Nghiên cứu hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của loài thông lá dẹt pinus krempfii lecomte và ngũ gia bì hương acanthopanax trifoliatus l merr

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HĨA HỌC v vv LÊ THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LỒI THƠNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L MERR.) Chuyên ngành : Hóa học hữu Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2014 Cơng trình hồn thành tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trịnh Thị Thủy TS Nguyễn Thanh Tâm Phản biện 1: PGS.TS Phan Văn Kiệm Phản biện 2: PGS TS Trần Thị Như Mai Phản biện 3: GS TS Đinh Thị Ngọ Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi ngày tháng 11 năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt nam Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN I.1 Đặt vấn đề Việt Nam có nguồn thực vật phong phú đa dạng Theo số liệu thống kê Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), hệ thực vật Việt Nam có 12.000 lồi khoảng 4.000 loài sử dụng dân gian làm thuốc chữa bệnh Tuy nhiên hầu hết loài thuốc dùng theo kinh nghiệm dân gian Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học đối tượng để tạo sở khoa học nhằm bảo tồn giá trị truyền thống y học dân tộc phát huy tiềm chúng theo hướng đại việc làm cần thiết Lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae Loài có cơng bố giới từ 1966 loài đặc hữu Việt Nam, thực vật cổ “hóa thạch sống” hoi cịn sót lại ngày Việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Thơng dẹt ngồi ý nghĩa khoa học cịn có ý nghĩa lớn mặt xã hội Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae Ngay từ năm 80 kỷ trước, có nhiều cơng trình cơng bố thành phần hóa học Nhiều hợp chất triterpene acid có khung lupan với hàm lượng cao phân lập xác định Tuy nhiên, chưa có cơng trình khoa học nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất triterpene từ cơng bố Do đó, luận án thực với tên đề tài: “Nghiên cứu hố học thăm dị hoạt tính sinh học lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)” I.2 Mục tiêu luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) - Nghiên cứu chiết tách chất, đặc biệt triterpene khung lupane có hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để làm ngun liệu cho q trình chuyển hóa - Tổng hợp dẫn xuất từ triterpene phân lập - Khảo sát hoạt tính sinh học khả kháng chủng Bacillus subtilis, khả gây độc với số dòng tế bào ung thư, khả chống oxi hóa dịch chiết chất phân lập làm sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng hợp chất công nghệ hóa dược I.3 Những đóng góp luận án - Đây lần lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học) Việt Nam - Từ rễ Thông dẹt (Pinus krempfii Lecomte) phân lập xác định cấu trúc hợp chất, chất Galangin (PK4), Isolariciresinol (PK7) lần đầu phân lập từ loài - Từ thân lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) phân lập xác định cấu trúc hợp chất 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) - Bằng phản ứng chuyển hóa vị trí khác tổng hợp 23 dẫn xuất từ hợp chất có hàm lượng lớn AT1 AT2 phân lập từ lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) - Đây kết hoạt tính gây độc tế bào, kháng chủng Bacillus subtilis chống oxi hóa số dịch chiết, hợp chất phân lập tổng hợp từ hai loài nghiên cứu Đặc biệt, dẫn xuất N-[24-nor3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,9-diaminononane (AT22) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7) với IC50 = 3,65 ữ 4,42àg/ml I.4 B cc ca luận án Luận án gồm 144 trang với chương, 20 sơ đồ, 21 bảng, 48 hình, 100 tài liệu tham khảo phụ lục Luận án bố cục sau: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (29 trang); Chương 2: Nguyên liệu, hóa chất phương pháp nghiên cứu (7 trang); Chương 3: Thực nghiệm (25 trang); Chương 4: Kết thảo luận (58 trang); Bảng tổng hợp hợp