Đang tải... (xem toàn văn)
Synthesis of Tio 2 Nanofluid by The Sol – Gel Method and Its Applications in the Tobacco Mosaic Virus Prevention.. ABSTRACT.[r]
(1)J Sci & Devel., Vol 11, No 6: 790-796 Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 6: 790-796 www.hua.edu.vn
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ DUNG DỊCH NANO TiO2
VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM TRỪ TOBACCO MOSAIC VIRUS (TMV) Đồng Huy Giới1*, Đàm Thị Phương1, Chu Hoàng Hà2, Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn2
1Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; 2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
Email*: dhgioi@hua.edu.vn
Ngày gửi bài: 15.07.2013 Ngày chấp nhận: 26.09.2013
TÓM TẮT
Nano titan dioxide (nano TiO2) loại nano sử dụng nhiều
lĩnh vực công nghệ sinh học nano Nghiên cứu tiến hành với mục đích điều chế dung dịch nano TiO2
từ chất Ti(OC4H9)4 (Tetrabutylorthotitanate) phương pháp sol-gel ứng dụng phòng trừ bệnh virus
thực vật Kết quảđã tạo dung dịch nano TiO2 có màu trắng trong, khả phân tán tốt Hình ảnh quan sát kính hiển vi điện tử quét cho thấy kích thước hạt nano TiO2 dao động khoảng 15 đến 50nm
Kết thử nghiệm thuốc cho thấy, dung dịch nano TiO2được điều chế có khả ức chế phát triển
và biểu triệu chứng bệnh virus TMV
Từ khóa: Nano TiO2,virus TMV, kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Synthesis of Tio2 Nanofluid by The Sol – Gel Method and Its Applications in the Tobacco Mosaic Virus Prevention
ABSTRACT
The titanium dioxide nanoparticle (TiO2 nano) has been being one of the most employed amongst the different
nanoparticles in the fields of nanobiotechnology The study was conducted with the purpose of preparing nano TiO2
solution from Ti(OC4H9)4 (Tetrabutylorthotitanate) by sol-gel method and its application in preventing viral diseases in
plants The study created nano TiO2 solution having transparant-white color and good dispersal Images observed in
a scanning electron microscope showed that the size of the TiO2 nanoparticles is in the range of 15 to 50nm Test
results on the tobacco plant showed that nano TiO2 solution prepared by us are capable of inhibiting the development
and symptoms of TMV
Keywords: TiO2 nano, tobacco mosaic virus, scanning electron microscopy (SEM)
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Vật liệu nano (Nano materials) lĩnh vực nghiên cứu quan tâm thời gian gần Với kích thước nhỏ bé, vật liệu nano xuất nhiều tính chất đặc biệt tính chất quang điện, quang xúc tác, tính siêu thấm nước, hoạt tính xúc tác cao… (Duan Y et al, 2010; Yu and Xie, 2012)
Titan dioxide (TiO2) oxide kim loại
bán dẫn thơng dụng có tính chất lý hóa đặc biệt có độ bền cao, thân
thiện với mơi trường Nano TiO2 có nhiều ứng dụng lĩnh vực quang xúc tác, pin mặt trời, vi điện tử, điện hóa học, y học (Ngơ Huỳnh Bửu Trọng, Võ Văn Hồng, 2012) Đặc biệt thời gian gần đây, nano TiO2 ý nhiều khả làm
bất hoạt virus Một số nghiên cứu nano TiO2 có khả kháng số loại
vi khuẩn virus gây bệnh virus cúm, virus viêm gan B (Yu and Xie, 2012)
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng, nano TiO2
(2)Đồng Huy Giới, Đàm Thị Phương, Chu Hoàng Hà, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn
khác phương pháp bắn phá ion (sputtering); phương pháp tán, nghiền; phương pháp ăn mòn quang điện; phương pháp lắng
đọng pha hóa học (CVD – Chemical vapor deposition); phương pháp sol-gel Trong phương pháp kể phương pháp sol-gel phương pháp sử dụng phổ biến Ưu điểm phương pháp tạo
được hạt có kích thước nhỏ đồng đều, dễđiều khiển kích thước hạt theo ý muốn, độ tinh khiết hóa học cao, thiết bịđơn giản giá thành rẻ
Tính đến năm 2010, có khoảng 2000 virus phát công nhận, khoảng 1000 virus gây hại thực vật, chúng làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển cây, suất chất lượng nông sản (Hà Viết Cường, 2010) TMV virus thực vật phân bố rộng khắp giới, có phổ ký chủ rộng, nhiễm 200 loài thuộc 30 họ thực vật khác Tại Việt Nam, TMV virus gây hại phổ biến thuốc lá, làm ảnh hưởng nghiêm trọng
đến suất chất lượng thuốc Nghiên cứu thực với mục
đích điều chế dung dịch nano TiO2 có kích
thước hạt nhỏ 50nm bước đầu đánh giá khả làm bất hoạt virus nó, làm tiền đề
cho việc phát triển hướng nghiên cứu việc phòng trừ bệnh virus gây
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu thiết bị thí nghiệm
2.1.1 Vật liệu
Ti(OC4H9)4, isopropanol, cloroform, thang
DNA 1kb (Fermentas), kit tách chiết RNA (Trizol Regent), hóa chất sử dụng cho RT-PCR số loại hóa chất khác
2.1.2 Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rap, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA,
Đức), máy li tâm, máy nano Drop, máy khuấy từ có gia nhiệt, kính hiển vi điện tử quét Jeol 5410 LV số loại dụng cụ cần thiết khác
2.2 Phương pháp điều chế dung dịch nano TiO2
Dung dịch nano titan điều chế theo phương pháp hai bước:
Bước 1: Điều chế nano TiO2 thể rắn dựa
theo phương pháp Karami (2010) có cải tiến Cơ chất sử dụng Ti(OC4H9)4, môi trường
cho phản ứng thủy phân hệ dung môi hỗn hợp isopropanol - nước xúc tác HNO3
Qui trình tóm tắt theo sơđồ hình Bước 2: Điều chế dung dịch nano TiO2 từ
nano TiO2 thể rắn phương pháp rung siêu
âm theo qui trình Cheng (2009)
2.3 Đánh giá khả phòng trừ virus TMV dung dịch Nano TiO2
2.3.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên khơng lặp lại, gồm 30 thuốc bệnh, có độ
tuổi đồng lây nhiễm virus TMV lá, sau chia thành lơ (lơ thí nghiệm lô đối chứng) Sau ngày lây nhiễm, tiến hành phun dung dịch nano TiO2 cho lơ thí
nghiệm phun nước lô đối chứng, theo dõi trực tiếp mắt thường tiến hành phản
ứng RT-PCR thời điểm tuần sau lây nhiễm để đánh giá hiệu phòng trừ virus TMV dung dịch nano TiO2
2.3.2 Lây nhiễm nhân tạo virus TMV
Virus TMV lây nhiễm vào thuốc phương pháp tiếp xúc học theo quy trình lây nhiễm virus lên thực vật phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ
sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ
Việt Nam
2.3.3 Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số từ mẫu thuốc tách chiết kit Trizol Reagents hãng Invitrogen, bước tiến hành thực theo hướng dẫn nhà sản xuất
2.3.4 Phương pháp RT – PCR
Bước 1: Tổng hợp cDNA: Sử dụng kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) để
(3)Nghiên cứu điều chế dung dịch nano Tio2 bước đầu thử nghiệm trừ tobacco mosaic virus (TMV)
Bảng Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1
Nước cất vô trùng Maste mix Template
TMV helicase 5’ 10pM TMV helicase 3’ 10pM
6 10
2 1
Tổng 20
Bước 2: Tiến hành phản ứng PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu với virus TMV, trình tự cặp mồi sau: TMV-5' helicase: 5’-ATCAACGCGTGTTTTTCG-3’; TMV-3' helicase: 5’-GTCATCCTTTAGAACGGCAAG-3’
Thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng PCR trình bày nhưở bảng
Hình Quy trình tạo nano TiO2 thể rắn phương pháp sol - gel
Bảng Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1
Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dài Kết thúc phản ứng
94 94 53 72 72
3 phút 30 giây 30 giây 45 giây phút
∞
1
30 Hỗn hợp ban đầu Ti(OC4H9)4 +
Isopropanol
H2O, chuẩn HNO3
Nhỏ giọt, khuấy trộn mạnh
Hỗn hợp có chứa Ti(OC4H9)4
Gia nhiệt, khuấy trộn mạnh
Dung dịch nano TiO2
dạng Sol - Gel
Khuấy trộn mạnh Nhiệt độ 70oC
Nano TiO2 thể rắn (dạng bột)
(4)Đồng Huy Giới, Đàm Thị Phương, Chu Hoàng Hà, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu điều chế dung dịch nano TiO2 phương pháp sol-gel
3.1.1 Điều chế nano TiO2 thể rắn
Mục đích nghiên cứu tạo
được nano TiO2 thể rắn (dạng bột) màu vàng
cánh gián, có ánh kim, kích thước hạt nhỏ, bề
mặt hạt mịn khả phân tán nước tốt Tham khảo nghiên cứu trước (Galdiero et al., 2011; Kavitha et al., 2012; Vijayalakshmi and Rajendran, 2012) chúng tơi tiến hành thí nghiệm để tìm điều kiện pH dung mơi, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân phương pháp hịa trộn thích hợp
trong qui trình điều chế nano TiO2 dạng bột
Kết nghiên cứu trình bày bảng 3, 4, Từ kết thu bảng 3, 4, cho thấy, với độ pH dung môi 1,5, nhiệt độ thủy phân 70oC, thời gian thủy
phân 6h phương pháp hịa trộn nhỏ giọt điều kiện thí nghiệm thích hợp để điều chế nano TiO2 thể rắn phương pháp
sol-gel
Sau xác định điều kiện thích hợp yếu tố thí nghiệm đơn lẻ, chúng tơi tiến hành tích hợp điều kiện thích hợp kể đểđiều chế nano TiO2 thể rắn Kết điều chế nano TiO2 thể rắn có đặc điểm phù hợp
với mục đích nghiên cứu (Hình 2) Bảng Ảnh hưởng độ pH dung môi đến kết điều chế nano TiO2
bằng phương pháp sol - gel
Đặc điểm
pH Màu sắc tinh thể Kích thước hạt độ mịn Khả phân tán nước
0,5 kim Màu vàng nhạt, bề mặt có ánh mKích thặt thơ ước hạt trung bình, bề Khả phân tán yếu ánh kim Màu vàng chanh, bề mặt có Kích thmặt hơưới thơ c hạt trung bình, bề Khả phân tán trung bình 1,5 ánh kim Màu vàng cánh gián, bề có mKích thịn ước hạt nhỏ, bề mặt hạt Khả phân tán tốt
2 Màu vàng nhkim ạt, bề mặt có ánh Kích thmịn ước hạt nhỏ, bề mặt hạt Khả phân tán 2,5 Màu vàng tránh kim ắng, bề mặt có Kích thmịn ước hạt nhỏ, bề mặt hạt Khả phân tán trung bình
3 có ánh kim Màu trắng đục, bề mặt khơng mKích thặt hạt thơ ước hạt trung bình, bề Khả phân tán thấp
Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến kết điều chế nano TiO2
bằng phương pháp sol - gel
Đặc điểm
Nhiệt độ (oC) Màu sắc tinh thể Kích thước hạt độ mịn Khả phân tán nước
(5)Nghiên cứu điều chế dung dịch nano Tio2 bước đầu thử nghiệm trừ tobacco mosaic virus (TMV)
Bảng Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến kết điều chế nano TiO2
bằng phương pháp sol – gel
Đặc điểm
Thời gian (h) Màu sắc tinh thể Kích thước hạt Khả phân tán
2 Màu vàng cánh gián, bề mặt
có ánh kim Kích thước nhỏ, bề mặt hạt mịn Khbình ả phân tán trung
3 Màu vàng nâu, bề mặt có ánh
kim mKích thặt hạướt thơ c hạt trung bình, bề Khbình ả phân tán trung
4 Màu vàng nhạt, bề mặt có
ánh kim hKích thơi thơ ước hạt nhỏ, bề mặt hạt Khả phân tán Màu vàng, bề mặt có ánh kim Kích thước hạt nhỏ, bề mặt hạt
mịn Khả phân tán
6 Màu vàng cánh gián, bề mặt
có ánh kim Kích thmịn ước hạt nhỏ, bề mặt hạt Khả phân tán tốt
Bảng Ảnh hưởng phương pháp hòa trộn đến kết điều chế nano TiO2 bằng phương pháp sol - gel
Đặc điểm
PP hòa trộn Màu sắc tinh thể Kích thước hạt độ mịn
Khả phân tán nước
Nhỏ giọt Màu vàng cánh gián, bề mặt có
ánh kim mKích thặt hạt mước hịn ạt nhỏ, bề Khả phân tán tốt
Phun tia Màu vàng cánh gián nhạt, bề
mặt có ánh kim bKích thề mặt hướạc ht thơ ạt trung bình, Khả phân tán Đổ trộn Màu vàng nhạt, bề mặt có ánh
kim mKích thặt hạt thơ ước hạt nhỏ, bề Khbình ả phân tán trung
Hình Nano TiO2 thể rắn điều chế
trong điều kiện độ pH dung môi 1,5; nhiệt độ thủy phân 70oC; thời gian
thủy phân 6h phương pháp hòa trộn nhỏ giọt
3.1.2 Tạo dung dịch nano TiO2 bằng rung
siêu âm
Sau điều chế nano TiO2 thể rắn
bằng phương pháp sol-gel, tiến hành
tạo dung dịch nano TiO2 cách trộn nano
TiO2 thể rắn với nước cất theo tỉ lệ 0,1g nano
TiO2 thể rắn 100ml nước cất, sau rung
siêu âm thời gian 3h Kết tạo
được dung dịch nano TiO2 có màu trắng trong,
khả phân tán hạt nước tốt, mức lắng đọng theo theo thời gian yếu (Hình 3)
3.1.3 Bước đầu khảo sát kích thước hạt nano TiO2
Kích thước hạt nano
tiêu quan trọng liên quan đến hoạt tính chúng Theo kết nghiên cứu trước,các hạt nano có kích thước từ – 100 nm có khả tiêu diệt virus, kích thước hạt nhỏ khả tiêu diệt virus cao Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát kích thước độ
phân tán hạt nano TiO2 dung dịch
nano TiO2 thu kính hiển vi điện tử
(6)Đồng Huy Giới, Đàm Thị Phương, Chu Hoàng Hà, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn
khoảng từ 15nm - 50nm, hạt phân bố tương đối
đồng dung dịch Kết cho thấy, dung dịch nano TiO2 điều chế có khả sử dụng để phịng trừ virus cách có hiệu
Hình Dung dịch Nano TiO2
thu sau 3h rung siêu âm
Hình Ảnh hạt nano TiO2
dung dịch chụp kính hiển vi điện tử quét Jeol 5410 LV
3.2 Đánh giá khả phòng trừ virus TMV dung dịch Nano TiO2
Đểđánh giá khả phòng trừ virus TMV dung dịch Nano TiO2điều chế được, chúng
tôi tiến hành pha lỗng dung dịch 10 lần sau phun lên mặt lơ thí nghiệm Theo dõi trực tiếp mắt thường tiến hành phản ứng RT-PCR để đánh giá hiệu
phòng trừ
Ở thời điểm tuần sau lây nhiễm, thuộc lơ thí nghiệm sinh trưởng, phát triển bình thường khơng thấy có dấu hiệu bệnh khảm thuốc (Hình 5) Ngược lại, tất
các thuộc lơ đối chứng có dấu hiệu bệnh khảm thuốc bị biến dạng nhẹ, mặt loang lổ màu xanh đậm nhạt
không đều, số chỗ mô phồng lốm đốm, chùn lại (Hình 6) Tiếp tục theo dõi
đến thời điểm tuần sau lây nhiễm nhận thấy, thuốc thuộc lơ thí nghiệm sinh trưởng, phát triển bình thường khơng có dấu hiệu bệnh khảm thuốc lá, ngược lại thuộc lô đối chứng bệnh biểu nặng Từ kết trên, sơ kết luận rằng: dung dịch Nano TiO2 có khả
năng ức chế phát triển biểu triệu chứng bệnh virus TMV thuốc
Để khẳng định cách xác khả
năng phòng trừ virus TMV dung dịch nano TiO2, song song với việc theo dõi trực tiếp
biểu triệu chứng bệnh thuốc lá, tiến hành lấy mẫu thân cây, tách chiết RNA tổng số tiến hành phản ứng RT-PCR để kiểm tra tồn virus TMV thuốc
Từ kết quảđiện di sản phẩm PCR hình cho thấy, lơ đối chứng, có tồn virus TMV thuốc thời điểm (2 tuần tuần sau lây nhiễm), điều chứng tỏ lây nhiễm thành công virus TMV
được nhân lên lây lan thuốc Ngược lại, mẫu thân lơ thí nghiệm, khơng tìm thấy có diện virus TMV thời điểm, điều chứng tỏ
việc xử lý dung dịch nano TiO2 có hiệu
ngăn chặn phát triển lây lan virus TMV thuốc Kết lần cho thấy dung dịch Nano TiO2
điều chế có khả ngăn ngừa phát triển biểu triệu chứng bệnh virus TMV thuốc
(7)Nghiên cứu điều chế dung dịch nano Tio2 bước đầu thử nghiệm trừ tobacco mosaic virus (TMV)
Hình Cây thuốc lô đối chứng sau tuần lây nhiễm virus TMV
(A)
(B)
Hình Kết điện di sản phẩn PCR của mẫu sau tuần lây nhiễm (A)
sau tuần lây nhiễm (B)
Ký hiệu: (Đ/c+): Mẫu thu từ phần thân lô đối chứng; 1: Mẫu thu từ phần thân lô thí nghiệm; 2, 3, 4, 5, 6, 7: Mẫu thu từ phần lơ thí nghiệm; M: Marker KẾT LUẬN
Dung dịch nano TiO2 từ chất Ti(OC4H9)4 điều chế thành công phương pháp sol-gel với điều kiện thích hợp khâu là: độ pH dung môi 1,5, nhiệt độ
thủy phân 70˚C, thời gian thủy phân 6h phương pháp hòa trộn nhỏ giọt
Điều chế thành công dung dịch nano TiO2
từ chất Ti(OC4H9)4 phương pháp sol-gel
với điều kiện thích hợp khâu là: độ
pH dung môi 1,5, nhiệt độ thủy phân 70˚C, thời gian thủy phân 6h phương pháp
hịa trộn nhỏ giọt
Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét cho thấy hạt nano phân bố đồng đều, kích thước hạt dao động khoảng từ 15-50nm
Kết thu quan sát hình thái thuốc điện di sản phẩm PCR cho thấy dung dịch Nano TiO2được điều chế có khả
năng ức chế phát triển biểu triệu chứng bệnh virus TMV thuốc
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hà Viết Cường (2010) Virus thực vật, phytoplasma viroid Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Ngơ Huỳnh Bửu Trọng, Võ Văn Hồng (2012) Các
đặc điểm cấu trúc hạt nano TiO2 pha lỏng
vơ định hình ĐH Bách Khoa TP.HCM
Cheng L.X (2009) Nanofluid heat transfer technologies. Recent Patents on Engineering, 3(1):1-7
Duan Y., Liu J., Ma L., Li N., Liu H., Wang J., Zheng L., Liu C., Wang X., Zhao X., Yan J., Wang S., Wang H., Zhang X., Hong F (2010) Toxicological characteristics of nanoparticulate anatase titanium dioxide in mice Biomaterials, 31(5): 894-899 Galdiero S., Falanga A., Vitiello M., Cantisani M.,
Marra V and V Galdiero V (2011) Silver Nanoparticles as Potential Antiviral Agents Molecules, 16(10): 8894-8918
Karami A (2010) Synthesis of TiO2 nano powder by the sol – gel method and its use a photicatalyst Journal of the Iranian chemical Society, 7(2): 154-160
Kavitha T., Rajendran A., Durairajan A (2012) Synthesis, characterization of TiO2 nano powder
and water based nanofluids using two step method European Journal of Applied Engineering and Scientific Research, 1(4): 235-240
Vijayalakshmi R., Rajendran V (2012) Synthesis and characterization of nano-TiO2 via different methods Archives of Applied Science Research, 4(2): 1183-1190