Nghiên cứu gen dreb5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương glycine max l merrill

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - NGUYỄN HIỆP HÒA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HĨA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN Q TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - NGUYỄN HIỆP HỊA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HĨA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN Q TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHĨM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HỒNG MẬU Thái Ngun - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Vớp lòng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hồng Mậu, người hết lịng giúp đỡ động viên tơi q trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Di truyền học – trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, thầy cô bạn Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiên cho học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn bạn, đồng nghiệp người thân gia đình giúp đỡ động viên tơi hồn thành luận văn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các kết quả, số liệu nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Hiệp Hịa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Sơ lƣợc đậu tƣơng 1.1.2 Thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng 1.1.2.1 Protein dự trữ thành phần axit amin 1.1.2.2 Lipit, vitamin số chất khác 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊUHẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1 Cơ sở liên quan đến tính chịu hạn thực vật 1.2.2 Cơ chế sinh lý học di truyền học tƣợng chống chịu hạn thực vật 1.2.3 Nghiên cứu khả phản ứng đậu tƣơng hạn 1.2.3.1 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn hạt nảy mầm 1.2.3.2 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn non 1.3 NGHIÊN CỨU NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB 1.3.1 Gen DREB 1.3.2 Nghiên cứu DREB5 phƣơng pháp RT-PCR Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật 2.1.2 Các hoá chất thiết bị 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp sinh lý 2.2.1.1 Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non phƣơng pháp gây hạn nhân tạo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 7 10 10 10 12 12 13 13 14 16 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 22 23 23 26 28 28 28 28 29 29 29 2.2.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 2.2.2.2 Kỹ thuật RT-PCR 2.2.2.3 Phƣơng pháp tinh sản phẩm RT-PCR 2.2.2.4 Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 2.2.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 2.2.2.6 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) 2.2.2.7 Tách chiết plasmid 2.2.2.8 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotit 2.3.1 Phƣơng pháp xử lí số liệu 2.3.1.1 Phƣơng pháp thống kê chƣơng trình Excel 2.3.1.2 Phƣơng pháp xử lý trình tự gen Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC, KHỐI LƢỢNG 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thƣớc, khối lƣợng giống đậu tƣơng 3.1.2 Tỷ lệ thiệt hại 3.1.3 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DREB5 TỪ ĐẬU TƢƠNG 3.2.1 Tách chiết RNA từ mầm giống 3.2.2 Kết RT-PCR tạo DNA 3.2.3 Kết dịng hóa sản phẩm gen DREB5 vector tách dòng 3.2.4 Kết giải trình tự gen mã hóa DREB5 3.2.5 So sánh trình tự nucleotit DREB5 Xanh tiên đài Việt Nam DREB5 EF 583447 ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc phần mềm Bioedit KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 30 32 34 35 37 37 37 38 38 38 39 40 40 40 42 43 46 46 47 48 49 53 57 57 67 58 59 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid cDNA : Complementary DNA LEA : Late embryogenesis abundant MGPT : Môi giới phân