Nghiên cứu sử dụng nước thải chế biến tinh bột sắn để nuôi cấy bacillus thuringiensis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYEN SINH VẬT TRẦN HÀ NINH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN TINH BỘT SẮN ĐỂ NUÔI CẤY Bacillus thuringiensis LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYEN SINH VẬT Trần Hà Ninh NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN TINH BỘT SẮN ĐỂ NUÔI CẤY Bacillus thuringiensis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TĂNG THỊ CHÍNH – VIỆN CƠNG NGHỆ MƠI TRƯỜNGVIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật MC LC MC LC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Tổng quan Bacillus thuringiensis 10 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 1.1.2 Độc tố delta-endotoxin Bacillus thuringiensis chế tác động chúng 11 1.1.3 Khái quát thuốc trừ sâu sinh học 16 1.1.4 Nghiên cứu, sản xuất ứng dụng Bt Việt Nam 20 1.2 Tổng quan tình hình sản xuất tiêu thụ tinh bột sắn 24 1.2.1 Thơng tin chung tình hình canh tác tiêu thụ sắn 24 1.2.3 Công nghệ sản xuất tinh bột sắn 31 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật sử dụng 37 2.1.2 Nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn 37 2.1.3 Thiết Bị 37 2.1.4 Môi trƣờng tổng hợp TSB 37 2.2 Phƣơng pháp 38 2.2.1 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử 38 2.2.2 Phƣơng pháp xác định thông số nƣớc thải 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 2.2.3 Phng phỏp kh xyanua (CN-) có nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn 38 2.2.4 Phƣơng pháp xác định nồng độ delta-endotoxin dịch nuôi cấy 38 2.2.5 Đánh giá khả phát triển Bt môi trƣờng nƣớc thải chế biến tinh bột qua tiền xử lý 40 2.2.6 Nghiên cứu tiền xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 40 2.2.7 Đánh giá ảnh hƣởng pH lên khả sinh trƣởng Bt 41 2.2.9 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện cấp khí q trình lên men hệ thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L) nƣớc thải tinh bột lên sinh trƣởng phát triển Bt 42 2.2.10 Đánh giá biến động pH trình lên men, so sánh trình lên men có khống chế ổn định pH không ổn định pH 42 2.2.11 Lên men Bt hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm, đánh giá hiệu giệt sâu sản phẩm lên men so sánh với chế phẩm thƣơng mại có thị trƣờng 43 2.2.12 Phƣơng pháp thử nghiệm sinh học 43 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Khảo sát tính chất nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn 44 3.2 Thử nghiệm khả phát triển Bt nƣớc thải tinh bột sắn 47 3.3 Nghiên cứu tiền xử lý nƣớc thải tinh bột sắn để sử dụng nuôi cấy vi sinh vật 48 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng số điều kiện môi trƣờng lên khả sinh trƣởng tạo tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis nƣớc thải tinh bột sắn 53 3.5.1 Ảnh hƣởng pH lên khả sinh trƣởng tạo tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 3.5.2 nh hng độ thống khí lên khả sinh trƣởng tạo tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis 58 3.