chất phân lập chuyển hóa hóa học từ lồi nghiên cứu (6 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục cơng trình khoa học cơng bố khn khổ luận án (2 trang); Những đóng góp luận án tiếng Anh (1 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) Ngồi cịn có 59 trang phần Phụ lục với hình phổ kết hoạt tính sinh học II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU: Đề cập tính cần thiết, ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Chương TỔNG QUAN Phần Tổng quan tài liệu tập hợp phân tích nghiên cứu nước quốc tế vấn đề liên quan đến nội dung luận án: • Đặc điểm thực vật tình hình nghiên cứu lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) • Các hợp chất flavonoid • Các hợp chất triterpene khung lupane • Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane hoạt tính sinh học chúng Chương 2: NGUN LIỆU, HĨA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị Mẫu rễ Thông dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thu hái tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng năm 2012 Tên khoa học TS Nguyễn Tiến Hiệp xác định Tiêu số CPC-4711 lưu giữ Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thu hái Mai Châu, Tỉnh Hòa Bình, Việt Nam vào tháng 10 năm 2009 Tên khoa học CN Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu, Bộ Y tế xác định Tiêu lưu giữ Phịng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Hóa chất thiết bị liệt kê đầy đủ luận án 2.2.Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chiết tách: Các phương pháp nghiên cứu chủ yếu gồm: chiết nhiệt độ phòng, chiết phân lớp, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Cấu trúc hợp chất xác định cách kết hợp phương pháp phổ đại phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY …) Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: * Hoạt tính gây độc tế bào: dịng tế bào ung thư người cung cấp ATCC, gồm có: ung thư biểu mơ (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7) * Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 * Hoạt tính chống oxi hóa: Thực theo phương pháp DPPH Chương 3: THỰC NGHIỆM Trình bày cách phân lập, tổng hợp liệt kê tính chất, số vật lý tính tan, điểm nóng chảy (đnc), suất quay cực ([α]D)…, số liệu phổ chất thu từ hai đối tượng nghiên cứu 3.1 Loài Thông dẹt Đã tiến hành xác định thành phần cặn chiết n-hexane phương pháp GC-MS Đã phân lập hợp chất (PK1-PK7) từ hai cặn chiết ethyl acetate n-butanol 3.2 Loài Ngũ gia bì hương Đã phân lập hợp chất (AT1-AT3) từ cặn chiết dichloromethane, AT1, AT2 thu với hàm lượng tương đối cao Từ hai hợp chất AT1, AT2 chuyển hóa hóa học 23 dẫn xuất Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết số chất phân lập Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết từ loài Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 4.1.1 Thành phần hóa học cặn n-hexane Cặn chiết n-hexane thu từ rễ lồi Thơng dẹt chiếm 0,27% (so với lượng mẫu rễ khơ), có đặc điểm sánh, màu vàng nhạt, có mùi đặc trưng tinh dầu thơng Khảo sát sơ sắc ký lớp mỏng cho thấy cặn chiết n-hexane chủ yếu chất phân cực, cặn chiết tập trung xác định thành phần hóa học phương pháp sắc ký khí gắn khối phổ (GC-MS) cho kết Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết phân tích thành phần hóa học cặn chiết n-hexane phương pháp GC-MS TT Hợp chất Thời gian lưu Hàm lượng (RT, phút) (%) α-terpineol 13,332 1,02 1-tert-butyl-1,5-cyclooctadiene α-amorphene 20,038 20,839 0,23 0,22 δ-cadiene Nerolidol 21,962 22,871 0,28 13,79 α-copaene Farnesol 24,839 22,022 1,10 0,50 8 10 11 12 13 14 15 (E,E)-α-farnesene α-bisabolol Caryophylla-2(12),6(13)-dien-5-one (+)α-atlantone Todomatuic acid Trans-Octadec-9-enoic acid Octadecanoic acid O-(3,5-dimethoxyphenyl)-2phenylethene 25,354 25,640 26,310 27,580 33,079 34,486 34,875 36,260 1,08 0,63 0,32 2,31 4,10 0,98 0,43 8,18 Theo số liệu Bảng 4.1, từ cặn chiết