NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LAN TRUYỀN VI RÚTTỪ RỆP SÁP (Ferrisia virgata) ĐẾN CÂY TIÊU(Piper nigrum L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LAN TRUYỀN VI RÚT TỪ RỆP SÁP (Ferrisia virgata) ĐẾN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: HỒ NGỌC HÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LAN TRUYỀN VI RÚT TỪ RỆP SÁP (Ferrisia virgata) ĐẾN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực ThS NGUYỄN THỊ KIM LINH HỒ NGỌC HÂN TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập vừa qua Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tồn thể anh chị Trung Tâm tạo điều kiện thuận lợi tận tình giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp TS Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài ThS Nguyễn Thị Kim Linh tận tình hướng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài, hết lòng giúp đỡ, động viên em lúc khó khăn KS Nguyễn Văn Lẫm tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trình làm đề tài Trung Tâm Các bạn lớp Nông học K29 Trại thực nghiệm khoa Nông học giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K29 đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ Cha mẹ người thân chỗ dựa vững tinh thần vật chất cho TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2007 Hồ Ngọc Hân iii SUMMARY Title “STUDY THE TRANSMISSION OF VIRUS FROM MEALYBUG (Ferrisia virgata) TO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.)” was carried out at Experimental Site of Agronomy Department, Chemical and Biological Analysis and Experiment Center, Nong Lam University, Ho Chi Minh City from March to August, 2007 Viet Nam is one of the country that has exported black pepper in the highest amout in recent years However, almost black pepper plants on over the country have been attacked by virus, nematode, fungi, bacteria, pest causing yield and quality reduction Among them, virus was a causal agent of diseases Virus induces chlorotic mottling, mosaic, leaf distortion, reduced plants vigor Therefore, it was very necessary to identify virus transmitting vector to black pepper Contents of this research: Cut and propagate black pepper plantlets Raise virus-free mealybugs on pumplein plants for generations, then raise on diseased and healthy black pepper plants Use Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction (RT – PCR) method to identify the presence of virus in black pepper The times a day spray scheme bring the highest percentage of survival rate of cutting With the diseased-symptoms, mealybug (Ferrisia virgata) is vector transmitting virus in black pepper plants iv TĨM TẮT HỒ NGỌC HÂN, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 8/2007 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LAN TRUYỀN VI RÚT TỪ RỆP SÁP (Ferrisia virgata) ĐẾN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.)” Đề tài thực Trại Thực Nghiệm khoa Nông Học Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh, từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ KIM LINH TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Nước ta dẫn đầu sản lượng tiêu xuất khẩu, thu nguồn ngoại tệ đáng kể Tuy nhiên năm gần đây, tiêu bị nhiều mầm bệnh công vi rút, vi khuẩn, nấm, tuyến trùng, trùng; vi rút mầm bệnh nguy hiểm Bệnh vi rút làm cho tiêu có triệu chứng đốm úa vàng, khảm, méo mó, làm giảm suất sức sống Vì vậy, việc tìm tác nhân lan truyền vi rút cho tiêu vô cấp thiết Chúng tiến hành giâm cành tiêu bệnh, nuôi rệp sáp sử dụng phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định rệp sáp có phải tác nhân lan truyền vi rút cho tiêu không Nội dung nghiên cứu: Khảo sát ảnh hưởng chế độ tưới nước đến khả sinh trưởng phát triển tiêu giâm cành Khảo sát tỉ lệ tiêu khỏe có triệu chứng vi rút sau chủng rệp từ tiêu bị nhiễm virút Kiểm tra nhiễm vi rút tiêu khỏe kỹ thuật RT – PCR Chế độ tưới dạng phun sương lần/ngày có tỉ lệ cành giâm sống cao Mật độ rệp nuôi tiêu khỏe 70 thời gian nuôi 30 ngày cho tỉ lệ có triệu chứng vi rút cao Rệp sáp (Ferrisia virgata) tác nhân lan truyền vi rút cho tiêu v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Summary iv Tóm tắt v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tiêu 2.1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển 2.1.2 Đặc tính thực vật học 2.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ 2.1.3.1 Thế giới 2.1.3.2 Việt Nam 2.1.4 Một số bệnh thường gặp tiêu 2.1.4.1 Bệnh thối gốc, thối rễ 2.1.4.2 Bệnh tuyến trùng 2.1.4.3 Bệnh khô đầu thối trái 2.1.4.4 Bệnh vằn 2.2 Sơ lược bệnh virút hại tiêu 2.2.1 Các tác nhân lan truyền vi rút cho tiêu vi 2.2.1.1 Sự lan truyền vi rút không nhờ môi giới 2.2.1.2 Sự lan truyền vi rút nhờ môi giới 2.2.2 Các nghiên cứu nước 2.2.3 Các nghiên cứu nước 2.2.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh vi rút 2.2.4.1 Phương pháp chẩn đốn ngồi đồng ruộng 2.2.4.2 Phương pháp thị 2.2.4.3 Phương pháp chẩn đốn kính hiển vi điện tử 10 2.2.4.4 Phương pháp ELISA 10 2.2.4.5 Kỹ thuật PCR 10 2.2.4.6 Kỹ thuật RT – PCR 10 2.2.4 Một số kết chuẩn đoán 10 2.3 Tổng quan rệp sáp Ferrisia virgata 12 2.3.1 Phân bố 12 2.3.2 Kí chủ 12 2.3.3 Một số đặc điểm hình thái gây hại 12 2.3.4 Thiên địch 13 2.3.5 Phòng trị 13 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 14 3.2.1 Trại thực nghiệm 14 3.2.2 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm 14 3.3 Vật liệu thí nghiệm 14 3.4 Phương pháp thí nghiệm 14 3.4.1 Giâm cành tiêu 14 3.4.2 Nuôi rệp sáp 16 3.4.2.1 Trồng bí ni rệp bí 16 3.4.2.3 Nuôi rệp tiêu khỏe 17 vii 3.4.3 Kiểm tra nhiễm vi rút tiêu khỏe 18 3.4.3.1 Ly trích RNA 18 3.4.3.2 Khuếch đại RT – PCR 19 3.4.3.3 Phương pháp đổ gel agarose điện di 23 3.5 Phân tích thống kê 23 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Ảnh hưởng chế độ nước tưới 25 4.2 Sự nhiễm bệnh tiêu khỏe 30 4.3 Kết kiểm tra nhiễm vi rút tiêu khỏe 36 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay PCR Polymerase chain reaction RT – PCR Reverse Transciptase - Polymerase Chain Reaction PYMV Piper yellow mottle virus CMV Cucumber mosaic virus BSV Banana streak virus ScBV Sugarcane bacilliform virus ISEM Immunosorbent electron microscopy Ctv Cộng tác viên Tm Melting temperature cDNA Complementary deoxynucleic acid DNA Deoxynucleic acid RNA Ribose nucleic acid dNTP Deoxy nucleotide triphosphate NAA α- naphthaleneneacetic acid DEPC Diethyl pyrodicarbonate RNAbc RNA binding column PVP Polyvinylpyrolydol UV Ultra violet ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm giâm cành 15 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm thả rệp lên tiêu khỏe 17 Bảng 3.3 Các biến đổi thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) cành giâm sống 25 Bảng 4.2 Số chiều cao chồi 26 Bảng 4.3 Số rễ chiều dài rễ 27 Bảng 4.6 Tỉ lệ (%) tiêu khỏe nhiễm bệnh 31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng mật độ rệp đến tiêu khỏe 31 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian thả rệp đến tiêu khỏe 32 Bảng 4.6 Các triệu chứng nhiễm vi rút 33 Bảng 4.7 Tỉ lệ (%) nhiễm vi rút theo triệu chứng 33 x 34 (a) (b) Hình 4.5 Rệp sáp sinh trƣởng phát triển bí ngày tuổi tiêu khoẻ tháng tuổi (a) bí ngày tuổi, (b) tiêu khoẻ tháng tuổi (a) (b) (b) (c) (d) Hình 4.6 Cây tiêu bệnh điều kiện tự nhiên tiêu bệnh sau đƣợc nuôi rệp với số rệp nuôi thời gian nuôi khác (a) bệnh điều kiện tự nhiên, (b) bệnh