tử PCR : Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polimerase RT-PCR : Reverse-transcription PCR – PCR ngƣợc sHSP : Small heat shock protein – protein sốc nhiệt nhỏ từ 10-30kDa bp : Cặp bazơ dNTP : Nucleotitde EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid IPTG : Isopropyl – β – D – thiogalactopyranoside LB : Laruia Bertani TAE : Tris – Acetate – EDTA X – gal : 5-Bromo-chloro-3-indolyl– β – D –galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 2.1 Danh sách giống đậu tƣơng nghiên cứu 28 Bảng 2.2: Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR 26 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng chu trình nhiệt PCR 34 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dịng pCR®2.1TOPO®…………………………………………………………………… 35 Bảng 3.1 Mầu sắc, khối lƣợng, kích thƣớc hạt đậu tƣơng nghiên cứu 41 Bảng 3.2 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tƣơng giai đoạn non (%) 42 Bảng 3.3 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối giống đậu tƣơng 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 1.1: Cơ chế biểu DREB1A lúa gặp hạn hán 25 Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp cDNA 26 Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) 36 Hình 3.1 Hình dạng hạt đậu tƣơng nghiên cứu 40 Hình 3.2 Đậu tƣơng trƣớc xử lí hạn 43 Hình 3.3 Đậu tƣơng sau xử lí hạn ngày 44 Hình 3.4 Đậu tƣơng sau xử lí hạn 15 ngày 44 Hình 3.5 Ảnh điện di RNA tổng số gel agarose 1% 46 Hình 3.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm RT-PCR 47 Hình 3.7: Đĩa nuôi cấy xuất khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh 48 Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit cắt Hind III 49 Hình 3.9 Hình ảnh Sequence chuỗi DREB5 51 Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 đậu tƣơng Xanh Tiên Đài – Việt Nam 52 Hình 3.11 So sánh trình tự gen DREB5 đậu tƣơng Xanh tiên đài Việt nam EF 583447 có ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tƣơng Trung quốc 55 Hình 3.12 So sánh trình tự axit amin DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam giống đậu tƣơng có mã số EF 583447.1 Trung Quốc có ngân hàng gen quốc tế 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tƣơng có tên khoa học (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), lƣơng thực có tầm quan trọng bậc giới nhƣ Việt Nam Để có vị trí nhƣ vậy, nhờ đậu tƣơng có đặc tính ƣu việt giống đậu khác là: Hàm lƣợng protein lipit hạt cao: protein từ 32% đến 40%, lipit từ 12% đến 25%, gluxit (10-15%), chứa nhiều loại vitamin Các sản phẩm quen thuộc đậu tƣơng nhƣ đậu phụ, tƣơng, dầu ăn có vai trò quan trọng đời sống hàng ngày ngƣời Gần nhà khoa học nghiên cứu phát đậu tƣơng có vai trò chữa điều trị bệnh nam y nhƣ ung thƣ, tim mạch Đậu tƣơng cịn giải phần vấn đề nóng bỏng giới lƣợng từ sản phẩm Ngồi đậu tƣơng họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thơng qua việc cố định đạm nốt sần rễ, góp phần làm giảm lƣợng phân hóa học bón xuống đất, nguyên nhân gây thoái hóa đất Trên giới đậu tƣơng đƣợc ứng dụng sản xuất quy mô lớn phát triển mạnh mẽ nƣớc Nam Mỹ nhƣ Brazil, Argentina, Canada nhƣng lớn phải kể đến Mỹ gần Trung Quốc Hàng năm họ sản xuất đƣa thị trƣờng giới hàng triệu tấn/năm, điều góp phần giải vấn đề đƣợc coi nóng giới nhƣ lƣợng, ô nhiễm Ở Việt Nam, nƣớc trồng đậu tƣơng lâu đời nhƣng sản lƣợng hàng năm thấp ngành sản xuất đậu tƣơng nƣớc ta mức thấp so với giới Nguyên nhân vấn đề sử dụng giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sản phẩm DNA gen DREB5 giống đậu tƣơng Trung quốc có ngân hàng gen 0,927kb Chính sử dụng sản phẩm PCR để biến nạp tách dịng 3.2.3 Kết dịng hóa sản phẩm gen DREB5 vector tách dòng Sau thu nhận DNA thuộc gen DREB có đậu tƣơng RTPCR, chúng tơi tiến hành tách dịng gen Tách dịng cách