Thông tin tài liệu
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MƠ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS ĐỒ THỊ THẢO HÀ NỘI – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi nhận bảo, hướng dẫn tận tình thầy cô, giúp đỡ chân thành đồng nghiệp Với tất lịng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới TS Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phịng Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình làm việc suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái nguyên Phòng Thử nghiệm sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm anh, chị đồng nghiệp phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln ủng hộ giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Cúc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cƣ́u đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ung thƣ 2.1.1 Tình hình bệnh ung thư giới Việt Nam 2.1.2 Đặc tính nguyên nhân ung thư 2.1.2.1 Các đặc tính của bệnh ung thư 2.1.2.2 Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn 2.1.3 Phân loại ung thư 2.1.4 Tác nhân gây bệnh ung thư 2.1.4.1 Tác nhân hóa học 2.1.4.2 Tác nhân sinh học 2.1.5 Cơ chế di tế bào ung thư 2.1.6 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 2.2 Giới thiệu RNAi 2.2.1 Dịng thơng tin di truyền tế bào 2.2.2 Khái niệm vai trò RNAi tế bào 2.2.2.1 Khái niệm 2.2.2.2 Vai trò của RNAi 2.2.2.3 Thành phần RNAi 2.2.3 Lịch sử nghiên cứu siRNA 2.2.4 Cơ chế RNAi 2.2.4.1 Cơ chế chống lại virus gene nhảy của RNAi 2.2.4.2 Cơ chế làm tắt gene siRNA 2.2.5 Ứng dụng việc nghiên cứu RNAi 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1 Ứng dụng RNAi nghiên cứu ung thư 10 2.2.5.2 Ứng dụng RNAi việc tạo Hoa Hồng Xanh 10 2.2.5.3 Ứng dụng RNAi việc trừ sâu bệnh 11 2.2.5.4.Các ứng dụng khác của RNAi 11 2.2.6 Ý nghĩa RNAi 11 2.2.7 Khái niệm knock-down gene 11 2.3 Những hiểu biết Enzyme sialyltransferase (ST) 12 2.3.1 Enzyme sialyltransferase di tế bào ung thư 12 2.3.2 Khái niệm Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16 2.3.3 Phân loại Enzyme sialyltransferase 17 2.3.4 Mơ hình tác động hệ Enzyme sialyltransferase 18 2.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài 19 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị nghiên cứu 20 3.1.1 Vật liệu 20 3.1.2 Hoá chất 20 3.1.3 Thiết bị 21 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21 3.3.2 Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I siRNA nhờ lipofectamin 22 3.3.3 Phân tích so sánh hình thái tế bào sau bị knock-down 23 3.3.4 Xác định khả sống sót tế bào sau chuyển nhiễm 23 3.3.5 Thu nhận RNA tổng số RNeasy Mini Kit Qiagen 23 3.3.6 Kiểm tra hiệu knock-down gene RT-PCR theo kit Applied Biosystem 23 3.3.7 Thu nhận Glycoprotein màng tế bào MCF7 24 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số 25 3.3.9 Phương pháp điện di gel 25 3.3.10 Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu protein 26 3.3.11 Phương pháp nhuộm gel siver staining 26 3.3.12 Phương pháp in-gel digestion 27 3.3.13 Phương pháp phân tích khối phổ 28 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Hình thái tế bào MCF7 sau knock-down gene ST3Gal-I siRNA 29 4.2 Khả phát triển tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm siRNA 30 4.3 Hiệu knock-down gene 31 4.4 Biểu protein tổng số gene ST3Gal-I bị knock-down 34 4.5 Biểu số protein gene ST3Gal-I bị knock-down 35 4.6 Hàm lƣợng Glycoprotein màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm 37 4.7 Nhuộm bạc 40 4.8 Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Giới thiệu số dạng liên kết phân tử amino acid với phân tử đường tự nhiên 13 Bảng 4.1 Giá trị OD trung bình bước sóng 570 nm 29 Bảng 4.2 Hàm lượng RNA tổng