nuôi 30 rệp 10 ngày, (c) bệnh nuôi 50 rệp 20 ngày, (d) bệnh nuôi 70 rệp 30 ngày 35 (a) (c) (d) Hình 4.7 Các triệu chứng nhiễm vi rút nhận thấy tiêu khỏe sau nuôi rệp (a) đốm hoa lá, (b) nhăn phiến lá, (c) xoăn mép lá, (d) khảm vàng Kết thí nghiệm giống với kết nhiều nghiên cứu nước Nghiên cứu Lockhart ctv (1997) cho thấy sau – tuần thả rệp (Planococcus citri), tiêu có triệu chứng đốm vàng, chứng tỏ có diện vi rút PYMV Planococcus citri tác nhân lây truyền vi rút cho tiêu khỏe nhiều nước Đông Nam Á Tương tự, nghiên cứu Bhat ctv (2003) cho thấy sau tuần thả rệp (Ferrisia virgata), tiêu có triệu chứng đốm vàng khắp bề mặt điều chứng tỏ Ferrisia virgata tác nhân lây truyền vi rút cho tiêu khoẻ mạnh Ấn Độ Như vậy, với triệu chứng bệnh nhận thấy tiêu khỏe 36 sau ni rệp kết luận rệp sáp (Ferrisia virgata) tác nhân lây truyền vi rút cho tiêu Vĩnh Linh Việt Nam 4.3 Kết kiểm tra nhiễm vi rút tiêu khỏe sau đƣợc nuôi rệp bệnh kỹ thuật RT – PCR Đa số tiêu khỏe sau ni rệp bệnh có triệu chứng vi rút Chúng lấy mẫu bệnh đem ly trích RNA để thực phản ứng RT – PCR tiến hành hai lần ly trích Lần thứ ly trích mẫu tương ứng với triệu chứng: đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoăn mép lá, khảm vàng kí hiệu là: H1, H2, H3, H4 Lần thứ hai ly trích mẫu tương ứng với triệu chứng: đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoăn mép kí hiệu là: L 1, L2, L3 Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi chu trình nhiệt thay đổi nồng độ hoá chất phản ứng PCR kết PCR dựa vào cặp mồi (BADNA + BADNA 4’) Meyer JB (2005) không đạt mong đợi Ở lần RT – PCR đầu tiên, thực phản ứng với mẫu H 1, H2, H3, H4 Kết khơng có sản phẩm tạo Vậy phản ứng PCR khơng xảy Điều nhiệt độ bắt cặp cao nên cần hạ nhiệt độ bắt cặp xuống Khi điện di sản phẩm PCR lần 2, lần 3, lần 4: hạ nhiệt độ bắt cặp o o o xuống 54 C, 53 C 50 C kết khơng có sản phẩm tạo Giả thuyết nhiệt độ bắt cặp không hợp lý mà lần ly trích mẫu nên thao tác yếu, làm mẫu bị phân hủy RNase khơng khí dẫn đến khơng ly trích RNA vi rút chu trình nhiệt đưa lúc đầu chưa thích hợp Khi tiến hành phản ứng RT – PCR với mẫu khác: L 1, L2, L3 theo chu trình nhiệt Meyer JB (2005) nhiệt độ bắt cặp khác nhau, đồng thời tăng lượng mẫu DNA qua reverse lên 2,5 lần kết khơng thu sản phẩm Như vậy, giả thuyết khơng ly trích RNA vi rút lẫn giả thuyết chu trình nhiệt chưa thích hợp không hợp lý Việc tăng lượng DNA qua reverse đưa vào phản ứng PCR làm tăng nhân tố ức chế phản ứng PCR Chúng thử nghiệm tăng nhiệt độ biến tính thời gian biến tính lên, thực phản ứng PCR nhiệt độ bắt cặp khác 37 không đạt kết Có thể q trình gia nhiệt để biến tính vi rút, thành tế bào vi rút bị phá vỡ RNA vi rút thoát ngồi Tuy thay đổi chu trình nhiệt, tăng lượng DNA qua reverse sử dụng mẫu ly trích khác phản ứng PCR khơng xảy ra, nồng độ hố chất phản ứng PCR thấp nên chưa khuyếch đại hết đoạn DNA Chúng tăng nồng độ Taq polymerase (Taq công ty Biorad sản o xuất) lên 1,5 unit tiến hành phản ứng với nhiệt độ bắt cặp 50 C, kết khơng có băng DNA đích gel điện di Khi tăng nồng độ MgCl lên 2mM (sử dụng Taq công ty Promega) thấy giếng số chứa mẫu L có băng mờ, hai giếng chứa cDNA giếng khác khơng có sản phẩm Chúng tiến hành lại phản ứng PCR cho mẫu L điện di với sản phẩm PCR thực vật có kích thước 450 bp Kết giếng số chứa mẫu L có băng Dù điện di đến 10 µl mẫu băng khơng rõ, DNA tiêu (hình 4.8) Mặt khác, thay Taq polymerase công ty Promega sản xuất Taq polymerase cơng ty Fermentas giếng chứa mẫu L khơng cho kết Vì vậy, cho băng hai lần điện di sản phẩm H1 H3 L3 L1 cDNA (a) L3 ĐC (b) Hình 4.8 Kết điện di mẫu L3 mẫu khác thực phản ứng PCR lần 12 lần 13 (a) kết lần 12, (b) kết lần 13 38 Khi so