Nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá f ab’ 2 từ huyết tương ngựa đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

1 ĐH Y Hà Nội Thái Danh Tuyên Nghiên cứu sản xuất Huyết kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất lƣợng chế phẩm phịng thí nghiệm 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo WHO ước tính, năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (2% dân số) [40], máu toàn phần chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, phải kể đến chế phẩm huyết như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152] đó, huyết kháng nọc rắn (antivenom) loại chế phẩm quan trọng, đặc biệt điều trị rối loạn đông cầm máu nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi đất nơng nghiệp, bờ biển dài 3000 km, Việt Nam có mơi trường thuận lợi cho rắn độc phát triển Mặt khác, phần lớn cư dân sinh sống, làm việc môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy bị rắn độc cắn cao (> 30.000 người /năm [21]); tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng phải truyền hàng chục lít máu huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai phải truyền ≈ 46 lít máu chế phẩm để cứu người bệnh [174] Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu huyết tương phải sử dụng điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế quan tâm đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đến nay, có số nghiên cứu thành cơng, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23] Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; có hai loại HTKNR cho rắn hổ đất rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho quốc gia (khuyến cáo WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt HTKNR cho loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; lồi đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) Việt Nam, lồi rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong cao (> 80% không cấp cứu điều trị kịp thời) [14] Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn Việt Nam từ trước đến cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây hai lồi rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” giống nhau, thống nhìn khó phân biệt Hai lồi rắn khác độc tính nọc biểu lâm sàng, chẩn đoán dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu khơng có tác dụng chéo chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15] Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho hai loài rắn độc nguy hiểm nói giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn nước Để tăng tính an tồn chế phẩm, dạng F(ab’)2 tối ưu, đồng thời phải áp dụng giải pháp kỹ thuật kiểm soát chất lượng tồn diện để chế phẩm đạt Tiêu chuẩn Quốc gia HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9] Với lý trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất lƣợng chế phẩm phịng thí nghiệm” thực hiện, nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia Đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÁU VÀ HUYẾT TƢƠNG 1.1.1 Máu: - Khái niệm: máu mô lỏng màu đỏ lưu thông hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước - Đặc điểm: máu chiếm 1/13 trọng lượng thể (60-70 ml/kg); thể tích nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31] - Máu động vật có vú gồm HC, BC, TC huyết tương, với chức cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ thể, tương tự người 1.1.2 Huyết tƣơng: - Khái niệm: phần dịch lỏng thu sau ly tâm để lắng tự nhiên máu tồn phần chống đơng - Thành phần chủ yếu nước (92%), chứa protein hòa tan (tức làalbumin, globulin fibrinogen), protein phân tử, đường, yếu tố đông máu, chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide [31],[167] - Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, yếu tố đông máu, yếu tố enzyme, protein liên kết với lipid, protein vận chuyển Các thành phần thay đổi bệnh lý Điện di protein, điện di miễn dịch tách thành phần protein Mỗi protein huyết tương có điểm đẳng điện tương ứng với pH Tính hịa tan protein chịu ảnh hưởng nhiệt độ tính hịa tan dung dịch muối Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan thay đổi, tính chất sinh học đi; yếu tố gây biến tính protein gồm: nhiệt độ, độ acid base, tia cực tím làm đứt gãy liên kết peptid, sóng siêu âm gây oxy hóa [31],[163] 1.2 CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG 1.2.1 Máu toàn phần: - Lấy từ mạch máu người cho, động vật cho máu, bảo quản túi (chai) có chất chống đơng bảo quản máu Dung dịch bảo quản máu thông thường CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin Mỗi đơn vị 250 ml máu người cho khỏe mạnh có 30-40 gam hemoglobin [31],[170] - Bảo quản máu toàn phần 2-6oC, thời gian bảo quản tối đa 42 ngày (với dung dịch bảo quản CPDA) Máu toàn phần lưu trữ chứa thành phần hồng cầu, thu nhận cịn có tiểu cầu số yếu tố đơng máu Bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ giải phóng chất trung gian; ngồi chứa tế bào lympho yếu tố huyết tương - Khi sản xuất HTKNR, lấy máu túi 450 ml, túi đôi để dễ sản xuất, đảm bảo vơ trùng an tồn, khơng gây vỡ HC vận chuyển 1.2.2 Khối hồng cầu [31],[170]: - Là máu toàn phần ly tâm tách phần huyết tương sang túi khác Tuỳ cách sản xuất mà có loại khối hồng cầu sau: + Khối hồng cầu đậm đặc: khối hồng cầu có hematocrit khoảng 75% Thành phần có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết tương Bảo quản: 26°C Chế phẩm có tính chất đậm đặc nên phải truyền chậm + Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: sau tách huyết tương khỏi hồng cầu, trả lại dung dịch bảo quản Thành phần: hồng cầu dung dịch bảo quản, cịn bạch cầu Lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần Bảo quản: 2-6°C thời gian 42 ngày + Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: máu toàn phần tách huyết tương phần Buffy coast Thành phần: hồng cầu + bạch cầu loại bỏ khoảng 10% so với khối hồng cầu thông thường Ưu điểm: giảm phản ứng bạch cầu, giảm nguy lây bệnh mà tác nhân cư trú bạch cầu + Khối hồng cầu rửa: máu toàn phần khối hồng cầu, ly tâm bỏ hết huyết tương thay nước muối sinh lý, trộn ly tâm tiếp để rửa ba lần Thành phần: hồng cầu + nước muối sinhh lý Bảo quản: 2oC-6°C 24 giờ, 22°C + Khối hồng cầu lọc bạch cầu khối hồng cầu chiếu xạ: khối hồng cầu dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hai Bảo quản: 2-6°C hai tuần từ chiếu xạ, dùng màng lọc rời sau lọc khơng để q 24 Thành phần: hồng cầu, bạch cầu cịn lại ít, bạch cầu bị bất hoạt * Như vậy: sau tách huyết tương, tùy điều kiện nhu cầu truyền trả khối HC ngựa sớm hay muộn để định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi dưỡng HC phương pháp bảo quản, vận chuyển đường đến nơi truyền trả khối HC ngựa Nếu lấy máu ngựa vào túi 450ml, việc truyền khối HC trở lên đơn giản lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít) 1.2.3 Khối tiểu cầu: + Khối tiểu cầu tách từ máu toàn phần: ly tâm túi máu toàn phần, gạn lấy lớp Buffy coast ly tâm tách lấy tiểu cầu Thường từ 3-4 đơn vị máu toàn phần nhóm ABO sản xuất đơn vị pool tiểu cầu Bảo quản: chưa pool, để 22°C, lắc liên tục 3-5 ngày Nếu pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 Số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011 + Khối tiểu cầu tách chiết: dùng máy tách tế bào với kit chuyên dụng để lấy tiểu cầu từ người cho Thành phần: có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/ đơn vị, có bạch cầu + Bảo quản: 22°C máy lắc liên tục, tối đa ngày 1.2.4 Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh: - Huyết tương tách từ máu toàn phần kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh gọi huyết tương tươi đông lạnh - Thành phần: albumin, globulin miễn dịch, yếu tố đơng máu bền vững, yếu tố VIII cịn khoảng 70% Lượng huyết tương tách từ đơn vị máu (250 ml) có khoảng 125-150ml Thường pool lượng huyết tương tươi hai đơn vị máu toàn phần nhóm, dung tích khoảng 250-300ml Bảo quản: - 25°C/năm, ≤ - 25°C hai năm [31],[170] - Khi sản xuất HTKNR, không cần sử dụng huyết tương tươi đông lạnh máu ngựa khơng cần sử dụng yếu tố đông máu Nếu cần bảo quản để sản xuất nhiều đợt thời điểm khác nhau, cần bảo quản nhiệt độ ≤ - 25°C 1.2.5 Tủa VIII (cryo): - Để huyết tương tươi đông lạnh 4°C, huyết tương tan có phần tủa, ly tâm thu nhận tủa cryo Thành phần: tủa VIII khoảng - đơn vị/ml, yếu tố V, fibrinogen - Trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn trọng