n-hexane xác định 15 hợp chất, có mặt α-terpineol (1,02%), hợp chất đặc trưng tinh dầu thông chất thơm nerolidol (13,79%) 4.1.2 Các chất phân lập từ cặn ethyl acetate Từ cặn chiết EtOAc, phân lập chất PK1-PK6 Cả sáu chất hấp thụ ánh sáng đèn tử ngoại (254nm) màu vàng đỏ với thuốc thử Vanilin/H2SO4 hơ nóng dự đốn hợp chất flavonoid Bằng phương pháp phổ (cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối, phổ hồng ngoại) so sánh với số liệu công bố hợp chất phân lập từ lồi Thơng dẹt xác định là: Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin (PK3), Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6) 3' 2' O A O C 10 OH 3' 4' 2' B 5' 1' 6' O O A C O 10 OH B 1' A OH 10 O PK4 O A C 10 OH 6' OH HO A OH O C 10 B 1' 6' OH O 3' 4' 5' 1' 6' 2' HO PK5 A O 4' 5' 3' 5' 1' B PK3 2' 4' B O C 6' 3' HO PK2 2' 5' O PK1 HO 3' 2' 4' OH O C 10 4' B O PK6 5' 1' 6' 4.1.3 Chất phân lập từ cặn n-butanol Từ cặn n-butanol phân lập chất Isolariciresinol (PK7) Hợp chất PK7 dạng chất rắn màu trắng phân lập từ cặn chiết n-BuOH Kết hợp liệu phổ 1H-, 13C-NMR pic ion phân tử m/z 383,1470 [M+Na]+ (tính tốn cho cơng thức C20H24O6 Na+ 383,1465) phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), xác định công thức phân tử chất PK7 C20H24O6 3' HO 1' 8' B 4' 5' 9' 7' 2' O OH C 6' OH A O OH PK7 13 Phổ C-NMR DEPT cho thấy chất PK7 có tín hiệu 20 nguyên tử cacbon, bao gồm cacbon bậc (7xCq) có bốn cacbon bậc nối với oxy (oxy-quartenary carbon, δC 145,1 - 148,9 ppm); nhóm methine (8xCH) có nhóm methine vịng thơm (δC 112,3 - 123,1); nhóm methylene (3xCH2), có nhóm oxymethylene (δC 62,3; 66,0 ppm); tín hiệu có cường độ lớn gấp đơi nhóm methoxy (δC 56,36 ppm, 2xC) Phổ 1H-NMR PK7 phù hợp với số liệu phổ 13C-NMR DEPT Sự xuất tín hiệu proton δH 6,68 (1H, br s, H-2) hai proton có tương tác ortho δH 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5) 6,63 (1H, d, J = 8,0, H-6) cho thấy chất có chứa vịng thơm bị C-1, C-3 C-4 Ngoài ra, hai singlet δH 6,22 (1H, s, H-5’) 6,66 (1H, s, H-2’) cho biết vòng B bị bốn vị trí C-1’, C-3’, C-4’ C-6’ Kết hợp liệu phổ cho thấy hợp chất có liệu phổ đặc trưng lớp chất lignan có vịng thơm gắn C-7 Vị trí xác nhóm hydroxyl methylene, methoxy xác định qua tương tác phổ HMBC Dựa vào tương tác mạnh H7’với C-9’; H-8’ với C-9’ H-7 với C-9; H-8 với C-9 cho thấy có nhóm hydroxyl methylene gắn vào C-8’; nhóm thứ hai gắn với C-8 Hai 10 nhóm methoxy xác định vị trí C-3 C-3’ dựa tương tác proton nhóm methoxy với C-3 C-3’ Bên cạnh đấy, khẳng định vịng A gắn với vịng C C-7 thơng qua tương tác H-2 với C7; H-6 với C-7 (Hình 4.1) H 2' O 3' 4' 5' H OH H 6' 9' 8' C B HO H 1' 7' OH H H A O OH Hình 4.1 Một số tương tác phổ HMBC chất PK7 Cấu hình tương đối trung tâm bất đối (C*) xác định dựa vào số tương tác phổ 1H-NMR liệu phổ NOESY Tương tác H-7’β/H2-9’ H-8/ H2-9’ phổ NOESY cho thấy nhóm hydroxyl methyl C-8’ có cấu hình β Tương tác H-7/ H-8’ cho thấy nhân thơm gắn với C-7 có cấu hình β Điều khẳng định thêm qua độ chuyển dịch khác C-7 (∆δC -1,67 ppm) so với cấu hình α đồng phân PK7a (Bảng 4.2) Bên cạnh tương tác H-2/H-8 phổ NOESY tín hiệu doublet H-7 (δH 3,79 d) H-8 (δH 1,79 tt) phổ 1H-NMR cho số tương tác lớn (J = 11 Hz ), cho thấy hai proton khác phía nhau, khẳng định nhóm methylene C-8 có cấu hình α H 2' O 3' HO H 7' 5' H 9' 8' B 4' H2 H 1' H 6' H H OH 2' O 9' 7' 1' 8' OH 3' OH HO 4' 6' OH 5' A OH O O OH Hình 4.2 Một số tương tác Hình 4.3 Chất burselignan phổ NOESY chất PK7 (PK7a) Dữ liệu phổ chất PK7 hoàn toàn phù hợp với phổ 13 ***Nhận xét thành phần hóa học lồi Thơng Lá dẹt Đây lần Việt Nam lần thứ hai giới (lần đầu từ năm 1966), thành phần hóa học lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) công bố Kết luận án cho thấy lồi Thơng dẹt có chứa nhiều flavonoid, lớp chất thường tìm thấy chi Ngoài flavonoid, hợp chất lignan isolariciresinol phân lập xác