số mẫu 30 Bảng 4.3 Hiệu knock-down gene ST3Gal-I sau chuyển nhiễm siRNA 32 Bảng 4.4 Hàm lượng Glycoprotein thu từ tế bào chuyển nhiễm siRNA 37 Bảng 4.5 Kết phân tích khối phổ protein 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Vị trí gene ST3Gal-I 16 Hình 2.2 Mơ hình tác động hệ enzyme ST có ST3Gal-I 18 Hình 4.1 Hình ảnh tế bào MCF7 sau ngày chuyển nhiễm độ phóng đại 20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào chuyển nhiễm siRNA 28 Hình 4.2 Sự sống sót phát triển tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm siRNA 30 Hình 4.3 Định lượng RNA tổng số mẫu thu hệ thống NanoDrop Thermo Scientific 31 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn tương quan nồng độ BSA giá trị OD thu 33 Hình 4.5 Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số mu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 35 Hình 4.6 Ảnh Western-blot protein Actin, Akt, GSK, P42/44 PODCL mẫu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 37 Hình 4.7 Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining glycoprotein màng mẫu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Akt Protein Kinase B ANKRD46 ankyrin repeat domain 46 bp Base pair cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Môi trường nuôi cấy tế bào dsRNA RNA sợi đôi EDTA Ethylenediamintetraacetic acid FBS Phosphate bufer saline (huyết phơi bị) Gal Nac N-acetylgalactosamin Hela S3 Dịng tế bào ung thư vú HT-29 Dòng tế bào ung thư ruột người NFkB-p65 nuclear factor kappa from B cells MCF7 Dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư vú miR 21 microRNA 21 miRNA Micro Ribonucleic acid mRNA RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid) Neu5Ac N-acetylneuraminic acid PI3K Rapid Immunofilter Paper Assay RIPA Phosphatidylinositol 3-kinases rpm Revolutions per minute RISC RNA – incluced silencing complex RNA Ribonucleic acid RNAi RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn RNAse III Ribonuclease III RT-PCR phản ứng Real time Polymerase chain reaction ser/ther serine/threonine siRNA Small interference RNA/short interference RNA ssRNA Single strand RNA ST3Gal-I 2,3 Sialyltransferase galatose SW480 Dòng tế bào ung thư ruột kết người TBUT Tế bào ung thư WHO Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.4 Hàm lượng Glycoprotein thu từ tế bào chuyển nhiễm siRNA Mẫu thí OD nghiệm Hàm lƣợng Hàm lƣợng Mẫu chuẩn (mg/ml) BSA OD BSA (mg/ml) H2O 0.060 0.000 BSA 0.125 0.269 0.125 RIPA 0.076 0.000 BSA 0.25 0.423 0.250 Control 4X 0.996 3.262 BSA 0.5 0.673 0.500 ST3Gal-I 4X 1.127 3.773 BSA 1.0 1.163 1.000 1.4 y = 1.0101x + 0.1587 1.2 R = 0.9989 0.8 Series1 Linear (Series1) 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn tương quan nồng độ BSA giá trị OD thu Đường chuẩn tương quan nồng độ BSA giá trị OD thu được thiết lập nhờ phần mềm EXCEL Như vậy, mối tương quan hàm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lượng BSA giá trị OD hiển thị đường y = 1,0101x + 0,1587 với hệ số tương quan r2 = 0,9989, thể mối tương quan chặt tin cậy số liệu thu Dựa vào giá trị mật độ quang OD có mẫu kiểm tra (giá trị Y) theo phương trình tính tốn nhờ vào mẫu chuẩn BSA, ta có hàm lượng glycoprotein tế bào chuyển nhiễm scramble RNA 3,262 mg/ml (đối chứng) tế bào chuyển nhiễm siRNA 3,377 mg/ml Như vậy, hàm lượng glycoprotein thu tương đối lớn đủ để thực thí nghiệm điện di, nhuộm bạc phục vụ cho phân tích khối phổ Theo đó, mẫu protein điều chỉnh để có hàm lượng 1mg/ml cho vào ống nhỏ cất giữ lâu dài -80oC để phục vụ cho thí nghiệm 4.7 Nhuộm bạc Nhuộm bạc phương pháp nhuộm nhạy protein sử dụng nhuộm gel điện di để đánh giá tinh khiết mẫu protein Nhuộm bạc cho phép phát cách nhanh chóng, xác nhạy băng protein gel