lượng phân tử IgG (150 kD) [16] tách ta phương pháp tủa Cohn Fraction I, loại bỏ phần tách γ-globulin khơng cần thiết sử dụng 1.2.6 Huyết tƣơng tƣơi tách tủa: - Phần huyết tương tách sau lấy tủa huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản -25°C Thành phần gồm có: albumin, globulin, số yếu tố đông máu Nếu sản xuất HTKNR theo phương pháp Cohn, phần cần thiết giữ lại để sản xuất có γ -globulin - Bảo quản huyết tương tươi đông lạnh 1.2.7 Huyết tƣơng đông lạnh: - Thành phần: yếu tố huyết tương, yếu tố đông máu không bền vững cịn lại Đây huyết tương tách từ máu toàn phần sau kể từ lấy máu bảo quản - 25°C Bảo quản: huyết tương tươi đông lạnh - Chủ yếu tách huyết tương để sản xuất HTKNR theo dạng chế phẩm 1.2.8 Khối bạch cầu hạt: - Tách từ phần Buffy-coast pool nhiều người cho máu Thành phần: chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu số tế bào lympho, chất bạch cầu giải phóng Khối bạch cầu hạt tập hợp từ nhiều người nguy nhiễm virus cao - Bảo quản: 22°C ≤ 24 - Trong sản xuất HTKNR, cần tách huyết tương, cần để lại phần bạch cầu tiểu cầu với khối HC Chú ý truyền lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục 1.2.9 Albumin: - Albumin protein hình cầu, tính hịa tan cao, trọng lượng phân tử 66.500 Da, chiếm nhiều huyết thanh; chức trì 70 - 80% áp lực keo huyết tương liên kết, vận chuyển chất có phân tử nhỏ bilirubin, hormon, steroid, acid béo, phân tử thuốc Dung dịch albumin điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 - 20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa 5% protein [163] - Do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm theo phương pháp tủa Cohn thu albumin Fraction V, phần tủa Cohn cuối - Khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ Theo tiêu chuẩn tinh protein dược điển Việt Nam III-2002, albumin phép dạng vết, phát điện di miễn dịch [7] 1.2.10 Gamma globulin: Hình 1.1 Hình ảnh điện di protein huyết - Gamma globulin (-globulin) lớp globulin, xác định điện di protein huyết Có năm lớp -globulin IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; chiếm tỷ lệ nhiều IgG, sau IgM; IgD, IgA, IgE chiếm - Năm 1940, -globulin tách chiết lần đầu tiên; khơng lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IMIG) đưa vào sử dụng, tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -globulin huyết (1950) - Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IVIG) sản xuất đưa vào sử dụng năm 1970, đau, tác dụng nhanh IMIG - Năm 1981, Gamimune Mile phân lập, IVIG đăng ký Mỹ, Sandoglobulin hãng Sandoz có thị trường năm 1984 Gamimune chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986 sản phẩm đổi tên thành Gamimuner N Sau đó, số IVIG khác đăng ký Mỹ: Gammagard Hyland, Polygam hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam Immuno, Venoglobulin-I Alpha Therapeutic, Gammar-IV Armor GammaRaas RAAS (Mỹ) [167] - Năm 1991, IVIG sản phẩm dạng bột hoà tan lần chấp nhận (Venoglobulin-S) Năm 1994, sau vụ dịch viêm gan C liên quan đến 10 Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột khơng hồ tan Gammagard Polygam bị đình - Năm 1980, bệnh nhân dùng IVIG điều trị giảm -globulin huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy tăng số lượng tiểu cầu Tiếp theo phát ngẫu nhiên này, việc sử dụng IVIG cho ITP nghiên cứu dùng cho định Kể từ IVIG có hiệu ITP, chúng tiếp tục đánh giá điều trị bệnh khác với giả định chế tự miễn Hầu hết sử dụng IVIG bệnh tự miễn có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre Các định -globulin thừa nhận gồm: suy giảm miễn dịch tiên phát, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực ghép tuỷ xương - Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IVIG) chế phẩm có 95% IgG từ huyết tương người hiến máu tinh chế IGIM chứa 15-18% protein, IgG chiếm 90% IGIM dung dịch suốt đục, có màu vàng nhạt nâu nhạt Cả hai loại dung dịch vô khuẩn, không chứa chất gây sốt, gồm globin chứa nhiều loại kháng thể có mặt máu người bình thường, pH 6,4 - 7,2 với thimerosal chất bảo quản - Sau tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết đạt đỉnh ngày IgG có IGIM phân bổ nhanh ngang khu vực mạch máu Ở người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy IgG khoảng 23 ngày Khi liều tiêm IGIM lớn 10 ml phải chia thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhằm làm giảm đau chỗ bớt khó chịu Tổng liều lần tiêm bắp thịt không vượt 20 ml (ngay người lớn) Bảo quản nhiệt độ lạnh từ 2-8oC không để đông băng Thời hạn dùng IGIM không năm kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) nhà sản xuất [31],[123] 115 = 95,6%), phù hợp với hình ảnh điện di protein Tóm lại: kết hợp điện di protein định lượng thành phần HTKN-RCN cho thấy kết tinh chế hiệu HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 chế tạo có độ tinh cao, lượng F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN chiếm tới 95,6% (= 46,26 g/l) Các globulin miễn dịch lại chiếm 4,4% (= 2,141 g/l); lượng albumin chiếm 2,8% (1,4 g/l) Đây ba thành phần protein có HTKN-RCN F(ab’)2 sản xuất 4.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CHẾ PHẨM: 4.2.1 Kiểm định sở vấn đề kiểm soát chất lƣợng: 4.2.1.1 Tính “An tồn” chế phẩm: Theo bảng 3.18, kết thử nghiệm an toàn chung (Safety test) chuột lang Cobaye cho thấy: với liều tiêm phúc mạc ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 /100 gam cân nặng, theo dõi 21 ngày ba chuột cho kết đạt yêu cầu: ba chuột tăng cân, phát triển bình thường, khơng có chuột ốm, chuột chết Đây thử nghiệm xác định tồn độc tố nói chung sinh phẩm y tế Thử nghiệm tiến hành hầu hết sở sản xuất HTKNR giới, WHO giới thiệu hướng dẫn kiểm tra chất lượng HTKNR Đây thử nghiệm dễ làm, theo dõi khơng phức tạp có độ nhạy cao Thử nghiệm bắt buộc với tất sinh phẩm kháng huyết thanh, kháng huyết dùng đường tiêm tĩnh mạch Theo kết bảng 3.19, thử nghiệm chí nhiệt tố (Pyrogen test) cho thấy HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 bán thành phẩm đạt yêu cầu, HTKNR khơng có chất gây sốt Theo bảng 3.20, HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 sau cấy khuẩn (Sterility test) đạt vơ khuẩn, khơng có vi khuẩn, vi nấm mọc môi trường thạch Chocolat, thạch máu môi trường Sabouraud, với điều 116 kiện nhiệt độ tối ưu, theo dõi 14 ngày liên tiếp Như vậy, kiểm định sở, tiêu chuẩn “An toàn” HTKN-RCN F(ab’)2 xác nhận mức “Đạt” Đây yêu cầu kiểm tra chất lượng sản phẩm mức sở sản xuất Đối với thuốc dùng cho người, tiêu chuẩn an tồn tiêu chuẩn đầu tiên, tiêu chuẩn số Nếu không an toàn, thuốc nguy hiểm cho người bệnh, phải hủy bỏ Việc sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đảm bảo loại bỏ nhiều nguy an toàn miễn dịch cắt bỏ phần Fc Tuy nhiên, trình tinh chế gồm nhiều cơng đoạn, nhiều loại hóa chất sử dụng, tiềm ẩn nhiều nguy nhiễm khuẩn, nhiễm độc loại độc tố khác nhau, chất gây sốt Việc chấp hành tốt yêu cầu quy định tất khâu kỹ thuật tiền đề quan trọng đảm bảo an toàn cho sản phẩm HTKNR nghiên cứu Việc kiểm tra thường xuyên khâu công đoạn sản xuất HTKNR cho thấy vai trò quan trọng kiểm định sản xuất Đây tiền đề cho đời sản phẩm HTKNR an toàn Thử nghiệm tiến hành động vật thí nghiệm phịng thí nghiệm để chắn “An tồn” cho người bệnh, kể trường hợp liều HTKNR cần phải sử dụng tăng cao nhiều lần giới hạn quy định Cũng với chế phẩm sinh học nào, qui trình kỹ thuật sản xuất HTKNR phải đảm bảo giảm thiểu tối đa nguy nhiễm virus từ nguyên liệu ban đầu Xuyên suốt tất bước qui trình sản xuất, cần bất hoạt, loại bỏ nguy nhiễm khuẩn, nhiễm virus tiềm ẩn Cần phải giảm thiểu tối đa nguy nhiễm vi khuẩn, virus việc thi hành hệ thống kiểm tra chất lượng nguyên liệu ban đầu, bố trí qui trình sản xuất nhằm bất hoạt loại bỏ virus cịn sót lại suốt q trình sản xuất HTKNR, tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn GMP tất bước sản xuất, đáp ứng kịp thời phù hợp với cố nhiễm trùng ghi nhận sử dụng 117 HTKNR lâm sàng Theo WHO (Guidelines, 2008), từ trước đến chưa có báo cáo trường hợp lây truyền virus gây bệnh qua đường sử dụng kháng huyết [151] Điều cơng đoạn tinh chế tách hết tế bào, cịn huyết tương, virus khơng thể tồn phát triển khơng có tế bào chủ Đồng thời, với việc sử dụng hóa chất có tính diệt khuẩn pepsin, ammonium sulfate, merthiolat, điều kiện nhiệt độ cao kéo dài hàng giờ, pH acide thấp tới 3,5 (WHO guidelines 2008, [151],[154], Burnouf T., et al 2007 [45],[46], Reid