sánh với kết nghiên cứu Lockhart ctv (1997), chúng tơi nhận thấy có khác biệt Kết PCR ông cho sản phẩm 450 bp khẳng định có diện vi rút tiêu ông sử dụng cặp mồi khác (BADNA + MYS 3’) Có thể điểm khác biệt nên qui trình kiểm tra vi rút cho kết mong muốn Tóm lại, kết điện di sản phẩm sau lần chạy PCR không mong đợi nhiều nguyên nhân: Có thể lượng RNA vi rút ly trích từ mẫu có triệu chứng bệnh q nên hàm lượng cDNA tạo thấp dẫn đến xác suất hút để chạy PCR thấp khơng có Primer bị hoạt tính đơng lạnh rã đơng nhiều lần để thực phản ứng Lượng cDNA bị giảm xuống theo thời gian Máy PCR khác ảnh hưởng đến phản ứng PCR máy có nhiệt độ lên xuống theo chu kỳ nhiệt khác Taq polymerase khác ảnh hưởng đến phản ứng PCR Quy trình phản ứng PCR chưa ổn định 39 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết đạt được, rút kết luận sau: Trong công tác giâm cành tiêu, chế độ tưới nước dạng phun sương lần/ngày đạt hiệu cao Rệp sáp (Ferrisia virgata) tác nhân lan truyền vi rút cho tiêu khỏe Số rệp nuôi tiêu khỏe 70 thời gian ni 30 ngày cho tỉ lệ có triệu chứng đốm hoa cao 5.2 Đề nghị Lắp đặt hệ thống tưới phun sương tự động có cài đặt sẵn thời gian cho tiêu giâm cành nhằm hạn chế thời gian công sức tưới Cần nghiên cứu nhiều để hồn thiện qui trình kiểm tra vi rút tiêu kỹ thuật RT – PCR Không thực phản ứng RT – PCR với PCR thường mà thực Nested PCR (PCR lần với cặp primer) thực Multiplex PCR 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn An Dương, 2001 Trồng tiêu Nhà xuất Nông Nghiệp, TP.HCM 46 trang Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005 Sinh học phân tử, tái lần thứ Nhà xuất giáo dục, trang 190 – 198, 200 – 206 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử Giới thiệu ứng dụng Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, trang 87 – 98 Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề, 1999 Bệnh Vi khuẩn Virus hại trồng Nhà xuất Giáo Dục, trang 143 Đinh Vũ Thắng, 2006 Bước đầu tạo tiêu (piper nirgum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp Khóa luận tốt nghiệp Ngành Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Phan Đức Sơn, 2003 Nghiên cứu bệnh vi rút hồ tiêu số tỉnh phía Nam kỹ thuật Elisa Khóa luận tốt nghiệp cao học Khoa Nơng học, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Lê Minh Tâm, 2004 Nghiên cứu sâu hại thiên địch chúng khảo sát hiệu phòng trị sâu hại số biện pháp mãng cầu Xiêm huyện Bình Chánh TP Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp cao học Khoa Nơng học, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Ngân Trang, 2005 Xác định vi rút gây bệnh hồ tiêu phương pháp chủng bệnh thị Khóa luận tốt nghiệp Khoa Nơng học, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đình Trường, 2005 Nghiên cứu trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) ớt kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đốn kỹ thuật RT – PCR Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10 Anandaraj M, 2000 Diseases of black pepper In Ravindran, P.N (Ed), Black pepper Piper nigrum Harwood Academic Publisher 41 11 Bhat AI, Devasahayam S, Sarma YR, Pant RP, 2003 Association of a badnavirus in black pepper (Piper nigrum L.) transmitted by mealybug (Ferrisia virgata) in Indian Division of Crop Protection, Division of Plant Pathology, Indian Agricutural Research Institute, Indian 12 Duarte MRL and Albuquerque FC, 1991 Diseases of black pepper National Research Center for Spices, Calicut, pp 13 – 28 13 Holliday P, 1959 Suspected virus in black pepper Commonwealth Phytopathological News 5, 49 – 52 14 Johri JK, Srivastava KM, Raizada RK, Deshpande AL and Singh BP, 1990 Isolation and purification of a virus infecting