định Trong hợp chất phân lập được, galangin isolariciresinol hai hợp chất lần phân lập từ loài Theo tài liệu năm 1966, số chất nhận dạng qua sắc ký khí gắn khối phổ (GC-MS) phổ 1H-NMR, chúng có hàm lượng bé không thu nhận trình chiết, tách - điều giải thích ngun nhân so với cơng bố năm 1966, vài hợp chất không nhận dạng Theo nhiều tài liệu cơng bố, hợp chất flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học quý báu hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính đặc trưng lớp chất Kết nghiên cứu gần cho thấy hai chất pinostrobin tectochrysin có khả ức chế tế bào ung thư vú, hai hợp chất strobopinin crytostrobin có hoạt tính chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus (ATCC 25923) aeruginosa (ATCC 27853) Với hai hợp chất lần đầu phân lập từ lồi này, galangin ngồi khả kháng khuẩn tốt cịn có khả ức chế lại enzyme oxi hóa khử thuộc nhóm polyphenol oxidase (OPD) isolariciresinol có khả chống oxi hóa mạnh, chí cịn cao vitamin E butylated hydroxytoluene (BHT) Ở nồng độ 2,5 μg/ml, Vitamin E ức chế 18,7% zymosan, hợp chất kích hoạt polymorphonuclear leukocytes (PMNL) để tạo oxy gốc tự do, hợp chất isolariciresinol ức chế lên đến 23,8% 14 4.2 Kết từ lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L Merr.) 4.2.1 Các hợp chất phân lập xác định từ lồi Ngũ gia bì hương Từ dịch chiết dichloromethane thân Ngũ gia bì hương, phân lập xác định ba hợp chất triterpene acid khung lupane: 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1); 24-nor3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2); 11α,23-dihydroxy3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) 30 30 30 20 29 29 12 11 26 10 O 23 19 21 22 H HO 25 H 13 14 18 17 16 25 COOH 27 10 HO AT1 12 11 26 23 H 13 14 18 15 17 16 25 28 COOH 10 27 AT2 12 11 26 O HO 23 24 19 21 22 H HO 19 21 22 H HO 28 15 29 20 20 H 13 14 17 16 28 COOH 15 18 27 AT3 Hợp chất AT3 phân lập có dạng bột màu trắng Công thức phân tử AT3 C30H46O5 xác định nhờ pic ion phân tử m/z 487,3424 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C30H47O5 487,3423) phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl νmax 3447cm-1, nhóm carbonyl νmax 1695cm-1 nhóm C=C νmax 1642cm-1 891cm-1 Phổ 1H-NMR AT3 cho thấy xuất proton olefinic δH 4,65 (1H, br s, H-29A), δH 4,79 (1H, br s, H-29B), hai doublet nhóm oxymethylene δH 3,51 3,42 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 10,5); nhóm oxymethine δH 3,86 (1H, dt, J = 11,0 5,0 Hz) singlet năm nhóm methyl δH 0,95; 1,04; 1,09; 1,10; 1,75 ppm Phổ 13 C DEPT cho thấy phân tử có 30 cacbon, bao gồm nhóm ketone δC 220,9; nhóm cacboxylic acid δC 179,8; liên kết đơi δC151,5 110,6; nhóm hydroxymethine δC 71,1; nhóm hydroxymethylene δC 68,5; tín hiệu nhóm methyl 15 δC14,8; 17,2; 17,3; 17,4; 19,7 ppm; chín nhóm methylene, năm nhóm methine năm cacbon bậc bốn Từ liệu phổ cho thấy hợp chất AT3 triterpene acid khung lupane Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR AT3 (CD3OD, 500/125MHz) δC Vị trí δH δC Vị trí δH 2,39 (m, 1H) 37,2 16 1,48 (m, 1H) 33,3 2,47 (m, 1H) 2,29 (m, 1H) 1,68 (m, 1H) 41,8 17 57,4 2,78 (m, 1H) 220,9 18 1,72 (m, 1H) 50,0 54,0 19 3,08 48,2 (dt, J = 10,5;4,5,1H) 2,04 (m, 1H) 48,5 20 151,5 1,45 (m, 2H) 20,6 21 1,54 (m,1H) 37,9 1,95 (m, 1H) 1,47 (m, 1H) 31,7 22 1,52 (m, 2H) 35,1 1,98 (m, 1H) 68,5 43,4 23 3,42;3,51 (dAB, J = 10,5, 2H) 1,64 (d, J = 55,5 24 0,95 (s, 3H) 17,4 11,0, 1H) 10 39,1 25 1,04 (s, 3H) 17,3 11 3,86 (dt, J = 71,1 26 1,10 (s, 3H) 17,2 11,0;5,0, 1H) 12 1,32 (m, 1H) 38,3 27 1,09 (s, 3H) 14,8 2,02 (m, 1H) 13 2,53 (m, 1H) 38,6 28 179,8 14 43,4 29 4,65 (br s, 1H) 110,6 4,79 (br s, 1H) 15 1,25 (m,1H) 30,8 30 1,75 (s, 3H) 19,7 1,47 (m,1H) Vị trí nhóm hydroxyl cacboxylic acid xác định dựa vào phổ 2D-NMR HSQC, HMBC, H-H COSY so sánh với tài 16 liệu Một nhóm hydroxyl gắn C-11 dựa vào tương tác H-11 (δH 3,86) với H-9 (δH 1,64) H-12 (δH 1,32 2,02) phổ H-H COSY Hằng số tương tác H-9 với H-11 J11,9 = Jax,ax = 11,0 Hz, cho thấy nhóm hydroxyl có cấu hình α Phổ HMBC AT3 xuất tương tác proton nhóm hydroxymethylene (δH 3,41 3,51) với C-3 (δC 220,9), C-4 (δC 54,0), C-5 (δC 48,5) nhóm methyl vị trí C-4 (δC 17,4) Từ liệu phổ này, cho phép dự đốn nhóm hydroxymethylene gắn vào vị trí C-23 C-24 So sánh độ dịch chuyển hóa học cacbon hydroxymethylene nhóm methyl AT3 (δC 67,1; 17,0) với 23-hydroxy-3-oxo-urs-12-ene-28-oic (δC 67,0; 17,2) (đo dung mơi CDCl3) thấy hồn tồn đồng (đối với hợp chất: 24-hydroxy betulone (δC 65,3 22,1) Điều cho phép khẳng định nhóm hydroxyl C-23 AT3 Vị trí nhóm cacboxylic acid xác định vị trí C-17 dựa vào tương tác C-28 (δC 179,8) với H-16 (δH 2,29), H-18 (δH 1,72), H-22 (δH 1,52); C-17 (δC 57,4) với H-15 (δH 1, 52), H-16 (δH 2,29) phổ HMBC (Hình 4.6) 30 20 29 H HO H2 25 H2 10 O HO 24 23 H2 12 11 26 H H 19 21 13 14 22 17 18 H2 16 15 H2 COOH 28 H2 27 COSY HMBC Hình 4.6 Các tương tác phổ COSY, HMBC chất AT3 Từ liệu phổ phân tích trên, cấu trúc chất AT3 xác định 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid Đây hợp chất mới, lần phân lập xác định cấu trúc 17 Hình 4.7 Phổ 1H-NMR chất AT3 (500 MHz, CD3OD) Hình 4.8 Phổ 13C-NMR DEPT chất AT3 (125 MHz, CD3OD) *** Nhận xét thành phần hóa học lồi Ngũ gia bì hương Ba hợp chất AT1, AT2 AT3 phân lập từ loài Ngũ gia bì hương thuộc nhóm chất triterpene khung lupane, AT1 AT2 nhóm nghiên cứu Ph.D.Ty phân lập từ năm 1985, AT3 chất Hai chất AT1 AT2 có hàm lượng cao (0,26% 0,25% so với mẫu khơ), luận án sử dụng chất làm nguyên liệu đầu để tổng hợp dẫn xuất nghiên cứu hoạt tính sinh học chúng 18 4.2.2 Tổng hợp dẫn xuất hợp chất AT1, AT2 Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp tìm kiếm hoạt chất mới, từ ba hợp chất phân lập (AT1, AT2, AT3) tổng hợp 23 dẫn xuất Các dẫn xuất khảo sát hoạt tính nhằm tìm chất có hoạt tính cao hướng đến nghiên cứu ứng dụng * Tổng hợp dẫn xuất chất AT1 H RO COOH H AT5 R = -COC6H4COOH (65%) AT6 R = -CO(CH2)3COOH (67%) AT7 R = -COC2H4COOH (65%) O acid anhydride,4- DMAP, pyridine 600C,8h H HO H H3COCO H3COCO COOH (CH3CO)2O, pyridine rt, 24h O R1NH2, TEA, CH2Cl2 rt, 24h O AT1 H (COCl)2, CH2Cl2 rt, 48h COOH CONHR1 O AT4 (85%) CrO3, H2SO4/acetone rt, 4h (CH 3CO)2O, pyridine AT9 AT10 AT11 AT12 R1 = (CH2)10COOCH3 (85%) R1 = (CH2)4CHCH3NH2 (68%) R1 = (CH2)9NH2 (72%) R1 = (CH2)3OH (67%) rt, 24h AT13 R1 = (CH2)3OCOCH3 (87%) H O H O COOH (COCl)2, CH2Cl2 rt, 48h CONH(CH2) 7NH2 H H O AT8 (67%) NH2(CH2)7NH2, TEA, CH2Cl2 rt, 24h O AT14 anhydride, pyridine, 4-DMAP rt,12h H O CONH(CH2) 7NHR2 H O AT15 R2 = COCH3 (52%) AT16 R2 = CO(CH2)2COOH (58%) AT17 R2 = COC6H8COOH (55%) Sơ đồ 4.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất AT1 19 Các dẫn xuất AT1 tổng hợp theo Sơ đồ 4.1 Nhóm hydroxyl vị trí C-11 thực phản ứng acyl hóa với acetic, phthalic, glutaric succinic anhydride pyridine tạo ester AT4, AT5, AT6, AT7 với hiệu suất tương ứng 85%, 65%, 67%, 65% Dẫn xuất acetoxy AT4 chuyển dạng chlorua acid nhờ phản ứng với oxalylchlorid dichlomethan nhiệt độ phòng Cất loại dichlomethan oxalylchlorid dư, thu hợp chất acyl chlorid tương ứng Chất không cần làm mà dùng cho phản ứng Sau đó, cho tác dụng với với amine: methyl 11-aminoundecanoate, 1,5-diamino hexane, 1,9-diaminononane 3-amino-1-propanol với có mặt triethylamine dichloromethane tạo amide AT9- AT12 (hiệu suất tương ứng: 85%, 68%, 72% 67%) Acetyl hóa dẫn xuất AT12 với acetic anhydride pyridine nhiệt độ phòng cho sản phẩm diacetyl AT13 với hiệu suất (87%) Để nhận dẫn xuất amide khác AT1, cách khác thực Oxi hóa AT1 tác nhân Jones CrO3/H2SO4 thu hợp chất diketone AT8 với hiệu suất 67% Nhóm COOH vị trí C-17 AT8 tác dụng với oxalylchloride, sau với diamine (NH2(CH2)7NH2) mơi trường kiềm để tạo amide AT14 Chất không cần làm mà thực phản ứng ngưng tụ với