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện cấp khí q trình lên men hệ thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L) nƣớc thải tinh bột lên sinh trƣởng phát triển Bt 62 3.6.1 Ảnh hƣởng tốc độ khuấy lên sinh trƣởng phát triển Bt 62 3.6.2 Ảnh hƣởng tốc độ thổi khí lên sinh trƣởng phát triển Bt 66 3.7 Đánh giá biến động pH trình lên men, so sánh q trình lên men có khống chế ổn định pH không khống chế ổn định pH 69 3.8 Nghiên cứu lên men thu nhận thuốc trừ sâu sinh học hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm (5L) 74 3.9 Thử nghiệm so sánh khả diệt sâu dịch lên men Bt từ nƣớc thải chế biến tinh bột với chế phẩm thƣơng mại có thị trƣờng 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 A KẾT LUẬN 79 B KIẾN NGHỊ 80 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật DANH MC CC Kí HIU V CHỮ VIẾT TẮT Giải thích, ý nghĩa Ký hiệu, chữ viết tắt WHO Tổ chức Y tế Thế giới FAO Tổ chức Lƣơng thực Thế giới UNEP Chƣơng trình mơi trƣờng Thế giới BVTV Bảo vệ thực vật CNSH Công nghệ sinh học TCN Trƣớc Công nguyên TSB Trypton soya Broth TSA Trypton soya Agar T-N Tổng nitơ T-P Tổng photpho COD Nhu cầu oxy hóa hóa BOD5 Nhu cầu oxy sinh học vvm Thể tích khí/thể tích mơi trƣờng/phút rpm Vịng/phút cfu Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colonyforming unit) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật DANH MC CC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất sử dụng sắn năm 1993 dự kiến đến năm 2020 25 Bảng 1.2 Một số thành phần dinh dƣỡng có củ sắn 26 Bảng 1.3 Tính chất hóa lý nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn 34 Bảng 3.1 Kết phân tích chất lƣợng nƣớc thải sản xuất tinh bột xƣởng sản xuất tinh bột Tiên Sơn – Bắc Ninh 44 Bảng 3.2 Thử nghiệm khả phát triển Bt nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn 47 Bảng 3.3 Mật độ tổng số Bt sau 24 nuôi lắc 48 Bảng 3.4 Khả phát triển Bt môi trƣờng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 49 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng pH lên trình sinh trƣởng Bt 54 Bảng 3.6 ảnh hƣởng độ thống khí lên khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 58 Bảng 3.7 Kết phân tích mật độ tổng số, bào tử hàm lƣợng độc tố deltaendotoxin tốc độ khuấy khác 63 Bảng 3.8 Sinh trƣởng sinh độc tố chủng Bt điều kiện thổi khí khác lên men nƣớc thải tinh bột sắn 66 Bảng 3.9 Các thông số môi trƣờng đƣợc thống kê suốt trình lên men 69 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng độ biến động pH lên khả sinh trƣởng sinh độc tố Bt nuôi môi trƣờng nƣớc thải tinh bột săn qua tiền xử lý 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Bng 3.11 ng thỏi ca Bt ni cấy hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm mơi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn 74 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng lƣợng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt lên khả diệt sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT 77 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình dạng Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 Hình 1.2 Sâu bị chết ăn phải nhiễm Bt 13 Hình 1.3 Tinh thể độc Bt dƣới kính hiển vi điện tử 14 Hình 1.4 Chuyển gen sinh độc tố Bt vào ngô 15 Hình 1.5 Cây sắn củ sắn sau thu hoạch 24 Hình 1.6 Sản lƣợng tinh bột sắn số nƣớc (x1000 tấn) 30 Hình 1.7 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất tinh bột sắn 33 quy mô công nghiệp (Thái Lan) 33 Hình 1.8 Quy trình cơng nghệ xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 35 Hình Đƣờng chuẩn protein để xác định delta-endotoxcin 39 Hình 3.1 Sinh trƣởng Bt môi trƣờng TSB 51 Hình 3.3 Sinh trƣởng Bt mơi trƣờng 50% nƣớc thải tinh bột sắn 52 Hình 3.4 Sinh trƣởng Bt môi trƣờng 100% nƣớc thải tinh bột sắn 53 Hình 3.5 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nƣớc thải tinh bột sắn có pH 55 Hình 3.6 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nƣớc thải tinh bột sắn có pH6 55 Hình 3.7 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nƣớc