hệ thống A theo quy trình cho kết thời gian lưu chloroform xuất 7,5 phút Sắc ký đồ mẫu thử obidoxime chloride khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với chloroform, chứng tỏ mẫu thử không chứa dung môi tồn dư
Đối với dung môi nhóm 3, dùng phương pháp khối lượng làm khô, kết cho thấy mẫu thử khối lượng < 0,5 %
3.2.5 Đánh giá tiêu hàm lượng chloride
Con đường tổng hợp obidoxime chloride sử dụng tác nhân bis(chloromethyl)ether, nguồn phát sinh chloride sản phẩm Hơn nữa, sản phẩm thu tồn dạng muối chloride, việc xác định hàm lượng chloride có sản phẩm cần thiết Việc hàm lượng vượt giới hạn cho phép yêu cầu phải kiểm tra lại nguyên liệu đầu vào xem xét lại trình tổng hợp Hàm lượng chloride xác định phương pháp chuẩn độ với bạc nitrate môi trường (p-tert-octylphenoxy)nonaethoxyethanol Kết cho thấy, hàm lượng chloride 20,52 %, nằm giới hạn quy định (19,0-21,0 %)
3.2.6 Đánh giá tiêu định lượng
Mẫu obidoxime chloride nhập ngoại hãng Santa Cruz Biotechnology, độ tinh khiết 98,0 % Diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn 3021 uV 3122 uV thời gian lưu phút Hàm lượng obidoxime chloride C14H16Cl2N4O3 có sản phẩm
được tính tốn theo cơng thức sau: (%) = × ×% ×
Trong đó: ET diện tích pic dung dịch thử; ES diện tích pic dung dịch chuẩn;
MS, MT khối lượng mẫu chuẩn mẫu thử; % S hàm lượng chất chuẩn
Vậy, (%) = × × , × = 96,62 (đáp ứng tiêu định lượng)
(7)3.2.7 Đánh giá tiêu tạp chất liên quan
Tạp chất phân chia làm nhóm chính: tạp chất hữu cơ, tạp chất vô dung môi tồn dư Tạp chất hữu tăng q trình sản xuất và/hoặc q trình bảo quản, nhận diện nhận diện, bay không bay hơi, bao gồm: nguyên liệu đầu, sản phẩm phụ, chất trung gian, sản phẩm phân hủy, thuốc thử, phối tử, xúc tác,… Tạp chất vơ tăng q trình sản xuất, chúng thường nhận diện bao gồm: thuốc thử, phối tử, xúc tác, kim loại nặng, muối vo cơ, than hoạt tính, giấy lọc,… Dung mơi tồn dư dung môi hữu vô sử dụng trình tổng hợp Phần tập trung vào tạp chất dạng hữu cơ, đặc biệt nguyên liệu đầu pyridine-4-aldoxime Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) để đánh giá tiêu tạp chất liên quan Chương trình gradient:
Thời gian (phút) - 2 - 4 - 5 - 6,5
%ACN 10 - 60 60 60 - 10 10
Điều kiện khối phổ: chế độ ESI+, SIM với ion mẹ [M+H]+ có m/z 123 Sắc ký đồ mẫu thử thu sau:
Hình 2. Sắc ký đồ HPLC dung dịch mẫu thử
Tạp chất pyridine-4-aldoxime xuất sắc ký đồ với tỷ lệ hàm lượng 0,004 % < 0,005 %
4 KẾT LUẬN
Obidoxime chloride tổng hợp thành công phản ứng pyridine-4-aldoxime với bis(chloromethyl)ether dung môi chloroform nhiệt độ 60 oC với thời gian 30 phút điều kiện thực tiễn phòng thí nghiệm Viện Hóa học- Vật liệu Sản phẩm obidoxime chloride sau tổng hợp, tinh chế đánh giá tiêu chất lượng theo phương pháp nêu Dược điển Việt Nam V Dược điển Mỹ USP 38 Kết cho thấy, sản phẩm obidoxime chloride tổng hợp phương pháp nêu đáp ứng đầy đủ tiêu chất lượng theo Dược điển, sử dụng làm nguyên liệu dược Trên sở kết tiếp tục tiến hành nghiên cứu đánh giá độ ổn định hiệu tái tạo hoạt tính enzyme AChE sau bất hoạt chất độc phospho hữu theo quy trình công bố
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 17500000