acetic, succinic 1,2,3,6tetrahydrophthalic anhydride có mặt 4-DMAP pyridine cho sản phẩm tương ứng AT15, AT16, AT17 với hiệu suất 52%, 58%, 55% * Tổng hợp dẫn xuất AT2 Tương tự trình tổng hợp dẫn xuất AT1, dẫn xuất AT2 tổng hợp theo Sơ đồ 4.2 Đầu tiên, chất AT2 acyl hóa với acetic anhydride pyridine nhiệt độ phòng tạo dẫn xuất diacetyl AT18 với hiệu suất 86% Dẫn xuất AT18 tiếp tục chuyển hóa thành acyl chloride, sau thực phản ứng amide hóa với dung dịch NH3 methyl 11-aminoundecanoate, 1,5-diamino hexane, 1,9diaminononane 3-amino-1-propanol tạo amide AT19- AT23 (hiệu 20 suất tương ứng: 78%, 75%, 68% 72%) Acetyl hóa nhóm ancol bậc AT23 với acetic anhydride thu sản phẩm AT24 với hiệu suất 87% Thủy phân AT19, AT20 dung dịch NaOH 4N hỗn hợp dung mơi THF/MeOH (1:1) nhiệt độ phịng thu hai dẫn xuất AT25 (74%), AT26 (78%) H HO H H 3C OCO COOH COOH (C H3 C O) O, pyr id in e rt, 24h H H H COCO HO AT AT 18 (86%) ( CO C l) , CH Cl r t, 48h R N H , TEA, CH 2C l r t, 24h H HO H H3C OCO CONHR N aO H 4N , THF/MeO H (1:1) CON HR1 r t, 12h H H H3 COCO HO AT 25 R = H (74%) AT 26 R = (CH 2) 10 COOH (7 8%) AT19 AT20 AT21 AT22 AT23 ( CH CO )2 O, pyr idine rt, 24h R1 = R1 = R1 = R1 = R1 = H (78 %) (C H2 )1 0COOCH (75%) (C H2 )4 CHCH 3NH (68%) (C H2 )9 NH2 (6 5%) (C H2 )3 OH (7 2%) AT24 R = (C H2 )3 OC OC H3 (87 %) H H3 COCO H H 3C OCO C ONH CN CH CO Cl, 4- DMA P, C H2 C l rt, phut H H H 3COC O H COCO AT19 AT27 (7 8%) Sơ đồ 4.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất AT2 Bên cạnh đó, dẫn xuất amide AT19 cịn bị dehydrat hóa 21 thành nitrile Theo số tài liệu công bố, tác dụng SOCl2 POCl2 môi trường kiềm, amide –CONH2 dễ dàng bị tách nước tạo dẫn xuất nitrile Khi thực phản ứng AT19 với CH3COCl/4-DMAP nhiệt độ phịng, phản ứng dehydrat hóa xảy tạo sản phẩm nitril AT27 với hiệu suất tương đối cao (78%) thời gian 15 phút) Cấu trúc dẫn xuất tổng hợp được khẳng định liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (1D-, 2D-NMR) 4.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập chuyển hóa hóa học 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất phân lập số dẫn xuất tổng hợp từ hai loài nghiên cứu tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư người bao gồm ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma), ung thư gan HepG2 (Hepatocellular carcinoma), ung thư phổi LU (Human lung carcinoma) ung thư vú MCF-7 (Human breast carcinoma) Phịng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học Kết thử hoạt tính trình bày Bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết hoạt tính gây độc tế bào Giá trị IC50 dịng tế bào TT Kí hiệu mẫu (µg/ml) KB HepG2 Lu MCF Các chất phân lập từ rễ lồi Thơng dẹt PK1 >128 >128 >128 >128 PK2 >128 >128 >128 >128 PK3 76,48 25,63 86,85 128 PK4 13,8 15,2 54,15 66,28 PK5 29,47 13,45 128 >128 PK6 17,6 17,84 62,54 113,23 22 PK7 112 77 117,33 >128 Các chất phân lập từ thân loài Ngũ gia bì hương AT1 >128 >128 >128 >128 AT2 27,63 23,42 64,72 45,44 10 AT3 >128 >128 >128 >128 Các chất chuyển hóa từ AT1, AT2 11 AT11 13,90 16,21 24,34 18,36 12 AT12 13,53 14,08 18,73 19,64 13 AT13 17,06 18,6 >128 >128 14 AT22 3,65 3,77 4,25 4,42 15 AT23 >128 >128 >128 >128 16 AT24 >128 >128 >128 >128 Chất tham khảo Ellipticin 0,31 0,35 0,45 0,53 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập từ rễ loài Thông dẹt cho thấy chất PK3, PK4, PK6 có hoạt tính bốn dịng tế bào KB, HepG2, LU, MCF7 Đặc biệt, PK4 PK6 cho kết tốt Ngoài ra, hợp chất PK5 có khả ức chế hai dịng tế bào ung thư người KB HepG2 với IC50 tương ứng 29,47 13,45 µg/ml Trong ba hợp chất phân lập từ thân lồi Ngũ gia bì hương (AT1, AT2, AT3), có AT2 có hoạt tính với bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 = 23,42-64,72 µg/ml Điều thú vị phát dẫn xuất AT11, AT12, AT13 AT22 cho hoạt tính cao hai chất đầu AT1 AT2 Đặc biệt, dẫn xuất AT22 có khả ức chế tăng gấp 6-15 lần so với chất đầu AT2 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 KB (3,65µg/ml), HepG2 (3,77µg/ml), 23 LU (4,25µg/ml), MCF7 (4,42µg/ml) Tóm lại, hợp chất N-[24-nor-3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene28-oyl]-1,9-diaminononane (AT22), dẫn xuất chuyển hóa đồng thời ba vị trí 3-OH, 11-OH, 28-COOH hợp chất 24-nor-3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) phân lập từ lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.), có hoạt tính đáng ý với bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư gan HepG2, ung thư phổi LU ung thư vú MCF-7 4.3.2 Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis Ba chất phân lập từ loài Ngũ gia bì hương số dẫn xuất chúng khảo sát hoạt tính kháng chủng gram dương Bacillus subtilis, loại khuẩn có khả sống sót điều kiện nhiệt độ cao thường làm hư hỏng thực phẩm Kết cho thấy, nồng độ 1µM khơng có chất thể hoạt tính nồng độ 10µM ba dẫn xuất AT11, AT16, AT18 cho hoạt tính mạnh (Bảng 4.5) Bảng 4.5 Kết hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis STT Kí hiệu %Ức chế tăng %Ức chế tăng mẫu trưởng c = µM trưởng c = 10 µM AT1 51 AT2 15 38 AT3 31 46 AT4 21 66 AT6 31 34 AT8 43 61 AT9 34 30 AT10 37 67 AT11 37 87 10 AT15 34 39 11 AT16 26 99 12 AT17 35 77 13 AT18 17 91 14 AT19 41 46 24 15 AT20 34 45 16 AT21 45 70 17 AT22 23 77 18 AT26 37 69 4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa Các cặn chiết hợp chất phân lập từ lồi Thơng dẹt tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DHHP Phịng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học Kết thử hoạt tính trình bày Bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH STT Kí hiệu mẫu Nồng độ chất thử trung hòa 50% gốc tự (DPPH) EC50 (µg/ml) Cặn chiết từ rễ lồi Thơng dẹt Cặn n-Hexane >128 Cặn EtOAc >128 Cặn n-BuOH 48,24 Chất PK1 >128 PK2 >128 PK3 >128 PK4 122,62 PK5 >128 PK6 >128 10 PK7 27,12 Chất TK Resveratrol 8,23 Kết thử hoạt tính cho thấy, có cặn BuOH, hợp chất PK4 PK7 có hoạt tính chống oxi hóa Trong đó, cặn BuOH hợp chất PK7 cho hoạt tính tương đối mạnh 25 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Thành phần hóa học lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) • Đây lần lồi Thơng dẹt nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Việt Nam Từ rễ loài này, hợp chất phân lập xác định cấu trúc: - hợp chất flavonoid: Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin (PK3), Galangin (PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6) - hợp chất Lignan: Isolariciresinol (PK7) Hai hợp chất PK4, PK7 lần đầu tìm thấy lồi Pinus krempfii • Đã định danh 15 hợp chất có cặn chiết n-hexane phương pháp phổ GC-MS, có hợp chất đặc trưng tinh dầu thông α-terpineol (1,02%) chất thơm nerolidol (13,79%) Thành phần hóa học lồi Ngũ gia bì hương (Acanthopnax trifoliatus L.Merr.) • Từ thân lồi Ngũ gia bì hương phân lập xác định cấu trúc hợp chất triterpene khung lupane, gồm: 24-nor-11α-hydroxy3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1), 24-nor-3α,11α-dihydroxy-lup20(29)-ene-28-oic acid (AT2), 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene28-oic acid (AT3) Trong đó, AT3 hợp chất hai chất AT1, AT2 có hàm lượng cao (tương ứng 0,25%, 0,26% so với mẫu khô) • Bằng phản ứng chuyển hóa vị trí khác tổng hợp 23 dẫn xuất từ hợp chất có hàm lượng lớn (AT1, AT2)phân lập từ loài này, bao gồm: - Từ AT1: dẫn xuất ester (AT4-AT7); dẫn xuất oxo (AT8) dẫn xuất amide (AT9-AT17) 26 - Từ AT2: dẫn xuất ester (AT18); dẫn xuất amide (AT19AT26) dẫn xuất nitrile (AT27) Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập tổng hợp từ hai lồi Thơng dẹt Ngũ gia bì hương Tiến hành thử hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính oxi hóa số cặn dịch chiết, chất phân lập tổng hợp Kết cho thấy: - hợp chất (AT11, AT16, AT18) thể khả kháng chủng Bacillus subtilis mức trung bình - hợp chất (PK3, PK4, PK6, PK7, AT2, AT11, AT12, AT13, AT22) có hoạt tính với dịng tế bào ung thư KB, HepG2, LU, MCF7 Đặc biệt, dẫn xuất AT22 có khả ức chế tăng gấp 6-15 lần so với chất đầu AT2 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 = 3,65 ữ 4,42àg/ml - Cn BuOH ca loi Thụng lỏ dẹt, hợp chất PK4 PK7 cho hoạt tính chống oxi hóa Trong đó, cặn BuOH PK7 cho hoạt tính tương đối mạnh Trong tổng số 33 chất xác định cấu trúc (10 chất phân lập 23 chất chuyển hóa) có 24 chất mới: chất tự nhiên 23 dẫn xuất tổng hợp Bên cạnh đó, tìm hợp chất có khả kháng chủng Bacillus subtilis; cặn chiết hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa; hợp chất có khả gây độc với bốn dịng ung thư (KB, HepG2, LU, MCF7) có hợp chất thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50=3,65 – 4,42µg/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chuyển hóa hóa học từ hợp chất có hoạt tính mạnh AT2 nhằm tìm dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn, định hướng cho việc ứng dụng y dược Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học từ phận khác gỗ, vỏ lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte)- lồi đặc hữu Việt Nam để đánh giá tồn diện lồi 27 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, Le Thi Hong Nhung, Tran Van Chien, Tran Van Sung, A new lupane triterpenoid from the arial part of Acanthopanax trifoliatus, Chemistry of Natural Compounds-Russia, 2013, 49(2), 274-276 Nguyen Thanh Tam, Le Thi Hong Nhung, Dao Duc Thien, Tran Van Chien, and Tran Van Sung, Synthesis and cytotoxic activity of derivatives of 24-nor-lupane-triterpenoid acids isolated from Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr., Chemistry of Natural CompoundsRussia (accepted), chờ đăng Dao Duc Thien, Lam Hoang Tu, Le Thi Hong Nhung, Tran Van Chien, Nguyen Thanh Tam, and Tran Van Sung, Lupane triterpenoids from Acanthopanax trifoliatus-Isolation and chemical transformation, Tạp chí Hóa học, 2012, 50(5), 609-612 Le Thi Hong Nhung, Trinh Thi Thuy, Nguyen Thanh Tam, Dinh Thi Phong, Nguyen Tien Hiep, Tran Van Sung, Flavonoids and their biological activities from the rootbark of Pinus krempfii Lecomte., Tạp chí Hóa học, 2013, 51(5A), 22-26 Le Thi Hong Nhung, Nguyen Thanh Tam, Dao Duc Thien, Tran Van Chien, Tran Van Sung, Isolation and chemical transformation of lupane triterpenoids from Acanthopanax trifoliatus, The second VASTKAST workshop (Vietnam Academy of Science and Technology – Korean Academy of Science and Technology), Hanoi, October 28th - 29th, 2013 Le Thi Hong Nhung, Trinh Thi Thuy, Nguyen Thanh Tam, Dinh Thi Phong, Nguyen Tien Hiep, Tran Van Sung, Chemical constituents from the rootbark of Pinus krempfii Lecomte and their cytotoxic activity, The second VAST-KAST workshop (Vietnam Academy of Science and Technology – Korean Academy of Science and Technology), Hanoi, October 28th - 29th, 2013 Đào Đức Thiện, Lê Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thanh Tâm, Trần Văn Sung, Tổng hợp số dẫn xuất amide 24-nor-3α,11αdihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid chiết tách từ Ngũ gia bì hương, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Hóa học, 2011, 6164 ... ? ?Nghiên cứu hố học thăm dị hoạt tính sinh học l? ??i Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L. Merr. )” I.2 Mục tiêu luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học l? ??i... phần hóa học hoạt tính sinh học l? ??i Thơng dẹt ngồi ý nghĩa khoa học cịn có ý nghĩa l? ??n mặt xã hội L? ??i Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L. ) Merr. ) thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae... thành phần hóa học l? ??i Thông L? ? dẹt Đây l? ??n Việt Nam l? ??n thứ hai giới (l? ??n đầu từ năm 1966), thành phần hóa học l? ??i Thông dẹt (Pinus krempfii Lecomte) công bố Kết luận án cho thấy l? ??i Thơng dẹt có