thải tinh bột có pH7 56 Hình 3.8 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nƣớc thải tinh bột có pH8 57 Hình 3.9 Biểu đồ mật độ tổng số thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng độ thống khí 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hỡnh 3.10 Biu mt độ bào tử thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng độ thống khí 60 Hình 3.11 Biểu đồ hàm lƣợng độc tố delta-endotoxin thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng độ thống khí 61 Hình 3.12 DO hệ lên men tốc độ khuấy khác 62 Hình 3.13 Sinh trƣởng sinh độc tố delta-endotoxin Bt hệ lên men với tốc độ khuấy 350 rpm 64 Hình 3.14 Sinh trƣởng sinh độc tố delta-endotoxin Bt hệ lên men với tốc độ khuấy 450 rpm 65 Hình 3.15 Sinh trƣởng sinh độc tố delta-endotoxin Bt hệ lên men với tốc độ khuấy 550 rpm 65 Hình 3.16 DO hệ lên men tốc độ thổi khí khác 66 Hình 3.17 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nuôi môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn điều kiện thổi khí 0.2vvm 67 Hình 3.18 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nuôi môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn điều kiện thổi khí 0,5vvm 68 Hình 3.19 Sinh trƣởng sinh độc tố Bt nuôi môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn điều kiện thổi khí 1,0vvm 68 Hình 3.20 Biến độ pH trình lên men mơi trƣờng nƣớc thải tinh bột 71 Hình 3.21 Sinh trƣởng phát triển Bt môi trƣờng không điều chỉnh pH 72 Hình 3.22 Ảnh hƣởng ổn định pH đến khả sinh trƣởng phát triển Bt môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn 73 Hình 3.23 Khả sinh trƣởng sinh độc tính chủng vi khuẩn Bt suốt trình lên men 76 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hỡnh 3.24 nh hƣởng lƣợng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt lên khả diệt sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT 78 MỞ ĐẦU Nhu cầu tinh bột sắn ngày tăng năm trở lại ứng dụng rộng rãi chúng công nghiệp nhƣ đời sống ngƣời Điều dẫn đến gia tăng nhanh chóng nhà máy chế biến tinh bột sắn quy mộ lẫn số lƣợng Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích mà chúng đem lại, làm ngơ thực trạng môi trƣờng đáng báo động chất thải mà đặc biệt nƣớc thải tạo trình chế biến tinh bột hàng ngày hàng đầu độc mơi trƣờng Tình trạng nƣớc thải chế biến tinh bột có hàm lƣợng nhiễm hữu cao, chúng phải đƣợc xử lý trƣớc thải môi trƣờng tái sử dụng để sản xuất sản phẩm có ích nhằm giảm thiểu lƣợng nƣớc thải môi trƣờng Sản phẩm thƣơng mại từ Bacillus thuringiensis đƣợc sử dụng việc bảo vệ rừng nông nghiệp, nhiên, việc ứng dụng rộng rãi sản phẩm gặp trở ngại giá thành sản xuất cao Do đó, với mong muốn tìm giải pháp nhằm tái sử dụng có hiệu nƣớc thải chế biến tinh bột sắn – ô nhiễm nhƣng giàu dinh dƣỡng cho vi sinh vật, đồng thời tìm nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có để sản xuất sản phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis, thực đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn để nuôi cấy Bacillus thuringiensis” Đề tài bao gồm nội dung sau: Số hóa Trung tâm Học liu i hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 34 35 36 0,5 0,5 0,5 7,64 7,76 7,81 450,3125 450,8375 450,4875 77,6499 75,7249 78,5499 37 0,5 7,85 450,6625 78,6499 38 0,5 7,86 450,4875 80,2749 39 0,5 7,95 450,925 81,3249 40 41 0,5 0,5 8,02 8,05 450,1 450,575 80,2999 88,9999 42 0,5 8,03 450,1875 87,0249 43 0,5 8,09 450,75 88,3499 44 45 0,5 0,5 8,15 8,22 450,925 450,3125 88,7249 88,7249 46 0,5 8,22 450,05 88,3499 47 0,5 8,22 