ngoại trừ protein không phân tách gel Đồng thời nhuộm bạc phương pháp phù hợp để phân lập băng protein sai khác mẫu phục vụ cho việc phân tích khối phổ sau Vì thế, lượng glycoprotein thu màng tế bào sau gene ST3Gal-I bị knock-down tiến hành điện di nhuộm bạc để phát sai khác Kết trình nhuộm bạc trình bày hình 4.7 Với hàm lượng Glycoprotein thu màng tế bào sau gene ST3Gal-I bị knock-down trên, tiến hành điện di nhuộm bạc để phát sai khác sau gene ST3Gal-I bị knock-down Từ tiến hành in-gel digestion để chuẩn bị mẫu cho trình phân tích khối Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phổ Các kết phân tích phổ khối (Mass spectrophotometer - MS) giúp nhận dạng sai khác glycoprotein sau gene ST3Gal-I bị knock-down phần cho phép tìm hiểu mối liên quan ST3Gal-I đặc tính di tế bào ung thư Kết nhuộm bạc trình bày hình 4.7 ST3 SC Ledder kDa 250 130 100 70 55 35 25 15 10 Hình 4.7 Hình ảnh nhuộm bạc glycoprotein màng mẫu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) Kết nhuộm bạc cho thấy băng protein thu rõ ràng Hình ảnh cho thấy băng protein kích thước khoảng 35 kDa, 60 kDa, 70 kDa 100 kDa có sai khác rõ rệt mẫu đối chứng (SC) mẫu knock-down gene ST3Gal-I (ST3) Vì vậy, băng protein cắt khỏi gel đưa vào hệ thống thí nghiệm in-gel digestion phục vụ cho thí nghiệm phân tích khối phổ nhằm kiểm tra sai khác protein có mặt băng mẫu nghiên cứu 4.8 Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS Phân tích phổ khối kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượng/điện tích ion Khối phổ MALDI-TOF-MS có nhiều ứng dụng, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đặc biệt ứng dụng công nghệ sinh học để xác định biểu protein Các protein ion hóa theo phương pháp MALDI-TOF-MS protein dạng dư thừa nhiều có xu hướng giảm tín hiệu so với protein dư thừa Sau nhuộm bạc, tiến hành in-gel digestion gửi phân tích khối phổ Các kết phân tích phổ khối (Mass spectrophotometer - MS) giúp nhận dạng sai khác glycoprotein màng tế bào gene ST3Gal-I bị knock-down Kết phân tích khối phổ thu kho liệu khổng lồ biểu glycoprotein Tuy nhiên, luận văn chúng tơi trình bày kết phân tích khối phổ glycoprotein (DAG1, CD46, LAMP2) màng tế bào MCF7 Bảng 4.5 Kết phân tích khối phổ protein Mass: 97381 Score: 49 Queries Tax_Id=9606 Gene_Symbol=DAG1 Dystroglycan matched: emPAI: 0.07 Query Observed Mr(expt) Mr(calc) ppm Miss Score Expect Rank Peptide 1803 400.5628 1198.6666 1198.6670 -0.33 39 0.0098 K.LREQQLVGEK S 1802 1804 1805 Mass: 44209 Score: 63 Queries Tax_Id=9606 Gene_Symbol=CD46 Isoform B of matched: emPAI: 0.07 Membrane cofactor protein Query Observed Mr(expt) Mr(calc) ppm Miss Score Expect Rank Peptide 2512 687.8132 1373.6118 1373.6099 1.41 41 0.005 K.ADGGAEYATY QTK.S 2511 Query Observed Mr(expt) Tax_Id=9606 Gene_Symbol=LAMP2 Isoform LAMP-2A of Lysosome-associated membrane glycoprotein ppm Mr(calc) Miss Score Expect Rank Peptide 903 494.2806 986.5466 986.5549 -8.37 Mass: 44932 Score: 69 matched: emPAI: 0.07 Queries 61 8e-005 R.IPLNDLFR.C 04 Kết bảng 4.5 cho thấy protein có sai khác mẫu đối chứng mẫu knock-down gene ST3Gal-I Các protein mẫu bị knock-down gene ST3Gal-I không thấy xuất xuất với Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hàm lượng thấp nhiều so với mẫu đối chứng (không bị knock-down gene ST3Gal-I là: (i) protein DAG1 - Dytroglycan, khối lượng phân tử 37,73 kDa (từ băng 35 kDa); (ii) CD46 - Isofrom B membrane cofactor protein khối lượng phân tử 55-65 kDa (từ băng 60 kDa); (iii) LAMP2 Isoform LAMP-2 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2, khối lượng phân tử 100 kDa (từ băng 105 kDa)) Sư sai khác protein mẫu đối chứng mẫu knock-down có ý nghĩa thống kê (p
Ngày đăng: 25/03/2021, 08:18
Xem thêm:
