Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam epinephelus coioides hamilton 1822 nuôi thương phẩm tại khánh hòa đối với vi khuẩn vibrio parahaemolyticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NI TẠI KHÁNH HỊA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành : 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU DŨNG GS.TS HEIDRUN I WERGELAND KHÁNH HÒA - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NI TẠI KHÁNH HỊA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP KHÁNH HỊA - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus” kết nghiên cứu nghiêm túc thân suốt thời gian từ năm 2007-2012 dƣới hƣớng dẫn tận tình Thầy Cô hƣớng dẫn Tôi xin cam đoan kết quả, số liệu luận án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình Khánh Hòa, năm 2014 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mơ hình hóa ven biển quản lý sức khỏe cáNUFUPRO 2007/10086” tạo điều kiện thuận lợi thời gian hỗ trợ tồn kinh phí cho tơi thực luận án Lời cảm ơn chân thành sâu sắc muốn dành riêng cho hai Thầy Cô giáo hƣớng dẫn: TS Nguyễn Hữu Dũng Giáo sƣ Heidrun I Wergeland định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận án Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo mơi trƣờng phịng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS Lê Văn Bé, TS Phạm Quốc Hùng, TS Đặng Thúy Bình, ThS Nguyễn Thị Thoa sẵn lịng giúp đỡ, đóng góp ý kiến q báu, chia sẻ kinh nghiệm động viên tinh thần trình thực luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch - Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS Ragnhild A Jakobsen, TS Gyri T Haugland, TS Eirin F Pettersen, NCS Anita Ronneseth KS Paul H Lovik tận tình hƣớng dẫn kỹ thuật phân tích thông số miễn dịch thời gian thực nghiên cứu Trƣờng Đại học Bergen, Nauy Cuối cùng, tự đáy lịng cho phép tơi đƣợc bày tỏ tình cảm, lịng biết ơn sâu sắc đến ngƣời thân yêu tôi: Má, anh chị, chồng Nguyễn Văn Hùng gái Nguyễn Anh Thi ln bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn tri ân tất tình cảm giúp đỡ quý báu Khánh Hịa, năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Thùy iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu .4 1.1.2 Nghề nuôi cá mú giới Việt Nam 1.1.3 Một số bệnh thƣờng gặp cá mú nuôi .8 1.2 Vi khuẩn Vibrio bệnh vi khuẩn Vibrio gây cá biển 10 1.2.1 Vi khuẩn Vibrio 10 1.2.2 Bệnh vi khuẩn Vibrio gây cá biển 15 1.3 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xƣơng 17 1.3.1 Miễn dịch tự nhiên 18 1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu 23 1.3.3 Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch cá 27 1.4 Sử dụng vaccine chất kích thích miễn dịch nghề ni cá .29 1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chất kích thích miễn dịch cá nuôi 29 1.4.2 Nghiên cứu sử dụng vaccine cá nuôi 30 1.5 Tình hình nghiên cứu miễn dịch vaccine cho cá Việt Nam 36 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.1.1 Đối tƣợng 40 2.1.2 Vật liệu .40 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 41 2.1.4 Thời gian nghiên cứu 41 iv 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu luận án 42 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 42 2.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cá mú chấm cam .45 2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể cá mú chấm cam .50 2.3.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá mú chấm cam vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 52 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 56 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét cá mú chấm cam 57 3.1.1 Bệnh xuất huyết lở loét cá mú chấm cam ni Khánh Hịa .57 3.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 59 3.1.3 Độc lực chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 A cá mú chấm cam 67 3.2 Ảnh hƣởng β-glucan đến thông số miễn dịch không đặc hiệu khả kháng bệnh Vibrio parahaemolyticus gây cá mú chấm cam 70 3.2.1 Thành phần, đặc điểm hình thái kích thƣớc loại tế bào máu cá mú chấm cam 71 3.2.2 Ảnh hƣởng β-glucan đến thành phần bạch cầu máu cá mú chấm cam 74 3.2.3 Ảnh hƣởng β-glucan đến số thực bào tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 77 3.2.4 Ảnh hƣởng β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hơ hấp tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 80 3.2.5 Ảnh hƣởng β-glucan đến khả kháng bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây cá mú chấm cam 83 3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá mú chấm cam vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .86 3.3.1 Đặc điểm phân tử kháng thể IgM cá mú chấm cam 86 3.3.2 Đáp ứng tạo kháng thể cá mú chấm cam chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin khơng có FIA .88 v 3.3.3 Đáp ứng miễn dịch dịch thể khả kháng bệnh cá mú chấm cam sau gây miễn dịch vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA 89 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 102 Kết luận 102 Đề xuất ý kiến 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có) BA Blood agar base Môi trƣờng thạch máu BHI Brain Heart Infusion Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn CFU Colony Forming Unit Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn CMI Cell-Mediated Immunity Miễn dịch qua trung gian tế bào CRP C-reaction protein Protein phản ứng C DI Direct Immersion Ngâm trực tiếp ĐƢMD Đáp ứng miễn dịch FCA Freund’s complete Adjuvant Chất bổ trợ toàn phần Freund FIA Freund’s Incomplete Adjuvant Chất bổ trợ bán phần Freund HGNNV Humpback grouper nervous necrosis Loại virus gây hoại tử thần kinh cá mú virus lƣng gù HI Hyperosmotic Immersion Ngâm dung dịch ƣu trƣơng HRP Horseradish peroxidase i-ELISA indirect Enzyne Linked Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết Immunosorbent Assay enzyme gián tiếp Ig Immunoglobulin globulin miễn dịch IgM Immunoglobulin M globulin miễn dịch lớp M IL-1 Interleukin kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% LPS Lipopolysacharides MAC Membrane attacking complex Phức hợp công màng MAM Multivalent Adhesion Molecule Phân tử gắn kết đa trị MHC II Major histocompatibility complex Phức hợp hịa hợp mơ chủ yếu lớp II NB Nutrient Broth Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng NCC Non-specific cytotoxic cell Tế bào độc không đặc hiệu NK Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên NTTS Nuôi trồng thủy sản vii OD Optical Density Mật độ quang OMP Outer Membrane Protein Protein ngoại mạc PA Phagocytosis activity Hoạt tính thực bào PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối photphat RBA Respiratory burst activity Hoạt tính bùng nổ hô hấp RPS Relative Percent Survival Hệ số sinh tồn tƣơng đối RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tƣơng đối SAP Serum Amyloid Protein Protein huyết dạng sợi SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di gel polyacrylamide có SDS PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis sIg Surface immunoglobuline Phân tử globulin miễn dịch bề mặt TCBS Thiosulphate citrate bile salt agar Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio TDH Thermostable direct haemolysin Độc tố gây dung huyết bền nhiệt TLH Thermolabile haemolysin Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt αTNF alpha Tumor Necrosis Factor Yếu tố anpha gây hoại tử khối u TNGB Tác nhân gây bệnh TSA Trypticase Soya Agar Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp TSB Trypticase Soya Broth Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp TRH tdh-related hemolysin Độc tố gây dung huyết liên quan tdh Vibriosis VNN VSV Bệnh vi khuẩn Vibrio Viral Nervous Necrosis Bệnh hoại tử thần kinh vi rút Vi sinh vật viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Bệnh vi khuẩn Vibrio cá mú nuôi Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 60 Bảng 3.2: Kích thƣớc loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides .72 Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ loại bạch cầu máu cá mú chấm cam sau tuần đƣợc cho ăn β-glucan 74 Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn nồng độ khác 77 Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy hệ số bảo hộ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin cá mú Epinephelus coioides 99 113 82 Harikrishnan, R., Balasundaram, C and Heo, M.S (2011), "Fish health aspects in grouper aquaculture.", Aquaculture, 320, pp 1-21 83 Harikrishnan, R., Kim, J.S., Balasundaram, C and Heo, M.S (2012), "Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on immune response and disease protection in Epinephelus bruneus against Vibrio harveyi", Aquaculture, 342-343, pp 69-74 84 Harris, K.A and Hartley, J.C (2003), "Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service", Journal of Medical Microbiology, 52, pp 685-691 85 Hatai, K , Iwahashi, Y and Egusa, S (1975), "Vibrio parahaemolyticus from diseased yellowtails", Fish Pathol., 10(1), pp 31-37 86 Hatten, F., Fredriksen, A., Hordvik, I and Endresen, C (2001), "Presence of IgM in cutaneous mucus, but not in gut mucus of Atlantic salmon, Salmo salar Serum IgM is rapidly degraded when added to gut mucus", Fish Shellfish Immunol., 11, pp 257–268 87 Havarstein, L.S., Aasjord, P.M., Ness, S and Endresen, C (1988), "Purification and partial characterization of an IgM- like serum immunoglobulin from Atlantic salmon (Salmo salar)", Dev Comp Immunol., 12, pp 773-785 88 Heemstra, P.C and Randall, J E (1993), "FAO species catalogue An annotated and illustrated catalogue of the grouper, rockcod, hind, coral grouper and lyretail species known to date", FAO Fisheries Synopsis., 125(16) 89 Hegde, A., Chen, C.L., Qin, Q.W., Lam, T.J and Sin, Y.M (2002), "Characterization, pathogenicity and neutralization studies of a nervous necrosis virus isolated from grouper, Epinephelus tauvina, in Singapore", Aquaculture, 213, pp 55-72 90 Holt, J G., Krieg, N R., Sneath, P H A., Staley, J T and Williams, S T (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th eds by Hensyl, W.R., Williams & Wilkins, Baltimore, USA, p 787 114 91 Honda, T., Ni, Y and Miwatani, T (1988), "Purification and characterization of a hemolysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenonnegative Vibrio parahaemolyticus and related to the thermostable direct hemolysin", Infect Immun., 56, pp 961–965 92 Hordvik, I., Berven, F.S., Solem, S.T., Hatten, F and Endresen, C (2002), "Analysis of two IgM isotypes in Atlantic salmon and brown trout", Mol Immunol., 39(56), pp 313–321 93 Hrubec, T.C., Ward, D., Smith, S.A and Robertson, J.L (2004), "Age related changes in humoral immune response of hybrid striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis)", Vet Immunol Immunopathol., 101, pp 103-108 94 Huising, O., Guichelaar, T , Hoek, C., Verburg-Van, L., Flik, G , Savelkoul, J and Rombout, J (2003), "Increased efficacy of immersion vaccineation in fish with hyperosmotic pretreatment", Vaccine, 21, pp 4178–4193 95 Huizinga, H.W., Esch, G.W and Hazen, T.C (1979), "Histopathology of redsore diseases (Aeromonas hydrophila) in naturally and experimentally infected largemouth bass Micropterus salmoides (Lacépède)", J Fish Dis., 2, pp 263277 96 Hunter, R.L., Strickland, F and Kezdy, F (1981), "Studies on the adjuvant activity of nonionic block copolymer surfactants The role of hydrophilelipophile balance", J Immunol., 127, pp 1244–1250 97 Iida, T and Honda, T (1997), "Hemolysins produced by vibrios", J.Toxicol Toxin Rev., 16, pp 215–227 98 Jakobsen, R.A., Gutierrez, M.A and Wergeland, H.I (1999), "Antibodies to Aeromonas salmonicida Lipopolysaccharide and cell wall antigens in rabbit and salmon immune sera", Fish Shellfish Immunol., 9, pp 609-620 99 Jeney, G and Anderson, D.P (1993), "Glucan injection or bath exposure given alone or in combination with a bacterin enhance the non-speciflc defence mechanisms in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)", Aquaculture, 116, pp 315-329 115 100 Jenkins, P.G., Wrathmell, A.B., J.E., Harris and Pulsford, A.L (1994), "Systemic and mucosal immune response to enterically delivered antigen in Oreochromis mossambicus", Fish Shellfish Immunol., 4, pp 255–271 101 Jia, A., Woo, N.Y.S and Zhang, X.H (2010), "Expression, purification and characterization of thermallabile hemolysin (TLH) from Vibrio alginolyticus", Dis Aquat Org., 90, pp 121-127 102 Jia, X., Patrzykat, A., Devlin, R.H., Ackerman, P.A., Iwama, G.K and Hancock, R.E.W (2000), "Antimicrobial peptides protect coho salmon from Vibrio anguillarum infections", Appl Environ Microbiol., 66, pp 1928-1932 103 Jolles, P and Jolles, J (1984), "What’s new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday", Mol Cell Biochem., 63, pp 165 - 189 104 Jones, D.R., Hannan, C.M., Russel-Jones, G.J and Raison, R.L (1999), "Selective B cell non-responsiveness in the gut of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)", Aquaculture, 172, pp 29–39 105 Jorgensen, J B and Robertsen, B (1995), "Yeast 1,3-glucan stimulates respiratory burst activity of Atlantic Salmon (Salmo salar L.) macrophages", Dev Comp Immunol., 19(1), pp 43-57 106 Kai, Y H and Chi, S C (2008), "Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioides) by bath immunization", Vaccine, 26, pp 1450–1457 107 Kai, Y.H., Su, H.M., Tai, K.T and Chi, S.C (2010), "Vaccination of grouper broodfish (Epinephelus tukula) reduces the risk of vertical transmission by nervous necrosis virus", Vaccine, 28, pp 996-1001 108 Kaneko, T and Colwell, R R (1973), "Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology, 113, pp 24-32 109 Kato, K., Ishimaru, K., Sawada, Y., Mutsuro, J., Miyashita, S., Murata, O and Kumai, H (2004), "Ontogeny of digestive and immune system organs of larval and juvenile kelp grouper Epinephelus bruneus reared in the laboratory", Fisheries Science, 70, pp 1061-1069 116 110 Kazuyuki, K., Shigeko, T and Hiroo, I (1979), "Effect of Medium on Flagellation of Vibrio parahaemolyticus", Appl Environ Microbiol., 37, pp 1248-1249 111 Khuntia, C.P., Das, B.K., Samantaray, B.R., Samal, S.K and Mishra, B.K (2008), "Characterization and pathogenicity studies of Vibrio parahaemolyticus isolated from diseased freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man)", Aquaculture, 39, pp 301-310 112 Klebanoff, S.J (1998), Microbicidal mechanisms, oxygen-dependent, Encyclopedia of immunology, Delves, P.J and Roitt, I.M eds, Academic Press, UK, pp 1713- 1718 113 Kumari, J and Sahoo, P.K (2006), "Dietary beta- 1,3 glucan potentiates innate immunity and disease resistance of Asian catfish, Clarias batrachus L.", J Fish Dis., 29, pp 95-101 114 Kusuda, R., Salco, H and Kawai, K (1979), "Classification of vibriosis isolated from diseased fishes Part On the morphological and biochemical properties", Gyobyo Kenkya, 13, pp 123-138 115 Laemmli, U.K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp 680-685 116 Laining, A , Rachmansyaha, Ahmada, T and William, K (2003), "Apparent digestibility of selected feed ingredients for humpback grouper, Cromileptes altivelis", Aquaculture, 218, pp 529 – 538 117 Langston, A L., Johnstone, R and Ellis, A E (2001), "The kinetics of the hypoferraemic response and changes in levels of alternative complement activity in diploid and triploid Atlantic salmon, following injection of lipopolysaccharide", Fish Shellfish Immunol., 11, pp 333 - 345 118 Lauro Tito, C llagan (2012), "Green grouper from Mindanao: KGMC in focus", Aquaculture, 8(2), pp 36-37 119 Le Morvan, C., Troutand, D and Descaux, P (1998), "Differential effects of temperature on specific and nonspecific defenses in fish", Journal of Experimental Biology, 201, pp 165-168 117 120 Lee, J.K., Jung, D.W., Eom, S.Y., Oh, S.W., Kim, Y.J., Kwak, H.S and Kim, Y.H (2008), "Occurrence of Vibrio parahaemolyticus in oysters from Korean retail outlets", Food Control., 19, pp 990-994 121 Lee, K.K (1995), "Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in grouper Epinephelus malabaricus", Microbial Pathogenesis, 19, pp 39-48 122 Leong, T.S and Wong, S.Y (1988), "A comparative study of the parasite fauna of wild and cultured grouper (Epinephelus malabaricus) in Malaysia.", Aquaculture, 68, pp 203-207 123 Li, J., Gao, D., Wang, Q., Wang, J and Wang, Q (2005), "Efficacy of Vibrio anguillarum antigen administered by intraperitoneal injection route in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus", Aquaculture Research, 36, pp 1104 -1111 124 Li, J., Yie, J., Foo, R.W.T., Ling, J.M.L., Xu, H.S and Woo, N.Y.S (1999), "Antibiotic resistance and plasmid profiles of vibrio isolates from cultured silver sea bream, Sparus sarba", Marine Pollution Bulletin, 39, pp 245-249 125 Li, N., Junjie, B., Shuqin, W., Xiaozhe, F., Haihua, L., Xing, Y and Cunbin, S (2008), "An outer membrane protein, OmpK, is an effective vaccine candidate for Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides)", Fish Shellfish Immunol., 25, pp 829–833 126 Li, N., Yang, Z., Bai, J., Fu, X., Liu, L., Shi, C and Wu, S (2010), "A shared antigen among Vibrio species: Outer membrane protein-OmpK as a versatile Vibriosis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides)", Fish Shellfish Immunol., 28, pp 952-956 127 Liao, I C., Huang, T S , Tsai, W S , Hsueh, C M , Chang, S L and Leano, E M (2004), "Cobia culture in Taiwan: Current status and problems", Aquaculture, 237, pp 155-165 128 Lin, C.C., Lin, J.H.Y., Chen, M.S and Yang, H.L (2007), "An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper (Epinephelus coioides)", Aquaculture, 268, pp 265-273 118 129 Lin, H.T., Lin, H.Y and Yang, H.L (2005), "Histology and histochemical enzyme-staining patterns of major immune organs in Epinephelus malabaricus", Journal of Fish Biology, 66, pp 729-740 130 Lin, Y.H and Shiau, S.Y (2005), "Dietary L-ascorbic acid affects growth, nonspecific immune response and disease resista nce in juvenile grouper Epinephelus malabaricus", Aquaculture, 244, pp 215– 221 131 Liu, P C , Chen, Y C , Huang, C Y and Lee, K K (2000), "Virulence of Vibrio parahaemolyticus isolated from cultured small abalone, Haliotis diversicolor, with withering syndrome", Letters in Applied Microbiology, 31, pp 433-437 132 Liu, P.C., Lin, J Y., Chuang, W H and Lee, K.K (2004), "Isolation and characterization of pathogenic Vibrio harveyi (V-carchariae) from the farmed marine cobia fish Rachycentron canadum L with gastroenteritis syndrome", World J Microbiol Biotechnol., 20, pp 495-499 133 Liu, R., Chen, J., Li, K and Zhang, X (2011), "Identification and evaluation a DNA vaccine candidate of a virulence-associated serine protease from a pathogenic Vibrio parahaemolyticus ", Fish Shellfish Immunol., 30, pp 12411248 134 Lobb, C.J and Clem, L.W (1981), "Phylogeny of immunoglobulin structure and function-X Humoral immunoglobulins of the sheapshead, Archosargus probatocephalus", Dev Comp Immunol., 5(2), pp 271–282 135 Lobb, C.J., Olson, M.O and Clem, L.W (1984), "Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish", J Immunol., 132, pp 1917-1925 136 Lumsden, J.S., Ostland, V.E., Byrne, P.J., Ferguson, H.W (1993): and Disease of Aquatic Organism 16, 21–27 (1993), "Detection of a distinct gillsurface antibody response following horizontal infection and bath challenge of brook trout Salvelinus fontinalis with Flavobactewium branchiophilum, the causative agent of bacterial gill disease", Dis Aquat Org., 16, pp 21-27 119 137 Madigan, M T., Martinko, J M and Parker, J (2003), Brock Biology of microorganism, Prentice Hall, America, p 1019 138 Magnadottir, B (2006), "Innate immunity of fish (overview)", Fish Shellfish Immunol., 20, pp 137 -151 139 Mao, Z., Yu, L., You, Z., Wei, Y and Liu, Y (2007), "Cloning, expression and immunogenicty analysis of five outer membrane proteins of Vibrio parahaemolyticus zj2003", Fish Shellfish Immunol., 23, pp 567-575 140 Meseguer, J., Esteban, M.A., Lopez-Ruiz, A and Bielek, E (1994), "Ultrastructure of nonspecific cytotoxic cells in teleosts Effector-target cell binding in a marine and a freshwater species (Sparus aurata L and Cyprinus carpio L.)", The Anatomical Record., 239, pp 468-474 141 Mike, R (2008), "Production update – Marine finfish aquaculture in the Asian-Pacific Region", Aquaculture, 8(1), pp 48- 51 142 Mitchell, H (1995), "Choosing a furunculosis vaccine: points to consider", Bull Aquacult Assoc Can., 95, pp 30–37 143 Morrison, R.N and Nowak, B.F (2001), "Affinity purification and partial characterisation of systemic immonoglobulin of snapper (Pagrus auratus)", Aquaculture, 201, pp 1-17 144 Najiah, M., Lee, K.L., Hassan, M., Sharief, M.L and Mohd-Azmi (2003), "Preliminary study on genetic distance of Vibrio parahaemolyticus isolate from diseased fish and shrimp brackfishwater ponds by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) in Malaysia", Asian fisheries science,16, pp 299305 145 Narjol, G., Blackstone, G M and DePaola, A (2006), "Characterization of a Vibrio alginolyticus strain, isolated from Alaskan oysters, carrying a hemolysin gene similar to the Thermostable Direct Hemolysin-related (trh) of Vibrio parahaemolyticus", Applied and Environmental Microbiology, 72(12), pp 7925–7929 120 146 Nash, G., Anderson, I.G., Shariff, M and Shamsudin, M.N (1987), "Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia", Aquaculture, 67, pp 105-111 147 Navot, N , Kimmel, E and Avtalion, R R (2004), "Enhancement of antigen uptake and antibody production in goldfish (Carassius auratus) following bath immunization and ultrasound treatment", Vaccine, 22, pp 2660–2666 148 Nguyen Thi Thanh Thuy and Nguyen Huu Dung (2008), "Ulcerative disease on culture grouper in Khanh Hoa, Viet Nam", Aquaculture Asia Pacific, 4(3), pp 27-29 149 Nishibuchi, M , Fasano, A., Russell, R G and Kaper, J B (1992), "Enterotoxigenicity of Vibrio parahaemolyticus with and without genes encoding Thermostable Direct Hemolysin", Infection and Immunity, 60, pp 3539-3545 150 Nitzan, Y., Gribun, A and Pechatnikov, I (1983), "Isolation and characterization of the outer membrane from Vibrio parahaemolyticus", Journal of General Microbiology, 129(10), pp 3185-3196 151 Ogier de Baulny, M., Quentel, C., Fournier, V., Lamour, F and Gouvello, R.L (1996), "Effect of long-term oral administration of P-glucan as an immunostimulant or an adjuvant on some non-specific parameters of the immune response of turbot Scophthalmus maximus", Disease of Aquatic Organisms, 26, pp 139-147 152 Ong, B (1988), "Characteristics of bacteria isolated from diseased groupers, Epinephelus salmoides", Aquaculture, 73, pp 7-17 153 Pacha, R E and Kiehn, E D (1969), "Characterization and relation of marine vibrios pathogenic to fish: physiology, serology, and epidemiology", J Bacteriol.,100(3), pp 1242-1247 154 Pakingking, Jr., Bautista, R., Jesus-Ayson, E.G and Reyes, O (2010), "Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-marbled grouper (Epinephelus fuscoguttatus) following vaccination with inactivated betanodavirus", Fish Shellfish Immunol., 28, pp 525-533 121 155 Palic, D., Andreasenb, C.B., Heroltc, D.M., Menzeld, B.W and Rothc, J.A (2006), "Immunomodulatory effects of β-glucan on neutrophil function in fathead minnows (Pimephales promelas Rafinesque, 1820)", Dev Comp Immunol., 30, pp 817-830 156 Papanastasiou, A.D and Zarkadis, I.K (2006), "Cloning and phylogenetic analysis of the alpha subunit of the eighth complement component (C8) in rainbow trout", Molecular Immunology, 43, pp 2188-2194 157 Petersen, E F (2003), Monoclonal antibodies to leucocytes and immunoglobulin from Atlantic salmon ( Salmo salar L.) - Production, characterisation and application, Doctor science thesis, Department of Fisheries and Marine Biology, University of Bergen 158 Pierre, S., Gaillard, S , Nathalieprevot-Dalvise, Aubert, J , Odile, R C , Daniel, L T and Joel, P G (2007), Grouper aquaculture: Asian success and Mediterranean trials, Wiley InterScience 159 Plant, K P and LaPatra, S E (2011), " Advances in fish vaccine delivery", Developmental and Comparative Immunology, 35, pp 1256–1262 160 Plumb, J A and Hanson, L A (2010), Health Maintenance and Principle Microbial Diseases of Cultured Fishes, Wiley-Blackwell 161 Pucci, B., Coscia, M.R and Oreste, U (2003), "Characterization of serum immunoglobulin M of the Antarctic teleost Trematomus bernacchii", Comp Biochem Physiol., 135(2), pp 349–357 162 Quinones, R E I, Bonifacio, I N , Betancourt-Rule, M., Ramirez Vives, F and Vázquez Salinas, C (2010), "Putative virulence factors identified in Vibrio vulnificus strains isolated from oysters and seawater in Mexico", International Journal of Environmental Health Research, 20(6), pp 395-405 163 Randall, J.E and Heemstra, P.C (1991), Revision of Indo-Pacific groupers (Perciformes: Serranidae: Epinephelinae), with descriptions of five new species, Bernice Pauahi Bishop Museum, Honolulu, Hawaii, p 332 122 164 Reed, L.J and Muench, H (1938), "A simple method of estimating fifty percent endpoints", The American Journal of Hygiene, 27, pp 493-497 165 Richter, R., Frenzel, E.M., Hadge, D., Kopperschlager, G and Ambrosius, H (1973), "Structure of Immunoglobulin on carp (Cyprinus carpio L.) ", Acta biol med germ., 30, pp 735-749 166 Robertsen, B., Bergan, V , Roekenes, T , Larsen, R and Albuquerque, A (2003), "Atlantic salmon interferon genes: cloning, sequence analysis, expression, and biological activity", J Interferon Cytokine Res., 23, pp 601 612 167 Robertsen, B., Engstad, R.E and Jørgensen, J.B (1994), β-glucans as immunostimulants in fish., Modulators of Fish Immune Responses, Stolen, J.S and Fletcher, T.C eds, SOS Publications, pp 83-99 168 Rodrıguez, A., Esteban, M.A and Meseguer, J (2003), "Phagocytosis and peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to yeast cells", The Anatomical Record, 272, pp 415-423 169 Rombout, M., Huttenhuis, T , Picchietti, S and Scapigliati, G (2005), "Phylogeny and ontogeny of fish leucocytes", Fish Shellfish Immunol., 19, pp 441-455 170 Ronneseth, A., Wergeland, H.I and Pettersen, E.F (1994) "Neutrophils and B-cells in Atlantic cod (Gadus morhua L.)", Fish Shellfish Immunol., 21, pp 331-342 171 Saeed, M.O (1995), "Association of Vibrio harveyi with mortalities in cultured marine fish in Kuwait", Aquaculture, 136, pp 21-29 172 Sahu, A and Lambris, J.D (2001), "Structure and biology of complement protein C3, a connecting link between innate and acquired immunity", Immunological Review, 180, pp 35-48 173 Sakai, D.K (1984), "Opsonization by fish antibody and complement in the immune phagocytosis by peritoneal exudate cells isolated from salmonid fishes", J Fish Biol., 7, pp 29-38 123 174 Sarjito, O , Radjasa, K., Sabdono, A, Prayitno, S.B and Hutabarat, S (2009), "Phylogenetic diversity of the causative agent of Vibriosis associated with grouper fish from Karimunjawa Island, Indonesisa", Current research in bacteriology, 2, pp 14-21 175 Saunders, D.C (1966), "Differential blood cell counts of 121 species of marine fishes of Puerto Rico", Transactions of the American Microscopical Society, 85, pp 427-449 176 Secombes, C.J and Fletcher, T.C (1992), "The role of phagocytes in the protective mechanisms of fish", Annu Rev Fish Dis., 2, pp 53-71 177 Selvaraj, V, Sampath, K and Sekar, V (2006), "Adjuvant and immunostimulatory effects of β-glucan administration in combination with lipopolysaccharide enhances survival and some immune parameters in carp challenged with Aeromonas hydrophila", Vet Immunol Immunopathol., 114, pp 15-24 178 Selvaraj, V., Sampath, K and Sekar, V (2005), "Administration of yeast glucan enhances survival and some non-specific and specific immune parameters in carp ( Cyprinys carpio) infected with Aeromonas hydrophila", Fish Shellfish Immunol., 19, pp 293-306 179 Seng, L.T (1998), Grouper Culture, Tropical mariculture, De Silva, S.S eds, Academic Press, London, pp 423– 448 180 Shelton, E and Smith, M (1970), "The ultrastructure of carp (Cyprinus carpio) Immonoglobulin: A Tetrameric Macroglobulin", J Mol Biol., 54, pp 615-617 181 Shen, L., Stuge, T.B and Miller, N.W (2002), "Channel catfish cytotoxic cells: a mini-review", Dev Comp Immunol., 26, pp 141-149 182 Shyne, A P S., Sobbhana, K S , George, K C and Paul Rai, R (2008), "Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.)", J Mar Biol Ass., 50, pp 1-6 124 183 Smith, V.J., Fernandes, J.M.O., Jones, S.J., Kemp, G.D and Tatner, M.F (2000), "Antibacterial proteins in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss", Fish Shellfish Immunol., 10, pp 243-260 184 Snoussi, M., Noumi, E , Usai, D , Sechi, L A , Zanetti, S and Bakhrouf, A (2008), "Distribution of some virulence related-properties of Vibrio alginolyticus strains isolated from Mediterranean seawater (Bay of Khenis, Tunisia): investigation of eight Vibrio cholerae virulence genes", World J Microbiol Biotechnol., 24, pp 2133–2141 185 Solem, S.T., Hordvik, I., Killie, J.A., Warr, G.W and Jorgensen, T.O (2001), "Diversity of the immunoglobulin heavy chain in the Atlantic salmon ( Salmo salar L.) is contributed by genes from two parallel IgH isoloci", Dev Comp Immunol., 25(5-6), pp 403–417 186 Sommerser, I., Krossoy, B., Biering, E and Frost, P (2005), "Review vaccines for fish in aquaculture", Expert Rev Vaccines, 4(1), pp 89 - 101 187 Stafford, J L and Belosevic, M (2003), "Transferrin and the innate immune response of fish: Identification of a novel mechanism of macrophage activation", Dev Comp Immunol., 27, pp 539 - 554 188 Stafford, J L., Neumann, N F and Belosevic, M (2001), "Products of proteolytic cleavage of transferrin induce nitric oxide response of goldfish macrophages", Dev Comp Immunol., 25, pp 101 - 115 189 Stills, H.F (2005), " Adjuvants and antibody production: dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants", ILAR J., 46, pp 80 93 190 Sun, Y., Liu, C.S and Sun, L (2011), "A multivalent killed whole-cell vaccine induces effective protection against Edwardsiella tarda and Vibrio anguillarum", Fish Shellfish Immunol., 31, pp 595 -599 191 Sunyer, J.O., Tort, L and Lambris, J.D (1997), "Diversity of the third form of complement, C3, in fish: functional characterization of five forms of C3 in the diploid fish Sparus aurata", Biochemistry Journal., 326, pp 877-881 125 192 Sunyer, J.O., Zarkadis, I.K and Lambris, J.D (1998), "Complement diversity: a mechanism for generating immune diversity", Immunology Today, 19, pp 519-523 193 Swain, P., Dash, S., Sahoo, P.K., Routray, P., Sahoo, S.K., Gupta, S.D., Meher, P.K and Sarangi, N (2007), "Non-specific immune parameter of brood Indian major carp Labeo rohita and their seasonal variations", Fish Shellfish Immunol., 22, pp 38-43 194 Takahashi, A., Sato, Y., Shiomi, Y., Cantarelli, V.V., Iida, T., Lee, M and Honda, T (2000), "Mechanisms of chloride secretion induced by thermostable direct haemolysin of Vibrio parahaemolyticus in human colonic tissue and a human intestinal epithelial cell line", J Med Microbiol., 49, pp 801–810 195 Takeda, Y., Taga, S and Miwatani, T (1978), "Evidence that the thermostable direct hemolysin of Vibrio parahaemolyticus is composed of two subunits", FEMS Microbiol Lett., 4, pp 271–274 196 Tatner, M F (1996), Natural changes in the immune system of fish, The fish immune system: organism, pathogen and environment, Iwama G., Nakanishi T eds, Academic Press, USA, pp 255-287 197 Thanh, Bui Ngoc, Dalsgaard, A., Munangandu, H and Evensen, O (2009), Experimental infection and host response of tilapia Oreochromis niloticus to zoonotic metacercariae Haplorchis pumilio, Mahidol University, Thailand, accessed 29-5-2013, from http://www.tm.mahidol.ac.th/fbpz2009/fbpz2009present.htm 198 Thiery, R., Cozien, J , Cabon, J , Lamour, F , Baud, M and Schneemann, A (2006), "Induction of a protective immune response against viral nervous necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using betanodavirus virus-like particles", J Virol., 80, pp 10201 – 10207 199 Toranzo, A E., Magarinos, B and Romalde, J L (2005), "A review of main bacterial fish diseases in mariculture systems", Aquaculture, 246, pp 37-61 126 200 Towbin, H., Staehelin, T and Gordon, J (1979), "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications", Proc Natl Acad Sci USA., 76, pp 4350-4354 201 Tsang, V C W., Peralta, J M and Simons, A R (1983), "Enzyme-Linked Immunoelectro transfer Blot Techniques (Eitb) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel-electrophoresis", Methods in Enzymology, 92, pp 377-391 202 Twedt, R.M., Novelli, R.E., Spaulding, P.L and Hall, H.E (1970), "Comparative hemolytic activity of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrios", Infection and Immunity, 1, pp 394-399 203 Uribe, C , Folch, H , Enriquez, R and Moran, G (2011), "Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review", Veterinarni Medicina., 56(10), pp 486–503 204 Van Muiswinkel, W.B (2008), "A history of fish immunology and vaccination The early days", Fish Shellfish Immunol., 25, pp 397-408 205 Whitman, K.A (2004), Finfish and shellfish Bacteriology Manual Techniques and Procedures, Iowa State Press, 272 p 206 Whyte, K S (2007), "The innate immune response of finfish - A review of current knowledge", Fish Shellfish Immunol., 23, pp 1127 – 1151 207 Willett, C., Cortes, A., Zuasti, A and Zapata, A (1999), "Early hematopoiesis and developing lymphoid organs in the zebrafish", Developmental Dynamics, 214, pp 323-336 208 Wilson, M.R and Warr, G.W (1992), "Fish immunoglobulins and the genes that encode them", Annu Rev Fish Dis., 2, pp 201–221 209 Wong, H.C and Chen, Y.C (2003), "Analysis of the envelope proteins of heat-shocked Vibrio parahaenolyticus cells by immunoblotting and biotinlabeling method", Microbiol and Immunology, 47, pp 313-319 210 Wong, S.K., Zhang, X.H and Woo, N.Y.S (2012), "Vibrio alginolyticus thermolabile hemolysin (TLH) induces apoptosis, membrane vesiculation and necrosis in sea bream erythrocytes", Aquaculture, 330-333, pp 29-36 127 211 Yambot, A.V and Song, Y.L (2006), "Immunization of grouper, Epinephelus coioides, confers protection against a protozoan parasite, Cryptocaryon irritans", Aquaculture, 260, pp 1-9 212 Yeh, S.P., Chang, C.A., Chang, C.Y., Liu, C.H and Cheng, W (2008), "Dietary sodium alginate administration affects fingerling growth and resistance to Streptococcus sp and iridovirus, and juvenile non-specific immune responses of the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides", Fish Shellfish Immunol., 25, pp 19-27 213 Yeung, P.S.M and Boor, K.J (2004), "Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections", Foodborne pathogens and disease, 1(2), pp 74-88 214 Yii, K.C., Yang, T.I and Lee, K.K (1997), "Isolation and characterization of Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis in the groupers, Epinephelus coioides.", Current Microbiology, 35, pp 109-115 215 Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Gutierrez-De Frias, C and Cortes, A (2006), "Ontogeny of the immune system of fish", Fish Shellfish Immunol., 20, pp 126–136 216 Zexia, G., Weimin, W., Yi, Y., Abbas, K., Dapeng, L., Guiwei, Z and Diana, J.S (2007), "Morphological studies of peripheral blood cells of the Chinese sturgeon, Acipenser sinensis", Fish Physiol Biochem., 33, pp 213-222 217 Zhang, X H and Austin, B (2005), "A review haemolysins in Vibrio species", Journal of Applied Microbiology, 98, pp 1011–1019 218 Zhou, Y C., Wang, J , Zhang, B and Su, Y Q (2002), "Ultrasonic immunization of sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel), with a mixed vaccine against Vibrio alginolyticus and V anguillarum", J Fish Dis., 25, pp 325–331 219 Zorrilla, I., Arijo, S., Chabrillon, M., Diaz, P., Martinez-Manzanares, E., Balebona, M.C and Morinigo, M.A (2003), "Vibrio species isolated from diseased farmed sole, Solea senegalensis (Kaup), and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products", J Fish Dis., 26, pp 103-108 ... THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NI TẠI KHÁNH HỊA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP KHÁNH HỊA -... 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus? ?? kết nghiên cứu nghiêm... thể cá mú chấm cam chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin khơng có FIA .88 v 3.3.3 Đáp ứng miễn dịch dịch thể khả kháng bệnh cá mú chấm cam sau gây miễn dịch vi khuẩn Vibrio