K.G., Cuthbertson B, et al., 1988 [121]); việc lọc bỏ tủa, thẩm tích, lọc vơ trùng với màng lọc 0,2 µm góp phần bước loại bỏ nguy (đã chứng minh qua nhiều nghiên cứu) (Terpstra F.G et al., 2006) [140] Tuy vậy, sản xuất HTKNR, phải ln lưu ý, khơng bỏ sót vấn đề Cần thường xuyên ý thông tin nghiên cứu lây nhiễm virus thực tế [142],[143] 4.2.1.2 Hiệu lực chế phẩm nghiên cứu: Theo kết bảng 3.21, xác định liều chết trung bình (LD50) nọc rắn cạp nia Việt Nam (gồm hai loài rắn cạp nia bắc nam) 2,17 µg/chuột (18-20 g) Đây cơng việc bắt buộc trước tính ED50 Ngay tiến hành thử nghiệm, đếm số chuột sống chết xác định nhanh LD50 = µg/chuột nhắt trắng Tuy nhiên, để xác, nhóm nghiên cứu cần phải tính tốn Khi tính LD50, chúng tơi sử dụng cơng thức tính LD50 G Karber [27]: LD50 = LD100 – (Z d/n) Trong đó: Z số trung bình tử vong nhóm kế cận, d: khoảng cách liều lượng nhóm, n: số động vật thử nghiệm nhóm Sau tính tốn cụ thể cho kết LD50 = 2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g) So sánh tính tốn đếm nhanh, chúng tơi thấy tương đương (2,17 & 2), tính tốn theo cơng thức xác 0,17 µg Như vậy, nhóm nghiên cứu pha loãng nọc rắn với hệ số 1,5 118 lần (bảng 3.21), khác so với độ pha lỗng tính theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 (theo Dược điển, bậc pha lỗng 1,2 1,4 lần) Cách tính LD50 theo công thức Karber lựa chọn dễ sử dụng, dễ tính tốn so với cơng thức tính LD50 khác, song đảm bảo độ xác Liều chết 50% (Lethal Dose 50%) - LD50 chuột nhắt trắng trọng lượng 18-20g/con WHO khuyết cáo cách tính tốn từ năm 1971 nhắc lại khuyến cáo gần Tuy nhiên, WHO khơng quy định cụ thể phải tính theo cơng thức tính LD50 nào, [151],[27],[105] Dược điển Việt Nam III IV quy định cụ thể cách tính LD50 theo Spearman – Karber tính tốn phức tạp cách sử dụng (phương pháp Karber, Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995) [27] Phần nêu chương 2, đối tượng phương pháp nghiên cứu, mục Kiểm định quốc gia, cách tính LD50 ED50 Việc pha nọc rắn xác định LD50 tiến hành theo nhiều nồng độc khác Nước muối sinh lý dùng làm dung mơi pha lỗng nọc, cho thể tích dịch nọc lần tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng Swiss 10 - 20 gam 0,2 ml/con, tiêm phúc mạc chuột 0,5 ml/con Thời gian theo dõi chuột tiêm tĩnh mạch 24 giờ, tiêm phúc mạc 48 Từ ghi nhận liều nọc gây chết chuột từ 0% đến 100% liều nọc gây chết nửa số chuột thí nghiệm (LD50) Qua đó, xác định mức độ độc nọc Theo bảng 3.21, LD50 nọc rắn cạp nia đa giá 2,17 µg chuột nhắt trắng 18 - 20g, cao so với LD50 nọc B candidus Thái Lan nghiên cứu Chanhome L et al., 2009 (0,053 - 0,070 µg/g)[50], B.candidus Malaysia nghiên cứu Tan N.H et al., 2004 (0,1 µg/g) [135], đồng thời thấp LD50 rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) nghiên cứu Steven D., 1999 (0,15 µg/g) [131] 119 Hiệu lực trung hịa hoạt tính độc nọc mục tiêu sản xuất HTKNR (Peres C.M.; Bastos F.M., et al, 2006)[114] Bước quan trọng thực thử nghiệm tiền lâm sàng phịng thí nghiệm động vật, xác định khả trung hòa nọc độc HTKNR, bao gồm khả cứu sống động vật, chống chảy máu, chống tiêu sợi huyết, chống hoại tử, trung hòa độc tố thần kinh… nọc gây nên Đầu tiên phải xác định hoạt tính gây chết nọc, liều gây chảy máu tối thiểu (Minimum haemorrhagic dose MHD), liều đông tối thiểu nọc tác động lên sợi huyết huyết tương (Minimum coagulant dose- fibrinogen & plasma: MCD-F, MCD-P) Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) HTKNR tiêu chuẩn so sánh HTKNR lô sở sản xuất với sở khác Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm - con, trọng lượng 18 - 20 g/con Dung dịch nọc cố định trộn với HTKNR (tăng dần) Đường tiêm tĩnh mạch phổ biến, dùng đường tiêm phúc mạc Theo dõi 24 số lượng chuột sống 50% sau tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc HTKNR khả bảo vệ hay hiệu lực HTKNR Tuy nhiên, chủng loại chuột nhắt trắng, số lượng nọc (LD50) để trộn với HTKNR, đường tiêm cho chuột… lưu ý để kết thí nghiệm đạt yêu cầu đồng khả so sánh có ý nghĩa Các thí nghiệm xác định khả trung hịa HTKNR với hoạt tính đặc biệt chảy máu, phù nề, tiền đông, tiêu hủy sợi huyết, hoại tử khơng thực thường qui Tuy nhiên, cần, tham khảo tài liệu hướng dẫn WHO Cần có HTKNR nọc tiêu chuẩn tham chiếu để so sánh, đánh giá chất lượng Vì vậy, quốc gia, khu vực cần có tiêu chuẩn tham chiếu nọc HTKNR địa phương Điểm thống chung thử nghiệm động vật tốn Mối tương quan nhiễm độc từ động vật tới điều trị người hạn chế không rõ Gần đây, quốc gia Âu-Mỹ đề nghị không nên thử nghiệm 120 gây chết chuột Từ tác giả đưa thử nghiệm phôi gà thay thử nghiệm động vật Theo dõi phôi gà sống chết phản ánh khả trung hòa HTKNR với liều chết nọc Kỹ thuật áp dụng để xác định hoạt tính gây chảy máu nọc khả trung hòa HTKNR cách đo đường kính vùng chảy máu nhỏ nọc, so sánh với kết nọc ủ trước với HTKNR Giá nghiệm loại rẻ Tuy nhiên, thử nghiệm phôi gà lại không áp dụng với độc tố thần kinh Trong kiểm tra chất lượng HTKNR, trước hết xét nghiệm xác định khả trung hòa nọc độc (Neutralization potency test) Đây khâu định hiệu thuốc Nọc rắn độc nguyên nhân đe dọa tính mạng, tồn thể nạn nhân, phải trung hòa, loại bỏ nhanh tốt Kết nghiên cứu xác định hai xét nghiệm hiệu lực, là: liều gây chết 50% (LD50) nọc rắn cạp nia 2,17 µg/chuột (20g) liều hiệu lực trung hịa, có khả giải độc cứu người HTKN cạp nia đa giá F(ab’)2 (ED50) loạt sản xuất nghiên cứu 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml Kỹ thuật tiến hành theo khuyến cáo WHO, Đơn vị nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc, Trung tâm chống độc, bệnh viện Bạch Mai Kết phù hợp với “Phiếu trả lời kết kiểm định số: 00610/SPĐT-NC Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế, ngày 1/12/2010 4.2.2 Kiểm định chất lƣợng Kiểm định Quốc gia : Kiểm định Quốc gia HTKNR bao gồm hai nhóm kiểm định: nhóm kiểm định an tồn, cơng hiệu nhóm kiểm định tính chất lý hóa (thử nghiệm xác định nồng độ NaCl, nồng độ protein, nồng độ chất bảo quản, pH ) Thông thường, kiểm định Quốc gia làm công tác đánh giá chất lượng sau cùng, sau kiểm định sở tiến hành xong cho kết đạt yêu cầu 121 Kiểm định Quốc gia tiến hành theo yêu cầu nhà sản xuất, thường kiểm định thành phẩm hoàn chỉnh Đây thử nghiệm thực độc lập với sở sản xuất, với trang thiết bị đại, động vật thí nghiệm đạt chuẩn, phịng thí nghiệm hồn thiện nhất, cho thử nghiệm tiến hành điều kiện tốt nhất, hóa chất chuẩn nhất, nhân viên lành nghề Kiểm định Quốc gia có hệ thống quy trình kỹ thuật riêng, tiêu chuẩn đánh giá riêng, tuân thủ gần tuyệt đối theo điều khoản quy định chặt chẽ có tính pháp lý Dược điển Việt Nam Việc lấy mẫu kiểm định ngẫu nhiên, theo quy trình lấy mẫu riêng, quy định cụ thể, rõ ràng Dược điển Việt Nam Mỗi quốc gia có Dược điển Sản xuất HTKNR tham khảo Dược điển nước tiêu chuẩn cho sản phẩm; tham khảo theo hướng dẫn WHO, nhiên cuối phải tuyệt đối tuân thủ luật pháp sản xuất, sử dụng thuốc theo tiêu chuẩn quốc gia Dược điển Việt Nam Do đó, kết thử nghiệm Viện kiểm định quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế, Bộ y tế quan trọng kết luận chất lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đề tài nghiên cứu sản xuất Kiểm định cấp I hay kiểm định sản xuất khâu kiểm tra chất lượng toàn diện Kiểm định sở hay kiểm định cấp II thực đánh giá qua bốn thử nghiệm an tồn, cơng hiệu quan trọng Tuy điều kiện sở sản xuất chưa tốt, đánh giá cẩn thận theo tiêu chí chất lượng bốn kiểm định an tồn, cơng hiệu (bảng 3.18; 3.19; 3.20; 3.21) Sau có kết kiểm định quốc gia, đối chiếu với kết chúng tôi, thấy hoàn toàn phù hợp: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu Đạt an tồn chung, khơng có chất gây sốt, vô khuẩn; khác chút kết đánh giá công hiệu: hiệu giá xác định 285,7 LD50/lọ; Kiểm định Quốc gia xác định 267,5 LD50/lọ (thấp 18 LD50/lọ ml so với Kiểm định sở) 122 Theo Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV, không quy định cụ thể hiệu giá HTKNR bao nhiêu, khâu khó xác định trước, nhà sản xuất đặt mục tiêu Hướng dẫn WHO tương tự, khơng có quy định cụ thể mức đạt công hiệu (hiệu giá) Theo Dược điển Châu Âu (Eropean Pharmacopoeia 5.0) hiệu giá phải > 100 LD50 sản phẩm có hiệu giá gấp đơi u cầu [65] Theo dõi thông tin sản phẩm HTKNR giới cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 chống nọc hai loại RCN Bungarus candidus Bungarus multicinctus, từ huyết tương ngựa đề tài sản phẩm thành công phịng thí nghiệm giới Các hội nghị khoa học HTKNR giới, gần Hội nghị độc chất học Châu Á –Thái Bình Dương Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X (APAMT) Penang, Malaysia (2011) [89], thơng tin tạp chí Quốc tế, chưa có tác giả thơng báo sản xuất sản phẩm tương tự Hiện nay, khu vực Đông nam Á, Thái Lan Malaysia hai nước phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh Về sản phẩm HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc rắn cạp nia nam, nước có nhiều nghiên cứu đáng ý Theo Fung S.Y; Ponnudurai G., Tan N.H (2004) [135], nhà khoa học hàng đầu Malaysia HTKNR - sản phẩm HTKNRCN đa giá, phịng thí nghiệm (trên thỏ) cho lồi rắn cạp nia B flavicep Malaixia có hiệu giá 42 LD50/ml, 167 LD50/ml, có khả phản ứng chéo trung hịa nọc rắn cạp nia B candidus, B multicinctus Trước đó, Chanhome L., Wongtongkam N., Khow O (1999) [51], sản xuất HTKN rắn cạp nong (B fasciatus), nhận thấy có nhiều tương đồng nọc B fasciatus với nọc B candidus, B multicinctus Các tác giả nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá chống nọc rắn hổ mang Thái Lan, rắn hổ chúa rắn cạp nong; sau thí nghiệm thử trung hịa nọc độc B candidus, B 123 multicinctus chuột không thành công Các tác giả Ponnudurai G., Tan N.H (1990) [134] cho rằng: có nhiều tương đồng KN nọc B flavicef, B fasciatus với B candidus, B multicinctus Họ cho dùng HTKN-RCN B flavicef Malaysia, hay B fasciatus Thái Lan trung hòa nọc độc B candidus, B multicinctus Tuy nhiên, điều khó, nọc rắn có tính đặc hiệu địa phương sản xuất HTKNR đa giá, tính đặc hiệu kháng nọc giảm so với HTKNR đơn giá chống loại nọc rắn, hiệu điều trị thấp phải dùng số lượng HTKNR nhiều hơn, hậu protein miễn dịch khác loài cao Mặt khác, với Việt Nam, hai loài rắn cạp nia B fasciatus B flavicef có số lượng khơng nhiều, nhu cầu nhiều so với Thái Lan Malaysia Trong đó, rắn cạp nia Việt Nam, Lào Campuchia có đặc điểm giống Chúng ta phát triển nghiên cứu rắn cạp nia tốt so với hai nước bạn Lào Campuchia; tương lai sản xuất đại trà HTKN-RCN cho hai loại Bungarus candidus, Bungarus multicinctus sản xuất phục vụ nhu cầu lớn (xuất cho Lào, Campuchia, phục vụ số chiến đấu cho Quân đội ) Láng giềng Việt Nam khác Đài Loan, Trung Quốc sản xuất HTKN-RCN bắc cho từ sớm Theo Chippaux J.P, Goiffon M (1998) [55], HTKNR bivalent neurotoxic Đài Loan cho rắn hổ mang Naja naja atra Bungarus multicinctus có hiệu giá 1ml serum potency 100 LD50, sản phẩm sản xuất có hiệu giá thấp Đài Loan, thực tế, cần nghiên cứu thêm phương pháp họ để cải thiện hiệu giá Như vậy, phải chờ đợi thời gian lâu để có sản phẩm HTKNR thị trường nhập điều trị, chưa kể giá có hợp lý hay khơng Mặt khác, tính KN theo vùng địa lý nọc rắn điều khó khăn cho ý tưởng mua HTKNR nước khác, trừ việc họ sản xuất theo đơn 124 đặt hàng Cũng nên tính đến tính chủ động cung cấp thuốc Về nhóm tiêu chuẩn lý hóa: thử nghiệm yêu cầu làm có lô HTKNR cần xuất xưởng, thị trường sử dụng lâm sàng Theo bảng 3.23, tiêu chuẩn đạt: pH 7.012, NaCl 0,87%; nồng độ chất bảo quản Merthiolat = 0; nồng độ protein = 7,43 g/dl.(WHO 10 lần Hiệu mặt xã hội: nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chuẩn hóa HTKN-RCN F(ab’)2 đa giá, hướng đến cứu chữa BN tốt việc làm thiết thực, cụ thể, thể quan tâm ngành y tế sức khỏe nhân dân; thể tinh thần tự lực tự cường, tính dân tộc, lịng u nước nhà khoa học y tế Tính mạng người vô giá Sản phẩm tốt, cứu bệnh nhân quà quý báu mà người ngành y tế giành cho đồng bào Về quy mô sản xuất: quy mô sản xuất phụ thuộc cung cầu thị trường, khơng thể sản xuất lớn thị trường nhỏ Hiện chưa có thống kê cụ thể số bệnh nhân bị tai nạn rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) xảy hàng 126 năm, vài nghiên cứu cho thấy số bệnh nhân nằm bệnh viện Chợ Rẫy loài rắn bị tử vong cao, tới 80% Số nạn nhân tử vong tuyến không kịp đến bệnh viện thực tế bao nhiêu, chưa có số thống kê Tỷ lệ tử vong bệnh viện lên tới 80% cho thấy bất lực điều trị bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn Với vai trò quan trọng HTKNR điều trị rắn độc cắn WHO khẳng định, với tiến công nghệ, kỹ thuật hồi sức cấp cứu hiểu biết rõ xử trí cấp cứu rắn cắn người dân, khả đem đến hiệu tốt điều trị bệnh nhân RCN nam Vai trò HTKN-RCN bắc khẳng định nghiên cứu năm 2006 Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ cộng Với số bệnh nhân vào điều trị không trăm người năm cho thấy nhu cầu HTKN-RCN không lớn Tóm lại, cần sản xuất HTKN-RCN thực tế cần thiết tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao, khơng có cách khắc phục ngồi thở máy HTKNR đặc hiệu; nhiên, nhu cầu HTKNRCN hai lồi RCN nam bắc khơng cao Cũng nên sản xuất với qui mô nhỏ dạng đa giá F(ab’)2 gồm hai loài hợp lý kỹ thuật kinh tế Về loại HTKNR nên ý: sản xuất HTKNR cần nhu cầu người bệnh Ở nhiều quốc gia có cơng nghệ Dược phẩm ngành sản xuất thuốc phát triển, nhu cầu không nhiều họ sản xuất cho đủ chủng loại [147], Hoa Kỳ, Đài Loan, Úc Theo nghiên cứu Wang J.D., et al (Đài Loan, 2009) [145], thống kê 55 trẻ em bị rắn độc cắn Đài Loan, chuẩn bị phương án sẵn sàng sử dụng HTKNR cho bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, nhiên, thống kê 13 năm, tác giả không gặp bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn để sử dụng thuốc (sản phẩm Bivalent với Naja naja atra) Hoa Kỳ có đến 6000 - 7000 nạn nhân rắn độc cắn /năm số tử vong có - người (do họ có đủ loại HTKNR sẵn 127 sàng cung cấp cho cấp cứu, điều trị [137] Việt Nam nhu cầu HTKNR lớn Theo Nguyễn Thiên Tạo (2011) [39], Việt Nam nơi cư ngụ 193 loài rắn thuộc 69 giống, họ Trong số ghi nhận tổng số 53 loài rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae 18 loài (8 giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae Như vậy, rắn độc chiếm 53/193 lồi rắn Việt Nam, ~25%, cao gấp đơi so với số trung bình giới Hiện nay, cung cấp thị trường hai loại: HTKN rắn hổ đất HTKN rắn lục tre Các sản phẩm khác sản xuất phòng thí nghiệm HTKN rắn hổ chúa, HTKN rắn cạp nia nam, HTKN rắn hổ mang; cung cấp phạm vi hẹp, dạng sản phẩm nghiên cứu lâm sàng đa trung tâm theo định Bộ y tế HTKN rắn choàm quạp, rắn hổ đất + hổ mang Như vậy, sản xuất HTKNR (antivenom) Việt Nam nhiều việc phải làm Một xu hướng sản xuất HTKNR sản xuất HTKNR dạng đa giá Nói chung, với lồi rắn khác độc tính nọc, họ (Elapidae, Viperidae), chi (Bungarus), khả dễ chẩn đoán nhầm lẫn vùng giáp ranh, xen kẽ nơi cư trú lồi rắn đó, sản xuất HTKNR đa giá; dùng cho nhau, chưa chẩn đốn xác định lồi chúng Thường thường, độc tính nọc rắn vào thể, cần trung hịa sớm tốt Chẩn đốn chậm trễ, dùng HTKNR muộn q khơng có hiệu hiệu thấp, nọc kịp gây hậu xấu, bệnh nhân tổn thương chết trước y tế kịp can thiệp HTKNR đa giá F(ab’)2 giải pháp tốt giải vấn đề 128 KẾT LUẬN Đã sản xuất thành công HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus ) rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), đạt yêu cầu với 8/8 tiêu Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009), đạt 9/10 tiêu WHO (Guidelines, 2008) HTKNR dùng cho người HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu sản xuất khẳng định tính “An tồn” “Hiệu lực” phịng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng cấp sở Kiểm định Quốc gia 129 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu người tình nguyện khỏe mạnh để xác định tính an tồn Nghiên cứu hiệu lực trung hịa độc tính nọc HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 với loại nọc rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam động vật thực nghiệm với cỡ mẫu lớn Thử lâm sàng bệnh viện Bạch Mai bệnh viện Chợ Rẫy với bệnh nhân tình nguyện, bị rắn cạp nia cắn, nhiễm độc nặng Thử lâm sàng đa trung tâm Ứng dụng kết nghiên cứu vào thực tiễn ... đánh giá chất lƣợng chế phẩm phịng thí nghiệm? ?? thực hiện, nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F( ab’) 2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia Đánh giá chất lượng chế phẩm. .. có chất gây sốt Đạt đăng ký nhà sản xuất 6-7 Globulin Phenol < 2, 5 g/l, Cresols < 3,5 g/l ≤1% > 90% 45 2. 2.3 Nội dung nghiên cứu: 2. 2.3.1 Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F( ab’) 2 - Chế tạo kháng. .. tương ngựa sản xuất, điện di HTKNR-RCN đa giá F( ab’) 2 51 2. 2.4.6 Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm: Bước 1: sau tinh chế HTKN-RCN đa giá F( ab’) 2, sản phẩm thơ đóng chai vô khuẩn 450-500