NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - THIỀU THẢO MINH NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - THIỀU THẢO MINH NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS VŨ THỊ BÍCH HẬU Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu luận văn trung thực Những kết luận khoa học luận văn chưa công bố cơng trình Tác giả luận văn Thiều Thảo Minh ii NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI Học viên: Thiều Thảo Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN Khóa: K32 Tóm tắt - Mục đích nghiên cứu lai giống chủng DT với chủng mọc tự nhiên Gia Lai cách giao phối hệ sợi đơn nhân chúng, nhằm tạo chủng lai có nguồn gốc địa thích nghi với mơi trường, cho suất chất lượng cao Chủng nấm linh chi mọc tự nhiên Lim xẹt (Peltophorum tonkinensis) chết Khu bảo tồn thiên nhiên Kon Chư Răng huyện Kbang Dẻ (Quercus lanata) chết Vườn Quốc Gia Kon Ka Kinh, huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai thu thập, nhân giống ni trồng Dựa vào phương pháp phân tích hình thái trực quan kính hiển vi quang học với phương pháp phân tích giải trình tự vùng IT, xác định giống linh chi thu thập G2, G3 thuộc loài Ganoderma lingzhi Đã khảo sát đặc điểm nuôi trồng môi trường chất mùn cưa gỗ cao su thu nhận bào tử giống nấm linh chi để phân lập gây nảy mầm bào tử đơn nhân Trong trình lai tạo, bước đầu tách thành cơng 36 dòng đơn nhân giống linh chi nghiên cứu hồng linh chi DT (G1), hồng chi Kbang (G2) hồng chi Mang Yang (G3) Từ khóa – nấm linh chi; dòng đơn nhân; giao phối, lai RESEARCH ON BREEDING GANODERMA LIGNZHI DT STRAIN WITH THE INDOGENOUS GANODERMA LIGNZHI OF GIA LAI PROBINCE THROUGH MYCELIUM Abstract – The present study aims at crossing DT strains with the naturally occuring strains in Gia Lai by conjugating their monokaryotic mycelium, to produce novel hybrid in which have indigenous origin of adapting to environment readily, providing the high yield and qualities The strains of naturally occuring reishi mushroom (Ganoderma) which grown on plant Peltophorum tonkinensis died at the Natural Conversation Area Kon Chu Rang – Kbang district, and on nut trees (Quercus lanata) at Kon Ka Kinh National Park – Mang Yang district in Gia Lai province, have been isolated, propagated and cultivated The identification of both these indigenous Ganoderma strains has been carried out by the methods of visually shape analysis combined with the optical microscope and ITS sequence analysis These resulting varieties respectively, are known as G2 and G3 belong to Ganoderma lingzhi species After the cultivation on substate of the rubber wood sawdust was characterised, the spores of three Ganoderma varieties consisting of Red Reishi DT (G1), Red Reishi Kbang (G2) and Red Reishi Mang Yang (G3), have been collected to isolate and cause monokaryotic spores to germinate The early steps in the breeding process have successfully separated 