450,6625 91,0749 48 0,5 8,22 450,4875 91,7749 pH pH 48 45 42 39 36 33 30 27 24 21 18 15 12 0 thời gian lên men (h) Hình 3.20 Biến độ pH trình lên men mơi trƣờng nƣớc thải tinh bột Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viªn: Trần Hà Ninh 71 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vËt pH dịch lên men biến đổi từ pH 7,7 tới pH trình sinh trƣởng Bt tiến tới pha log cuối tăng lên thâm chí tới pH8 * So sánh khả sinh trƣởng phát triển chủng Bt nghiên cứu điều kiện lên men có ổn định pH không ổn định Kết so sánh ảnh hƣởng độ biến động pH đƣợc thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng độ biến động pH lên khả sinh trƣởng sinh độc tố Bt nuôi môi trƣờng nƣớc thải tinh bột săn qua tiền xử lý Thời gian (h) 12 24 36 48 Không điều chỉnh pH Mật độ deltaMật độ bào tổng số endotoxin tử (cfu/ml) (cfu/ml) (mg/l) 5,20.10 2,10.10 130,6 5,60.10 4,70.10 415,32 6,00.108 5,40.107 512,3 1,60.10 541,56 1,25.10 2,30.108 1,10.108 586,3 Có điều chỉnh pH Mật độ tổng số (cfu/ml) 1,00.104 4,20.107 1,60.109 1,50.109 8,70.108 Mật độ bào tử (cfu/ml) 4,50.103 1,30.105 1,80.108 2,80.108 3,77.108 deltaendotoxin (mg/l) 164,43 379,411 511,707 599,607 630,889 1.40E+09 1.20E+09 1.00E+09 8.00E+08 6.00E+08 4.00E+08 2.00E+08 0.00E+00 700 600 500 400 300 200 100 0 12 24 36 Hàm lượng deltaendotoxin (mg/l) Mật độ tế bào, bào tử (cfu/ml) Không ổn định pH 48 thời gian lên men (h) Mật độ tổng số Mật độ bào tử delta-endotoxin Hình 3.21 Sinh trƣởng phát triển Bt mơi trƣờng khơng điều chỉnh pH Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Học viên: Trần Hà Ninh 72 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Cú th thy rng, khụng có khống chế pH, mật độ tổng số tăng nhanh đạt tối đa thời điểm 36 (1,25.109 cfu/ml), thấp so với thí nghiệm lên men có ổn định pH Thời gian để đạt tới mật độ tối đa chậm so với thí nghiệm ổn định pH Điều giải thích giai đoạn phát triển mình, pha log, chúng tạo nhiều sản phẩm trung gian có tính axit dẫn tới làm giảm pH mơi trƣờng xuống thấp Chính điều kìm hãm phát triển chủng Bt nghiên cứu dẫn tời thời gian đạt mật độ tổng số tối đa chậm so với thí nghiệm có ổn định pH Do phát triển yếu nên lý mà hàm lƣợng delta-endotoxin đo đƣợc thấp so với thí nghiệm có ổn định pH Mật độ tế bào, bào tử (cfu/ml) 2.00E+09 700 600 500 400 300 200 100 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00 12 24 36 hàm lượng deltaendotoxin (mg/l) Ổn định pH (pH 7) 48 thời gian lên men (h) Mật độ tổng số Mật độ bào tử delta-endotoxin Hình 3.22 Ảnh hƣởng ổn định pH đến khả sinh trƣởng phát triển Bt môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn Nhân xét chung: Với lên men có điều chỉnh pH mật độ tổng số tối đa đạt đƣợc cao sớm so với không điều chỉnh pH Hàm lƣợng delta-endotoxin thí nghiệm lên men khơng ổn định pH thấp rõ rệt so (chỉ ) với thí nghiệm lên men có ổn định pH Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 73 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 3.8 Nghiờn cu lờn men thu nhận thuốc trừ sâu sinh học hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm (5L) Sau tiến hành tối ƣu hóa số yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng phát triển nhƣ sinh độc tính chủng Bt sử dụng hệ thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm Chúng tơi tiến hành nghiên cứu động thái chủng Bt nghiên cứu suốt trình lên men Kết phân tích mật độ tổng số, bào tử delta-endotoxin đƣợc thể bảng 3.12 hình 3.21 Bảng 3.11 Động thái Bt nuôi cấy hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm mơi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn Thời gian lên men (h) Mật độ tổng số (cfu/ml) 1,00.104 Mật độ bào tử (cfu/ml) 4,50.103 delta-endotoxin (mg/l) 164,430144 1,40.105 5,50.103 197,376912 1,30.106 5,00.103 206,281444 5,80.106 6,60.103 240,627496 9,40.106 5,90.103 256,146823 10 4,20.107 6,50.103 313,644658 12 2,50.108 1,30.105 379,410988 14 5,90.108 4,50.106 397,220052 16 8,30.108 7,90.106 391,877332 18 8,50.108 2,30.107 399,509788 20 8,70.108 1,50.108 410,322434 22 8,80.108 1,90.108 417,446060 24 1,60.109 1,80.108 511,706892 26 1,59.109 1,60.108 516,540780 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viên: Trần Hà Ninh 74 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyªn sinh vËt 28 1,57.109 1,80.108 558,646496 30 1,56.109 1,90.108 572,893747 32 1,55.109 2,20.108 585,741715 34 1,51.109 2,40.108 594,519039 36 1,50.109 2,80.108 599,607343 38 1,50.109 3,50.108 609,529536 40 1,50.109 3,40.108 617,289200 42 1,49.109 3,70.108 626,066524 44 1,48.109 3,40.108 664,228804 46 1,48.109 3,70.108 674,885836 48 1,48.109 3,20.108 674,889168 1.00E+10 800.000000 1.00E+09 700.000000 600.000000 1.00E+07 500.000000 1.00E+06 1.00E+05 400.000000 1.00E+04 300.000000 1.00E+03 200.000000 Hàm lượng delta-endotoxin (mg/l) Mật độ tế bào, bào tử (cfu/ml) 1.00E+08 1.00E+02 100.000000 1.00E+01 1.00E+00 0.000000 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 thời gian lên men (h) Mật độ tổng số Mật độ bào tử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viªn: Trần Hà Ninh 75 delta-endotoxin http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyªn sinh vËt Hình 3.23 Khả sinh trƣởng sinh độc tính chủng vi khuẩn Bt suốt trình lên men Từ kết bảng 3.11 hình 3.21 cho thấy: mật độ tổng số vi khuẩn khả sinh độc tính tăng theo thời gian Mật độ tổng số vi khuẩn tăng nhanh giai đoạn từ đến 14 lên men, từ khoảng 14 đến 22 mật độ tổng số chủng vi khuẩn tăng chậm dần số lƣợng đạt mật độ cao 24 đạt 1,6.109 CFU/ml sau mật độ tổng số giảm chậm dù tới kêt thúc thí nghiệm (48 giờ) mật độ tổng số ngƣỡng 10 cfu/ml Bên cạnh khả sinh trƣởng vi khuẩn Bt khả sinh độc tố trình lên men tăng dần theo thời gian Trong khoảng thời gian - 6h, lƣợng độc tố delta-endotoxin tăng chậm không cao (tại thời điểm hàm lƣợng deltaendotoxin đo đƣợc bẳng khoảng 64% so với thời điểm kết thúc thí nghiệm) giai đoạn thích nghi vi khuẩn chúng có khả sinh bào tử mơi trƣờng lên men giàu dinh dƣỡng dẫn đến hình thành tinh thể độc thấp Chủng vi khuẩn Bt nghiên cứu có sinh trƣởng cực đại sau 24h khả sinh độc tính cao sau 48h 3.9 Thử nghiệm so sánh khả diệt sâu dịch lên men Bt từ nƣớc thải chế biến tinh bột với chế phẩm thƣơng mại có thị trƣờng Sau nghiên cứu khả sinh trƣởng sinh tổng hợp độc tính chủng vi khuẩn Bt để so sánh hiệu diệt sâu chủng vi khuẩn chúng tơi tiến hành thí nghiệm so sánh với sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học thƣơng phẩm V-BT Công ty HaiNan Natura Bio - Technology V.Co nồng độ khác Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ dịch sản phẩm lên men chủng Bt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viªn: Trần Hà Ninh 76 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vËt nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học V-BT thƣơng phẩm đƣợc tiến hành nhƣ sau: dịch nuôi cấy Bt nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn thuốc trừ sâu sinh học V-BT đƣợc thử nghiệm sâu đục thân ngô với nồng độ tƣơng ứng Kết thí nghiệm thu đƣợc thể Bảng 3.12 hình 3.24: Bảng 3.12 Ảnh hƣởng lƣợng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt lên khả diệt sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT Tỷ lệ thuốc (%) 10 Bt 68 70 74 100 V-BT 67 71 75 100 Tỷ lệ sâu chết (%) Ghi chú: Bt: dịch nuôi cấy Bt nước thải tinh bột V-BT: thuốc trừ sâu sinh học thương phẩm Tỷ lệ sâu chết (%) 120 100 80 60 40 20 10 Tỷ lệ sử dụng (%) Bt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viªn: Trần Hà Ninh 77 V-Bt http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyªn sinh vËt Hình 3.24 Ảnh hƣởng lƣợng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt lên khả diệt sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT Kết bảng 3.12 biểu hình 3.22 cho thấy khả diệt sâu đục thân ngô dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt tƣơng đồng với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT tất nồng độ thí nghiệm 1% - 10% Khả diệt sâu phƣơng án thí nghiệm tăng dần theo lƣợng dịch bổ sung từ -10% Khả diệt sâu hiệu nồng độ dịch 10%, sâu bị tiêu diệt 100% sau ngày thí nghiệm Qua khẳng định khả diệt sâu chủng Bt trƣơng đƣơng với chế phẩm V-BT nồng độ diệt sâu tối ƣu 10% sâu đục thân ngơ Qua sơ kết luận độc tính dịch sản phẩm lên men chủng Bt nghiên cứu tƣơng đƣơng với thuốc trừ sâu sinh học thƣơng phẩm V-BT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 78 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật KT LUN V KIN NGHỊ A KẾT LUẬN 1- Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn giàu hữu cơ, nhiên lại có pH thấp (3,82) nên cần phải đƣợc điều chỉnh pH thích hợp (pH7 tối ƣu nhất) cho chủng Bt nghiên cứu 2- Hàm lƣợng xyanua nƣớc thải cao địi hỏi phải đƣợc tiền xử lý (sục khí ozon) để loại bỏ (mật độ tổng số mẫu có tiền xử lý xyanua cao gấp 3,6 lần so với mơi trƣờng đƣợc trung hịa pH7) Sau tiền xử lý (loại bỏ xyanua, trung hòa pH7), chủng Bt nghiên cứu phát triển tốt môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn mà không cần phải pha loãng (mật độ tế bào tối đa đạt 8,7.108 cfu/ml, hàm lƣợng delta-endotoxin đạt: 446,93 mg/l) 3- Ở điều kiện tỷ lệ mơi trƣờng/thể tích bình ni 20%, khả sinh trƣởng tạo độc tố chủng Bt nghiên cứu cao hẳn so với tỷ lệ khác cao Điều cho thấy chủng hiếu khí mạnh 4- Tốc độ khuấy 450rpm, tốc độ thổi khí 0.5vvm hệ thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L) thích hợp cho sinh trƣởng, phát triển sinh độc tố chủng Bt nghiên cứu 5- pH trình lên men mơi trƣờng nƣớc thải tinh bột sắn biến đổi liên tục (từ 7,7 giảm xuống 6,02 sau lại tăng từ 6,02 lên 8,2) Khi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 79 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật n nh pH, kh nng sinh trƣởng, tạo độc tố của chủng nghiên cứu cao rõ rệt so với không ổn định pH 6- Trong điều kiện lên men tối ƣu, mật độ tổng số (tế bào bào tử) chủng nghiên cứu đạt cao 24 (1,6.109 cfu/ml), hàm lƣợng deltaendotoxin cao thời điểm 48 (đạt xấp xỉ 675mg/l) 7- Hiệu diệt sâu đục thân ngô (Ostrinia furnacalis) dịch sản phẩm lên men so với chế phẩm V-Bt Công ty HaiNan Natura Bio Technology V.Co tƣơng đƣơng B KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian nên luận văn chƣa thể tiến hành đánh giá ảnh hƣởng việc bổ sung nguồn dinh dƣỡng nhằm tăng khả sinh trƣởng, phát triển nhƣ sinh độc tố chủng vi khuẩn nghiên cứu Ở giới hạn đề tài, tiến hành đối tƣợng Bacillus thuringiensis var kurstaki, chƣa thể tiến hành với nhóm đối tƣợng khác có tác dụng tƣơng tự nhƣ Trichodesma hay số nhóm vi khuẩn có ích khác Rất mong có điều kiện đƣợc tiếp tục nghiên cứu, nghiên cứu bổ sung mở rộng thêm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 80 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật TI LIU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt: Hoàng Kim Anh, Ngơ Kế Sƣơng, Nguyễn Xích Liên, 2004, Tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn, NXB Khoa học Kỹ thuật Ngơ Đình Bính (2000), Nghiên cứu sản xuất sử dụng hỗn hợp chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật trừ sâu bệnh hại trồng nơng lâm nghiệp, Báo cáo kết Hồn thiện công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm Bt hỗn hợp với chế phẩm khác đề tài KHCN 02 – 07B Ngơ Đình Bính (2003) Báo cáo kết quả: Nghiên cứu sử dụng giống gốc Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao trừ sâu hại trồng phát triển mơ hình ứn dụng phòng trừ tổng hợp cho vùng rau Vân Tảo, Thường Tín, Hà Tây, Đề tài KC 04 – 12 Quyết định số 1971/1999/QĐ-BKHCNMT ngày 10/11/1999, Quyết định việc ban hành Quy trình cơng nghệ tiêu hủy tái sử dụng xianua Hoàng Kim, Phạm Văn Biên Cây Sắn Nhà xuất Nơng nghiệp 1996 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viên: Trần Hà Ninh 81 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyªn sinh vËt Hồng Kim, Nguyễn Đăng Mãi (ed.) Sắn Việt Nam: Hiện trạng, định hướng giải pháp phát triển năm đầu kỷ 21 Nhà xuất Nơng nghiệp 2001 B Tài liệu nƣớc ngồi: Bradford MM (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Anlytical Biochem, 72, pp 248-254 Cassava and the future of starch, Nyerhovwo John Tonukari, Electronic Journal of Biotechnology No 1, Issue of April 15, 2004 Crickmore N., D.R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum and D.H Dean, 1998, Revision of nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins, Microbial Mol Biol Rev 62, pp 807-813 10 Faust, R.M 1974 Bacterial diseases In: Insect Diseases Edited by G.E Cantwell) Marcel Dekker, New York pp 87-183 11 Goldberg, L.J., and Margalit, J 1977 A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles serengetii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culex pipiens Mosq News 37: 355-358 12 Höfte, H., and Whiteley, H.R 1989 Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis Microbiol Rev., 53: 242-255 13 Krieg, A., Huger, A.M., Langenbruch, G.A., and Schnetter W, 1983, Bacillus thuringiensis var tenebrionis: ein neuer gegenuber larven von Coleopteren wirksamer Pathotyp Z Ang Entomol 96: 500-508 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 82 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 14 Kwang-Bo Joung, Jean-Charles Côté, 2000, A review of the environmental impacts of the microbial insecticide Bacillus thuringiensis, Technical Bulletin No 29 15 Lacey, L.A., and Goettel, M.S 1995 Current developments in microbial control of insect pests and prospects for the early 21 century Entomophaga 40(1): 3-27 16 Lambert, B., and Peferoen, M 1992 Insecticidal promise of Bacillus thuringiensis Bioscience 42: 112-122 17 Lereclus, D., Delécluse, A., and Lecadet, M.-M 1993 Bacillus thuringiensis toxins and genes Diversity of In: Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: theory and practice Wiley, New York pp 3769 18 NDUELE, M.; LUDWIG, A and VAN OOTEGHEM, M The use of cassava starch in the formulation of gelatin capsules Journal de Pharmacie de Belgique, 1993, vol.48,No5: 325-334 19 NWOKORO, SO; ORHERUATA, AM and ORDIAH, PI Replacement of maize with cassava sievates in cockerel starter diets: effect on performance and carcass characteristics Tropical Animal Health and Production , 2002, vol.34,No2: 163-167 20 OKEZIE, BO and KOSIKOWSKI, FV Cassava as a food Critical Review of Food Science and Nutrition , 1982, vol.17 No.3, 1-71 21 Park S H., B T Koo, B S Shin, S K Choi, Y M Jeong, J G Pan, and J I Kim (1997), “Characterization of 1925 Bacillus thuringiensis isolates from plants in Korea” Kor J Appl Microbiol Biotechnol Vol 25, No 2, p.159-165 Số hóa Trung tâm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 83 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vËt 22 SCOTT, GJ; ROSEGRANT, MW and RINGLER, C Roots and Tubers for the 21st Century: Trends, Projections, and Policy Options, 2000, p.1-71 23 APHA, AWWA, and WEF, 1998, Standard Methods for the examination of water and wastewater, 20th ed., American Public Health Association, Washington, D.C 24 TAN, KH; FERGUSON, LB and CARLTON, C Conversion of cassava starch to biomass, carbohydrates, and acids by Aspergillus niger Journal of Applied Biochemistry , 1984, vol.6, No 1-2: 80-90 25 Van Frankenhuyzen, K 1993 The challenge of Bacillus thuringiensis In: Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice Wiley, New York pp 1-35 26 VUILLEUMIER, S Worldwide production of high-fructose syrup and crystalline fructose American Journal of Clinical Nutrition , 1993, vol.58, N5: 733-736 27 Yasuda, Yasuhiro (1991), “Sewage sludge utilization technology in Tokyo”, Water Science & Technology, 23 (10-12), pp 1743-1752 28 A Yezza, R.D Tyagi, J.R Valéro, R.Y Surampalli, 2006, Bioconversion of industrial wastewater and wastewater sludge into Bacillus thuringiensis based bipesticides in pilot fermenter, Bioresourse technology 97, pp 18501857 C Tài liệu Internet: 29 http://www.cassavabiz.org/postharvest, Cassava Starch Production 30.http://xulymoitruong.blogspot.com/2009/11/xu-ly-nuoc-thai-tinh-botsan.html Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại hc Thỏi Nguyờn Học viên: Trần Hà Ninh 84 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật Luận văn Cao học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 31.http://khuyennong.mard.gov.vn/view/AfterHarvestTech.aspx?TabID=5&O jectID=20&ItemID=134, Quy trình chế biến tinh bột sắn từ củ sắn, Sở Nông nghiệp Hƣng Yên 32.http://vietnamchemtech.com.vn/?Pl=REVIEW&Me=News&Cy=2D914A3 C-F43B-4E1E-A841-398395E31553&Ix=dfd79367-a413-41d9-afaba5b365ec8b53 33.http://www.prolawnsystems.com/insects-pests-beneficial.htm 34.http://visualsunlimited.photoshelter.com/image/I0000vOqItnsg1E8 35.http://www.truongtructuyen.vn/default.aspx?tabid=238&g=posts&t=13727 36.http://www.scq.ubc.ca/bt-corn-is-it-worth-the-risk 37 baiduthicongnghesinhhoc_fix.pdf 38 http://raovattoanquoc.vn/showthread.php?t=3658 39 http://xulymoitruong.blogspot.com/2009/11/xu-ly-nuoc-thai-tinh-botsan.html Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Häc viªn: Trần Hà Ninh 85 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chuyên ngành: Vi sinh vật ... phn nƣớc thải tạo từ trình chế biến sắn để sản xuất tinh bột (nƣớc thải tinh bột sắn) , đánh giá sơ khả sử dụng nƣớc thải tinh bột sắn để ni cấy vi sinh vật có ích nói chung Bacillus thuringiensis. .. tiền xử lý nƣớc thải tinh bột sắn để sử dụng nuôi cấy vi sinh vật Với pH 3,82 nƣớc thải tinh bột sắn, dễ hiểu chủng Bt nghiên cứu phát triển đƣợc nƣớc thải chế biến tinh bột sắn chƣa qua tiền... 5L) Nghiên cứu biến động pH trình sinh trƣởng chủng Bt nghiên cứu, so sánh khả sinh trƣởng sinh độc tố chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu nuôi nƣớc thải chế biến tinh bột sắn Nghiên cứu biến