chuyển nạp sản phẩm RT- PCR vào tế bào Ecoli chủng DH5- tiến hành nuôi cấy mơi trƣờng LB-agar có bổ sung Kanamycin X-gal, để qua đêm kết thu đƣợc đƣợc thể hình 3.7 Hình 3.7: Đĩa ni cấy xuất khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh Chọn lọc khuẩn lạc trắng nuôi cấy vào môi trƣờng LB lỏng, tốc độ lắc 200 vòng/phút 37oC qua đêm Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại cách ly tâm tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp kít AccuPrep Plasmid Extraction hãng Bioneer, kiểm tra sản phẩm DNA plasmid enzym giới hạn EcoRI điện di kiểm tra thạch agarose 1% Kết tách dòng gen DRED5 cắt kiểm tra EcoRI đƣợc trình bày Hình 11 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn M 4kb 3,9kb 1kb 0,93kb Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit cắt enzym giới hạn EcoRI M: marker Lamda cắt Hind III Hai dòng DNA plasmid mang gen DREB5 có độ dài khoảng 0,93kb 3.2.4 Kết giải trình tự gen mã hóa DREB5 Plasmit tái tổ hợp sau đƣợc tinh đƣợc sử dụng phản ứng đọc trình tự, thành phần phản ứng đƣợc trình bày phần phƣơng pháp nghiên cứu Sau đọc trình tự nucleotit máy xác định trình tự tự động, sử dụng phần mềm DNAstar chromas để phân tích trình tự gen Trình tự gen DREB5 đậu tƣơng đƣợc xác định dài 924 bp Kết đọc quang phổ thể hình 3.9: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9 Hình ảnh Sequence chuỗi DREB5 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết đọc trình tự gen DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài đƣợc trình bày hình 3.10 ATGCAATTCC CTCACCAATT TGGAACCACA ACAAACTCAC CTTTCCCTCA CCCATCTTTC CAAAACCAGC AACACCAGAT GATATCATTT GGGTCTTCCC AACAACATAA CAATCTCGCA TATCCACCAA TCATAGCCCG AGATTCTTCT TCACTTGTAC ATCATCATCA TCAACAACAA CAACAGCATC AGCAGCAACT TCTTCAGTAT TGGAGTGGCG CGTTGAATCT AAGTCCAAGA GGAATGTTAA CAAGGTTGGG GCCAGATGGA AGGCCATTGT TTAGTCCTCC AACACAGCGC ATAAACACAA CAAAACTCTA TAGGGGAGTG AGGCAACGCC ATTGGGGCAA ATGGGTCGCT GAAATCCGTC TTCCACGAAA CAGAACGCG TCTCTGGCTA GGCACATTTG ACACGGCCGA AGACGCCGCC ATGGCCTACG ACCGCGAAGC CTTCAAGCAA CGAGGAGAGA ATGCAAGGCT CAATTTCCCC GAATTGTTCT TCAACAAGGA CAAAAAAGAA CAAGGAGAAG AAGAAGCTTC TTCGCCGGTT CTTTCGGCTA TTGCAAAGCA GAATGAACCT CCTCCTGCCC ACCACCGTGA CGTCACGATA GAAGAGTCTA ACGAAAATGA CTCAGGTGAC GCCACCGTGA GCGACGAGGT TCATGCTCCT GCTGCTACAG CGAGTTCCGA AGGGGTTTCT CAGGAACTGG TTTGGGGAGA AATGTCTGCA TGGTTCAATG CTATTCCTGC TGCTTGGGGTC CTGGTAGTCC CATGTGGGAT GATTTGGATG CCACCAATAA TCTTCTTTGC CAATCACACA TTCCTTTTTC CAATCCCAAT CAACAACAGT TCAATGATGC TGATGATGCT CAGAGACAGG AACAAAACAC AGGACCAGGT TACCTGTGGA AGGATCAGGA TTGA Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 đậu tƣơng Xanh Tiên Đài – Việt Nam Theo trình tự gen DREB5 gồm 924bp mạch nghiên cứu có 207 T, 268 A, 190 G 259 C Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.5 So sánh trình tự nucleotit DREB5 Xanh tiên đài Việt Nam DREB5 EF 583447 ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc phần mềm Bioedit Kết so sánh trình tự nucleotit gen DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài – Việt Nam với gen DREB5 giống đậu tƣơng Trung Quốc có mã số EF583447.1 (Genbank) đƣợc trình bày hình 3.11 EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGCAATTCC CTCACCAATT TGGAACCACA ACAAACTCAC CTTTCCCTCA ATGCAATTCC CTCACCAATT TGGAACCACA ACAAACTCAC CTTTCCCTCA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 CCCATCTTTC CAAAACCAGC AACACCAGAT GATATCATTT GGGTCTTCCC CCCATCTTTC CAAAACCAGC AACACCAGAT GATATCATTT GGGTCTTCCC EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 AACAACATAA TAATCTCGCA TATCCACCCA TCATAGCCAG TGATTCTTCT AACAACATAA CAATCTCGCA TATCCACCAA TCATAGCCCG AGATTCTTCT EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TCACTTCTAC ATCAACATCA TCATCATCAA CAGCAGCATC AGCAGCACCA TCACTTGTAC ATCATCATCA TCAACAACAA CAACAGCATC AGC - EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 GCAGCAACTT CTTCAGTATT GGAGTGACGC GTTGAATCTA AGTCCAAGAG AGCAACTT CTTCAGTATT GGAGTGGCGC GTTGAATCTA AGTCCAAGAG EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 GAATGTTAAC AAGATTGGGA CCAGATGGAA GGCCATTGTT TAGGCTTCCA GAATGTTAAC AAGGTTGGGG CCAGATGGAA GGCCATTGTT TAGTCCTCCA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 ACACAGCCCA TAAACACAAC AAAACTCTAT AGAGGAGTGA GGCAACGCCA ACACAGCGCA TAAACACAAC AAAACTCTAT AGGGGAGTGA GGCAACGCCA | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn EF 583447 Xanhtiendai TTGGGGGAAA TGGGTCGCTG AAATCCGTCT TCCACGAAAC AGAACGCGTC TTGGGGCAAA TGGGTCGCTG AAATCCGTCT TCCACGAAAC AGAACGCGTC EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 TCTGGCTAGG CACATTTGAC ACGGCCGAAG ACGCCGCCAT GGCCTACGAC TCTGGCTAGG CACATTTGAC ACGGCCGAAG ACGCCGCCAT GGCCTACGAC EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 CGAGAAGCCT TCAAGCTACG AGGAGAGAAT GCTAGACTCA ATTTCCCAGA CGCGAAGCCT TCAAGCAACG AGGAGAGAAT GCAAGGCTCA ATTTCCCCGA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 ATTGTTCCTC AACAAGGACA AAAAAGAAGA ACAACAACAA CAAGAACAAG ATTGTTCTTC AACAAGGACA AAAAAG -AACAA GGAGAAGAAG EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 AAGCTTCTTC GCCAGTTCTT TCAGCTATTG CAAAGCAGCA TGAGCCTTCT AAGCTTCTTC GCCGGTTCTT TCGGCTATTG CAAAGCAGAA TGAACCTCCT EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 AGTG -AAC ACCGTGACGT CCCCATAGAA GAGTCTAATG AGAATGATTC CCTGCCCACC ACCGTGACGT CACGATAGAA GAGTCTAACG AAAATGACTC EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 GGGTGACGCC ACGGTGAGCG ATGA -CCA GGTTCATGCT ACTACTGAGA AGGTGACGCC ACCGTGAGCG ACGAGGTTCA TGCTCCTGCT GCTACAGCGA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 GTTCCGAAGG AGTTTCTCAG GAAATGGTTT GGGGAGAAAT GTCTGCATGG GTTCCGAAGG GGTTTCTCAG GAACTGGTTT GGGGAGAAAT GTCTGCATGG EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 TTCAATGCTA TTCCTGCTGC TTGGGGTCCT GGTAGTCCCA TGTGGGATGA TTCAATGCTA TTCCTGCTGC TTGGGGTCCT GGTAGTCCCA TGTGGGATGA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 TTTGGATGCC ACCAATAATC TTCTTTGCCA ATCACACATT CCTTTTTCCA TTTGGATGCC ACCAATAATC TTCTTTGCCA ATCACACATT CCTTTTTCCA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 ATCCCAATCA ACAAGAACTC AATGATGCTG A - GAGACAAGAA ATCCCAATCA ACAACAGTTC AATGATGCTG ATGATGCTCA GAGACAGGAA EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | 910 920 930 940 CAAAACACTG GACCAGGTTA CTTGTGGAAG GATCAGGATT GA CAAAACACAG GACCAGGTTA CCTGTGGAAG GATCAGGATT GA Hình 3.11 So sánh trình tự gen DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam EF 583447 có ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tƣơng Trung Quốc Theo hình 3.11 chúng tơi xác định đƣợc vị trí khác trình tự nucleotit nhƣ sau: - Gen DREB Xanh Tiên Đài Việt Nam khơng có nucleotit ứng với vị trí từ 193 đến 202 (AGCACCA GC)và từ vị trí 527 đến 535 (AAGA ACAAC)so với EF583447 - EF583447 Trung Quốc khơng có nucleotit ứng với vị trí từ 605 đến 607 (CCC) 675 đến 677 (GGT)và từ 882 đến 890 (TGATGCTCA) Theo kết chúng tơi xác định đƣợc tƣơng đồng trình tự gen DREB5 hai giống đạt 90,4% Việc nghiên cứu gen đó, ngồi trình tự nucleotit ngƣời ta cịn quan tâm đến trình tự axit amin phân tử protein sản phẩm của gen Trên sở phần mềm BioEdit chúng tơi tiến hành so sánh trình tự axit amin suy diễn tạo từ gen DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam gen DREB5 có mã số EF 583447.1 ngân hàng gen có nguồn gốc từ Trung Quốc đƣợc trình bầy hình 3.12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MQFPHQFGTT TNSPFPHPSF QNQQHQMISF GSSQQHNNLA YPPIIASDSS MQFPHQFGTT TNSPFPHPSF QNQQHQMISF GSSQQHNNLA YPPIIARDSS EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 SLLHQHHHHQ QQHQQHQQQL LQYWSDALNL SPRGMLTRLG PDGRPLFRLP SLVHHHH - QQQQQHQQQL LQYWSGALNL SPRGMLTRLG PDGRPLFSPP EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 TQPINTTKLY RGVRQRHWGK WVAEIRLPRN RTRLWLGTFD TAEDAAMAYD TQRINTTKLY RGVRQRHWGK WVAEIRLPRN RTRLWLGTFD TAEDAAMAYD EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 REAFKLRGEN ARLNFPELFL NKDKKEEQQQ QEQEASSPVL SAIAKQHEPS REAFKQRGEN ARLNFPELFF NKDKKE Q- GEEEASSPVL SAIAKQNEPP EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 -SEHRDVPIE ESNENDSGDA TVSDD-QVHA TTESSEGVSQ EMVWGEMSAW PAHHRDVTIE ESNENDSGDA TVSDEVHAPA ATASSEGVSQ ELVWGEMSAW EF 583447 Xanhtiendai | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 FNAIPAAWGP GSPMWDDLDA TNNLLCQSHI PFSNPNQQEL N -DAERQE FNAIPAAWGP GSPMWDDLDA TNNLLCQSHI PFSNPNQQQF NDADDAQRQE EF 583447 Xanhtiendai | | 310 QNTGPGYLWK DQD QNTGPGYLWK DQD Hình 3.12 So sánh trình tự axit amin DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam giống đậu tƣơng có mã số EF 583447.1 Trung Quốc có ngân hàng gen quốc tế Theo kết Xanh tiên đài Việt Nam khơng có axit amin vị trí từ 58-60 (ứng với HHQ ), 177,178, 180 (ứng với EQQ) EF 583447 Trung Quốc axit amin vị trí 201(ứng với P), 292-294 (ứng với DAD) Sự tƣơng đồng hai giống trình tự axit amin đạt 87,8% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Các giống đậu tƣơng nghiên cứu đa dạng đặc điểm hình thái, kích thƣớc khối lƣợng hạt Hạt giống địa phƣơng thƣờng có kích thƣớc nhỏ, đa dạng hình dạng, mầu sắc hạt nhƣ mầu rốn hạt, giống đậu tƣơng lai thƣờng có kích thƣớc lớn 1.2 Các giống đậu tƣơng địa phƣơng có khả chịu hạn tốt giống lai, số chịu hạn tƣơng đối giống đậu tƣơng BD cao (41,03), nhỏ ĐT84 (21,22) 1.3 Đã thiết kế, tổng hợp cặp mồi DREBsoy5F-DREBsoy5R khuếch đại thành công gen DREB5 từ mRNA giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, tách dòng xác định trình tự gen DREB5 từ giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài, gen có kích thƣớc 924bp 1.4 Trình tự nucleotit gen DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam trình tự gen DREB có mã số EF 583447.1 giống đậu tƣơng Trung Quốc có độ tƣơng đồng đạt 90,4% Trình tự axit amin protein hai gen có độ tƣơng đồng đạt 87,8% ĐỀ NGHỊ Tiếp tục phân tích so sánh trình tự gen DREB5 giống đậu tƣơng thuộc nhóm chịu hạn tốt với nhóm chịu hạn để xác định mối liên quan thay đổi cấu trúc gen DREB5 với khả chịu hạn đậu tƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Nguyễn Hiệp Hịa, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2010) “Phân lập gen DREB5 từ đậu tương” Tạp chí khoa học cơng nghệ Đại học Thái Nguyên số tháng 10 năm 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thi Lang(2003), sở di truyền tính chống chịu thiệt hại mơi trƣờng lúa, Nxb Nông nghiệp Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hóa sinh, Nxb Giáo dục Ngơ Thế Dân cộng (1999), Cây đậu tƣơng, Nxb Nông Nghiệp Lê Thi Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải (2007) Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(1): 1-18 Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2006), Sƣu tập, đánh giá nghiên cứu khả chịu hạn số giống đậu tƣơng địa phƣơng tỉnh Sơn La, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tƣơng có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội Ngơ Thị Liêm, Chu Hồng Mậu (2006),“Đặc điểm phản ứng giống lạc điều kiện hạn sinh lý” Tạp chí nơng nghiệp PTNT, (84), tr 82- 87 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tƣơng, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phƣơng pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tƣơng đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 11 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phƣơng pháp sinh học phân tử, Nxb Đại học Sƣ phạm 12 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội 13 Đinh Thị Ngọc (2008), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn số giống đậu tƣơng địa phƣơng trồng vùng Tây Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 14 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội 15 Hà Tiến Sỹ (2007), “Khả chịu hạn số giống đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) điạ phƣơng tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ , Đại học Thái Nguyên, số (43), 13-19 16 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 17 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm - Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn 18 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngƣ nghiệp máy vi tính, NXB Nơng nghiệp Hà Nội TIẾNG ANH 19 Chen M, Wang QY, Cheng XG, Xu ZS, Li LC, Ye XG, Xia LQ, Ma YZ.(2006) GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants Plant Mol Biol, 6(1): 20 Dubouzet, J.G., Y Sakuma, Y Ito, M Kasuga, E.G Dubouzet, S Miura, M Seki, K Shinozaki, and K Yamaguchi-Shinozaki 2003 OsDREB genes in rice, Oryza satival L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression Plant J 33:751–763 21 Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K (2004 ) A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stressinducible RD29A promoter improved drought- and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer Plant Cell Physiol 45 346– 350 22 Maruyama K, Sakuma Y, Kasuga M, Ito Y, Seki M, et al (2004) dentification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems Plant J 38: 982-993 23 Ming Chen,Qiao-Yan Wang, Xian-Guo Cheng, Zhao-Shi Xu, LianCheng Li, Xing-Guo Ye, Lan-Qin Xia and You-Zhi Ma (2006) GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants Plant Mol Biol, 5(1): 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 24 Mei Zhang, Wei Liu, Yu-Ping Bi (2009) Dehydration-responsive element-binding (DREB) transcription factor in plants and its role during abiotic stresses Plant Cell 10 1381–1400 25 Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., YamaguchiShinozaki, K., and Shinozaki, K (1998 ) Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and lowtemperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis Plant Cell 10 1391–1406 26 Shinozaki K, Yamaguchi SK, Seki M (2003) Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses Curr Opin Plant Biol 6: 410-417 27 Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, et al (2002) DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and coldinducible gene expression Biochem Biophys Res Commun 290: 9981009 28 Prorcel R, Ruiz-Lozano JM (2004) “ Arbuscular mycorrhizal ìnluence on leaf water potential, solute accumulation, and oxidative stress in soybean plants subjected to drought stress”, J Exp Bot 55 (403), 1743-50 29 Yanfang Yang, Jian Wu, Kai Zhu, Liqing Liu, Fadi Chen and Deyue Yu (2007), “Identification and characterization of two chrysanthemum (Dendronthema moriforlium) DREB genes, belonging to the AP2/EREBP family” Plant Physiol, 132 (4) 1933-42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... HIỆP HÒA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HĨA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN Q TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L. ) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN... gen chịu hạn đƣợc quan tâm nghiên cứu Từ l? ? chúng tơi tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ l? ?: ? ?Nghiên cứu gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến q trình phiên mã nhóm gen chịu hạn đậu tƣơng [Glycine. .. [Glycine max (L. ) Merrill]? ?? Mục tiêu đề tài So sánh khả chịu hạn giống đậu tƣơng xác định đặc điểm cấu trúc gen DREB5 đậu tƣơng Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả chịu hạn giống đậu tƣơng giai đoạn đậu