36 monokaryons from them Keywords: Breeding, Monokaryon, Ganoderma, Hybrid, Reishi mushroom iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đa dạng sinh học hệ thống học nấm linh chi Ganodermataceae 1.1.1 Lịch sử tình trạng phân loại Ganodemataceae 1.1.2 Hình thái học lồi họ Ganodermataceae 1.1.3 Sinh thái học phân bố họ Ganodermataceae 1.2 Vịng đời lồi nấm thuộc Basidiomycota 1.3 Di truyền giới tính lồi nấm thuộc Basidiomycota 10 1.3.1 Đồng tản (Honothallism) 11 1.3.2 Dị tản (Heterothallism) 11 1.4 Khái quát phương pháp cải tiến giống nấm .13 1.4.1 Phương pháp tuyển chọn .13 1.4.2 Phương pháp lai 14 1.4.3 Phương pháp chuyển gen 17 1.5 Phân nhóm dịng đơn bội lồi dị tản tứ cực 18 1.6 Các nghiên cứu liên quan đến loài thuộc chi Ganoderma Việt Nam 19 1.7 Các nghiên cứu liên quan đến lai giống nấm linh chi giới 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 22 2.2 Đối tượng nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phân loại đặc điểm hình thái 23 iv 2.3.2 Phân loại dựa trình tự vùng ITS 23 2.3.3 Khảo sát đặc điểm nuôi trồng .25 2.3.4 Thu thập, gây nảy mầm bào tử phân lập dòng đơn bội 28 2.3.5 Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi DT với giống nấm linh chi địa 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30 3.1 Thu thập phân loại giống nấm .30 3.1.1 Thu thập nấm linh chi địa Gia Lai 30 3.1.2 Phân loại đặc điểm hình thái 32 3.1.3 Phân loại dựa trình tự vùng ITS 37 3.2 Khảo sát đặc điểm nuôi trồng 42 3.2.1 Tốc độ dịng hóa chất .42 3.2.2 Hiệu suất chuyển hóa sinh học .42 3.3 Phân lập dòng đơn bội 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao) v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP ITS LSU Amplified Fragment Lenghth Polymorphism Internal Transcribed spacers Large subunit RNA coding region NTS Non transcribed spacer PDA Potato dextro aga SSU Small subunit RNA vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 2.1 Tên bảng Danh sách giống nấm Linh chi thu thập Trang 23 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Vịng đời loài nấm Basidiomycota 1.2 Hình thái hệ sợ nấm dị nhân sợi nấm đồng nhân 10 1.3 Di truyền giới tính kiểu dị tản tứ cực 13 1.4 Vai trò nhân tố bắt cặp hình thành mấu nối 19 2.1 Cách xếp cấu tạo rDNA 24 2.2 Quy trình tạo giống nấm linh chi 26 3.1 Nấm linh chi Kbang (G2) 30 3.2 Nấm linh chi Mang Yang (G3) 31 3.3 Nấm linh chi DT (G1) 31 3.4 Đặc điểm hình thái chủng linh chi DT (G1) 32 3.5 Đặc điểm hình thái chủng linh chi Kbang (G2) 34 3.6 Đặc điểm hình thái chủng linh chi Mang Yang (G3) 36 3.7 Kết BLAST trình tự vùng ITS chủng nấm DT với NCBI 38 3.8 Kết BLAST trình tự vùng ITS chủng nấm Kbang với NCBI 39 3.9 Kết BLAST trình tự vùng ITS chủng nấm Mang Yang với NCBI 40 3.10 Cây phát sinh loài chủng Ganoderma phương pháp Maximum likelihood 41 3.11 Đồ thị biểu tốc độ dịng hóa chất giống nấm 42 3.12 Đồ thị biểu hiệu suất chuyển hóa sinh học 43 3.13 Ni trồng giống nghiên cứu khu vực riêng để thu bào tử 44 3.14 Nồng độ pha loãng nảy mầm bào tử Linh chi giống G1 45 3.15 Nồng độ pha loãng nảy mầm bào tử Linh chi giống G2 45 3.16 Nồng độ pha loãng nảy mầm bào tử nấm Linh chi giống G3 46 3.17 Cấy trải để phân lập hệ sợi đơn nhân 46 3.18 Soi kính hiển vi tìm bào tử nảy mầm ống kính 4x 47 3.19 Bào tử nảy mầm chụp kính hiển vi (ống kính 4x) 48 3.20 Các dòng đơn bội thu thập 48 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nấm linh chi thảo dược thiên nhiên xếp vào loại thượng dược Giá trị dược liệu nấm linh chi ghi chép thư tịch cổ Trung Quốc cách 4000 năm (Zgao, J.D., 1940) Từ kinh nghiệm lưu truyền dân gian, loài người biết sử dụng nấm linh chi theo nhiều cách khác Cùng với phát triển khoa học công nghệ, nấm linh chi chứng minh có tác dụng hữu ích việc điều trị bệnh, như: giải độc bảo vệ tế bào gan, hạ đường máu, trừ gốc tự do, chống lão hoá làm giảm nguy mắc bệnh ung thư, tim mạch, cao huyết áp, tiểu đường hạn chế phát triển khối u, suy nhược thần kinh… [5, 6] Hiện nay, nấm linh chi khơng cịn khan trước người áp dụng khoa học kỹ thuật để ni trồng nhân rộng môi trường nhân tạo chất phế phụ liệu nông nghiệp giàu cellulose (mùn cưa, bã mía, bơng thải) [2] Ở nước ta nhiều tổ chức, sở tiến hành nghiên cứu ni trồng, chế biến thăm dị hoạt chất sinh học có nấm linh chi, bao gồm nhóm: axit béo, steroid, alkaloid, polysaccharide, adenosine … Trong thành phần có tác dụng dược tính q đặc trưng cho nấm linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [1], [31] Gia Lai có nhiều loại nấm mọc hoang dã tự nhiên tỉnh có khí hậu phù hợp để trồng loại công nghiệp Đây nguồn nguyên liệu thích hợp làm chất ni trồng nấm nói chung nấm linh chi nói riêng nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng bảo tồn tính đa dạng nấm linh chi tự nhiên Trong năm gần đây, có nhiều nhiệm vụ khoa học công nghệ, nhiều nghiên cứu nhằm hỗ trợ phát triển nghề nấm địa phương sản lượng nấm thấp, chưa đáp ứng đủ nhu cầu thị trường, đặc biệt nấm linh chi Một phần nguyên nhân chưa xác định chủng loại giống thích hợp với điều kiện khí hậu địa phương Hơn nữa, số chủng loại nấm linh chi nuôi trồng phổ biến không nhiều, chủ yếu nhập nội tuyển chọn tự nhiên Vì việc “Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi chủng DT với giống nấm linh chi địa Gia Lai hệ sợi” nhằm đa dạng hóa chủng loại nấm linh chi, lai tạo tuyển chọn chủng nấm có nguồn gốc địa, thích nghi tốt với mơi trường, cho suất chất lượng cao Phụ lục 3: Phân lập tạo giống Phụ lục 4: Giống nấm linh chi phân lập Phụ lục 5: Thời gian hệ sợi lan kín bề mặt bịch phôi giống nấm STT bịch Giống G1 (ngày) Giống G2 (ngày) Giống G3 (ngày) Lần Lần2 Lần Lần1 Lần2 Lần3 24 26 27 22 24 23 23 23 21 24 25 25 22 23 23 23 22 22 26 24 25 22 24 23 21 24 20 25 27 26 24 22 24 24 22 23 27 26 26 23 23 23 23 21 21 23 25 24 25 24 22 21 23 24 24 26 25 21 23 25 23 21 22 25 26 27 23 22 23 24 22 21 24 27 26 24 25 24 21 24 23 10 25 25 23 23 22 23 22 22 21 Trung bình 25,27a ±1,17 Lần1 Lần2 23,13b ± 1,01 Lần3 23,23c ± 1,17 Phụ lục 6: Sản lượng nấm tươi thu hoạch giống nấm STT bịch Giống G1 (g) Giống G2 (g) Giống G3 (g) Lần Lần2 Lần Lần1 Lần2 Lần3 Lần1 Lần2 Lần3 111 106 106 93 94 94 98 95 97 107 111 105 91 93 97 98 96 98 103 107 111 97 91 97 96 95 96 111 105 107 95 97 93 91 98 95 107 102 108 97 96 97 97 97 97 105 108 111 93 93 93 95 94 93 108 102 107 91 96 95 97 98 98 103 111 103 97 95 95 96 94 96 105 102 104 93 91 93 97 96 97 10 106 103 111 95 95 91 96 92 98 Trung bình 106,53a±3,08 94,27b±2,10 96,03c±1,83 Phục lục 7: Nồng độ pha loãng nảy mầm bảo tử nấm Linh chi Giống G1 Pha loãng 10-5 10-6 10-7 Nhiễm 81 53 34 Không mọc 15 45 65 Mọc khuẩn lạc Kết Phụ lục 8: Nồng độ pha loãng nảy mầm bảo tử nấm Linh chi Giống G2 Pha loãng 10-5 10-6 10-7 Nhiễm 86 62 41 Không mọc 35 59 Mọc khuẩn lạc Kết Phụ lục 9: Nồng độ pha loãng nảy mầm bảo tử nấm Linh chi Giống G3 Pha loãng Kết 10-5 10-6 10-7 Nhiễm 76 61 47 Không mọc 13 33 49 Mọc khuẩn lạc 11 Phụ lục 10: Trọng lượng chất khô bịch phôi lần khảo sát Lần khảo sát Trọng lượng chất khô bịch phôi (g) Lần 630,5 Lần 625,7 Lần 631,3 Trung bình 629,17± 3,03 Phụ lục 11: Môi trường thạch nước STT Thành Phần Số lượng Agar 20g Nước cất vừa đủ 1000ml Điều chỉnh pH 6,5 Các thành phần cân cho vào chai Scott Duran, bổ sung nước cất để hịa tan, điều chỉnh thể tích pH Đậy nắt, hấp khử trùng 1210C thời gian 30 phút Phụ lục 12: Môi trường PDA STT Thành phần Số lượng Agar 20g Dextrose/Glucose 20g Khoai tây 200g Nước cất vừa đủ 1000ml Điều chỉnh pH 6,5 Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ, thái lát mỏng, nấu sôi nhẹ 30p, lọc lấy dịch chiết Sau bổ sung tất thành phần vào chai Scott Duran, điều chỉnh thể tích pH Đậy nắt, hấp khử trùng 1210C thời gian 30 phút Phụ lục 13: Môi trường nhân giống dạng hạt STT Thành phần Tỉ lệ Hạt lúa nấu 100 Bột nhẹ (CaCO3) Lúa vo sạch, bỏ hạt lép, ngâm qua đêm, rửa lại cho trước nấu Lúa nấu đến nứt vỏ trấu, để yên khoảng 10 phút để hạt lúa hấp thu nước kiểm tra độ ẩm phù hợp cách cân lúa trước nấu sau nấu xong tỉ lệ khối lương khoảng 1,75 – 1,85 đạt yêu cầu độ ẩm nguyên liệu trộn thêm bột nhẹ (CaCO3) Cho hỗn hợp vào chai thủy tinh, nút bông, bọc báo, hấp khử trùng 1210C thòi gian 60 phút, để nguội, cấy giống Ủ tơ điều kiện tối 26- 300C khoảng 18 – 25 ngày Phụ lục 14: Môi trường mạt cưa cao su STT Thành phần Tỉ lê (%) Mạt cưa cao su Cám gạo 3 Bột bắp Vôi 0,5 Điều chỉnh độ ẩm 65% 100 Mạt cưa trộn với nước vôi, ủ đống tuần, đảo trộn đống ủ ủ lại thêm ngày Sau bổ sung cám gạo,bột bắp điều chỉnh lại độ ẩm nước vơi lỗng (0,1%) cho độ ẩm khoảng 65% Đóng bịch nilon chịu nhiệt kích thước sau đóng bịch 12cm rộng x 20cm cao, trọng lượng bịch khoảng 1,2kg thắt cổ nút, nhét nút chuyển qua hấp khử trùng nhiệt độ 100oC thời gian – 10 h Để nguội, cấy giống Ươm sợi nhiệt độ 26 – 300C