Piper betle Indian Phytopathology 43: 491 – 495 15 Kueh KT and Liang SS, 1992 Occurrence and Management of wrinkled-leaf disease of black pepper Proe The International Workshop of black pepper Disease Bandarlampung, Indonesia: 227 – 232 16 Lockhart BEL, Kiratiya-Angul K, Jones P, Eng L, De Silva P, Olszewski NE, Lockhart N, Deema N, Sangalang J, 1997 Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug-transmitted badnavirus infecting Piper spp in Southeast Asia European journal of plant pathology 103 : 303-311 17 Meyer JB, 2005 Banana streak badnavirus (BSV) in South Africa: incidence, transmission and the development of an antibody based detection system University of Pretoria 13, 49-131 18 Prakasam V, Subbaraja KT, Bhak thavasalu CM, 1990 Mosaic disease – a new record in black pepper in lower palneys Indian Cocoa, Arecanut and Spice Journal 13, 104 19 Ravindran PN, 2000 Black pepper – Piper nigrum Harwood Academic Publishers 553 trang 20 Sitepu D and Kasim R, 1991 Diseases of black pepper National Research Center for Spices, Calicut, pp 39 – 54 21 de Sliva DPP, 1996 Studies of black pepper (Piper nigrum L.) virus disease in Sri Lanka Reading, UK 42 22 de Silva DPP Dharmadasa M, 1997 Screening black pepper vines against Piper yellow mottle virus by PCR and adoption of dot – blot hybridization technique for mass scale screening of black pepper plants Export Agriculture Research Station, Sri Lanka 23 de Sliva DPP, Jones P, Shaw MW, 2002 Indentification and transmission of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum) in Sri Lanka Plant Pathology Division, Export Agriculture Research Station, Sri Lanka 24 Sarma YR, Kiranmai G, Sreenivasulu P, Anandaraj M, Hema M, Venkatramana M, Murthy AK, Reddy DVR, 2001 Partial characterization and indentification of a virus associated with stunt disease of black pepper (Piper nigrum) in South Indian Indian Institute of Spikes Research, Indian PHỤ LỤC Phục lục One-Way Analysis of Variance for TILESONG.10ngay -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups Within groups 1525926 4200000 51 0762963 0082353 9.265 0004 Total (corrected) 5725926 53 Multiple range analysis for TILESONG.10ngay by TILESONG.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups T2 18 8222222 X T1 18 8444444 X T3 18 9444444 X contrast T1 - T2 T1 - T3 T2 - T3 difference 0.02222 -0.10000 -0.12222 +/- limits 0.06074 0.06074 * 0.06074 * One-Way Analysis of Variance for TILESONG.20ngay -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups Within groups 1837037 4311111 51 0918519 0084532 10.866 0001 Total (corrected) 6148148 53 Multiple range analysis for TILESONG.20ngay kq by TILESONG.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups T2 T1 T3 18 18 18 8000000 8222222 9333333 X X X contrast T1 - T2 T1 - T3 T2 - T3 difference 0.02222 -0.11111 -0.13333 +/- limits 0.06154 0.06154 * 0.06154 * One-Way Analysis of Variance for TILESONG.30ngay -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups Within groups 1900000 4450000 51 0950000 0087255 10.888 0001 Total (corrected) 6350000 53 Multiple range analysis for TILESONG.30ngay by TILESONG.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups T2 T1 T3 18 18 18 8000000 8166667 9333333 X X X contrast T1 - T2 T1 - T3 T2 - T3 difference 0.01667 -0.11667 -0.13333 +/- limits 0.06252 0.06252 * 0.06252 * One-Way Analysis of Variance for TILESONG.40ngay -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups Within groups 1900000 4450000 51 0950000 0087255 10.888 0001 Total (corrected) 6350000 53 Multiple range analysis for TILESONG.40ngay by TILESONG.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups T2 T1 T3 18 18 18 8000000 8166667 9333333 X X X contrast T1 - T2 T1 - T3 T2 - T3 difference 0.01667 -0.11667 -0.13333 +/- limits 0.06252 0.06252 * 0.06252 * One-Way Analysis of Variance for TILESONG.la -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 2.0070370 1.0035185 25.302 0000 Within groups 2.0227778 51 0396623 TOTAL (CORRECTED) 4.0298148 53 Multiple range analysis for TILESONG.la by TILESONG.tuoi Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 18 18 18 1.5611111 1.8000000 2.0333333 X X X contrast difference +/limits - 0.23889 0.13330 * - -0.23333 0.13330 * - -0.47222 0.13330 * - One-Way Analysis of Variance for TILESONG.cao -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 1.5120481 7560241 10.223 0002 Within groups 3.7716278 51 0739535 -TOTAL (CORRECTED) 5.2836759 53 -Multiple range analysis for TILESONG.kq by TILESONG.tuoi -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -4 18 3.0150000 X 18 3.1700000 X 18 3.4211111 X -contrast difference +/limits - 0.15500 0.18202 - -0.25111 0.18202 * - -0.40611 0.18202 * -One-Way Analysis of Variance for TILESONG.re -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 17.455926 8.7279630 7.919 0010 Within groups 56.211667 51 1.1021895 TOTAL (CORRECTED) 73.667593 53 -Multiple range analysis for TILESONG.re by TILESONG.tuoi -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -4 18 8.977778 X 18 9.277778 X 18 10.305556 X -contrast difference +/limits - 0.30000 0.70272 - -1.02778 0.70272 * - -1.32778 0.70272 * -One-Way Analysis of Variance for TILESONG.dai -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 87.347011 43.673506 45.798 0000 Within groups 48.633922 51 9536063 -TOTAL (CORRECTED) 135.98093 53 Multiple range analysis for TILESONG.kq by TILESONG.tuoi Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 18 18 18 5.6427778 5.9166667 8.4672222 X X X contrast - - - difference 0.27389 -2.55056 -2.82444 +/- limits 0.65364 0.65364 * 0.65364 * Phục lục Analysis of Variance for TN2.kq - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:TN2.sorep B:TN2.tgian INTERACTIONS AB RESIDUAL 5304704 2278481 2 2652352 1139241 14.099 6.056 0000 0047 0032407 8.10185E-004 043 9964 8465667 45 0188126 TOTAL (CORRECTED) 1.6081259 53 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Table of Least Squares Means for TN2.kq Level Count Average Stnd Error 95% Confidence for mean GRAND MEAN A:TN2.sorep 30 50 70 B:TN2.tgian 10 20 30 AB 30 10 30 20 30 30 50 10 50 20 50 30 70 10 70 20 70 30 54 5929630 0186650 5553611 6305648 18 18 18 4716667 5927778 7144444 0323287 0323287 0323287 4065384 5276495 6493162 5367949 6579060 7795727 18 18 18 5183333 5838889 6766667 0323287 0323287 0323287 4532051 5187606 6115384 5834616 6490171 7417949 6 6 6 6 3866667 4716667 5566667 5283333 5833333 6666667 6400000 6966667 8066667 0559949 0559949 0559949 0559949 0559949 0559949 0559949 0559949 0559949 2738612 3588612 4438612 4155279 4705279 5538612 5271945 5838612 6938612 4994721 5844721 6694721 6411388 6961388 7794721 7528055 8094721 9194721 Multiple range analysis for TN2.kq by TN2.sorep -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 30 50 70 18 18 18 4716667 5927778 7144444 X X X contrast 30 - 50 30 - 70 50 - 70 difference -0.12111 -0.24278 -0.12167 +/- limits 0.09211 * 0.09211 * 0.09211 * * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for TN2.kq by TN2.tgian -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 10 20 30 18 18 18 5183333 5838889 6766667 X X X contrast 10 - 20 10 - 30 20 - 30 difference -0.06556 -0.15833 -0.09278 +/- limits 0.09211 0.09211 * 0.09211 * * denotes a statistically significant difference Phụ lục Kit ly trích RNA