Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 606240 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : TS Nguyễn Mạnh Hà TS Đào Đức Thà THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, nỗ lực phấn đấu thân, tơi cịn nhận đƣợc giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình nhiều cá nhân, đơn vị tập thể khác Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Mạnh Hà Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên TS Đào Đức Thà Phó Bộ mơn Sinh lý sinh hóa tập tính vật ni Viện Chăn ni Quốc gia, ngƣời dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập Tơi xin gửi tới thầy giáo, cô giáo trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun nói chung, khoa Chăn ni nói riêng ngƣời giúp đỡ, giảng dạy tơi suốt q trình học tập trƣờng Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Chăn ni tồn thể cán cơng nhân viên Viện, đặc biệt anh, chị cán Bộ mơn Sinh lý sinh hóa tập tính vật nuôi Viên chăn nuôi, Trung tâm thực nghiệm bảo tồn vật ni Viện chăn ni Phịng thí nghiệm công nghệ tế bào động vật Viện Chăn nuôi, ngƣời ln hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài Xin bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân, bạn bè đồng nghiệp bên tôi, giúp đỡ, động viên suốt trình học tập rèn luyện trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên thực tập Viện Chăn nuôi! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hậu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM OAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực ch-a đ-ợc công bố công trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn đà đ-ợc rõ nguồn gèc Tác giả Nguyễn Thị Hậu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A ( Progressive Motility ) : Hoạt lực tinh trùng ASTT : Áp suất thẩm thấu C : Nồng độ tinh trùng cs : Cộng ctv : Cộng tác viên DAP : Độ dài đƣờng trung bình DCL : Độ dài đƣờng ziczăc DSL : Độ dài đƣờng thẳng I ( Immotile) : Tinh trùng không hoạt động Motility : Hoạt động tinh trùng NST : Nhiễm sắc thể L ( Local motility ) : Tinh trùng hoạt động chỗ TTNT : Thụ tinh nhân tạo TTON : Thụ tinh ống nghiệm V : Lƣợng tinh dịch lần lấy tinh VAC : Tổng số timh trùng tiến thẳng VCL : Tốc độ chuyển động theo đƣờng ziczăc VAP : Tốc độ chuyển động theo đƣờng trung bình VSL : Tốc độ chuyển động theo đƣờng thẳng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Một số tiêu chất lƣợng tinh nguyên trƣớc đông lạnh 55 Bảng 3.2 Khoảng cách vận tốc tinh trùng giống lợn 61 Bảng 3.3 Đặc điểm môi trƣờng ly tâm (n=60) 62 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng hai môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng 64 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng giống lợn Landrace 66 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng giống lợn Yorkshire 66 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng 67 giống lợn Duroc 67 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng tốc độ ly tâm đến sức sống tinh trùng……….65 Bảng 3.9 Sức sống tinh trùng sau ly tâm giống lợn 72 Bảng 3.10 Đặc điểm môi trƣờng cân (n= 60) 74 Bảng 3.11 Chất lƣợng tinh dịch sau cân giống Landrace 75 Bảng 3.12 Chất lƣợng tinh dịch sau cân giống Yorkshire 76 Bảng 3.13 Chất lƣợng tinh dịch sau cân giống Duroc 76 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng thời gian đông lạnh đến sức sống tinh trùng 77 (n= 70) 77 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng 79 (n=70) 79 Bảng 3.16 Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông giống lợn 81 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch giống lợn 56 Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng giống 57 Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) giống 58 Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) lần lấy tinh 59 Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng môi trƣờng ly tâm 65 Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng tinh nguyên tinh pha môi trƣờng ly tâm (VCN) 68 Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A ) tinh trùng chế độ ly tâm 71 Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trƣớc, sau đông lạnh thời gian đông lạnh 10 phút 20 phút 79 Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A) tinh trùng thời gian giải đông 30 giây 45 giây 81 Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông giống lợn 83 Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài chuyển động tinh trùng 84 Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động tinh trùng dạng vận động 85 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 11 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 12 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 12 CHƢƠNG 13 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 Vai trò lợn đực giống thụ tinh nhân tạo chăn nuôi lợn nƣớc ta 13 1.2 Cơ sở nghiên cứu tinh dịch tinh trùng lợn 14 1.2.3 Một số đặc tính sinh lý tinh trùng lợn 19 1.2.4 Một số tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn .25 1.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh dịch 29 1.3 Cơ sở khoa học kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 33 1.3.1 Một số nguyên lý đông lạnh tinh dịch .34 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng tới sức sống tinh trùng đông lạnh 37 1.3.3 Cơ sở khoa học môi trƣờng đông lạnh tinh dịch lợn 39 1.3.4 Cơ sở khoa học quy trình đơng lạnh tinh dịch lợn 43 1.4 Tình hình nghiên cứu đơng lạnh tinh dịch lợn nƣớc ngồi nƣớc 44 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 44 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 46 CHƢƠNG 48 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG 48 VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 48 2.1.1 Tinh dịch lợn đực 48 2.1.2 Hố chất dụng cụ thí nghiệm 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 Yêu cầu 48 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 48 2.4 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 49 2.4.1 Nghiên cứu số tiêu đánh giá chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc đông lạnh 50 2.4.3 Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh .54 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .54 CHƢƠNG 55 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Kết nghiên cứu số tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc đông lạnh .55 3.2 Kết nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 62 3.2.1.Kết nghiên cứu kỹ thuật ly tâm 62 3.2.2 Kết nghiên cứu kỹ thuật cân tinh dịch .74 3.2.3 Kết nghiên cứu đông lạnh tinh dịch nitơ 77 3.2.4 Kết nghiên cứu nhiệt độ thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh 79 Nhƣ kết sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái sản xuất cần phải nghiên cứu sâu nhằm nâng cao hiệu Tuy nhiên với kết bƣớc đầu nhƣ khẳng định đƣợc thành công kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 88 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 88 KẾT LUẬN 88 ĐỀ NGHỊ 89 I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 91 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 92 III TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 95 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 IV TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 95 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 97 PHỤ LỤC Phƣơng pháp nghiên cứu số tiêu đánh giá chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc đông lạnh Các tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn đƣợc nghiên cứu theo phƣơng pháp thƣờng quy phần mềm Spermvision 3.0 Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt lực tinh trùng (A, %) Hoạt lực tinh trùng đƣợc nghiên cứu dựa việc sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0 - Phần mềm Sperm Vision giúp phân tích tiêu tinh dịch trực tiếp xác Hệ thống Sperm Vision có cấu tạo gồm: + Kính hiển vi phản pha + Camera kỹ thuật số tốc độ cao + Máy tính có hệ thống Graphics PC card chuyên dụng + Bộ phận sƣởi ấm tự động + Phiến kính chuyên dụng dùng lần + Micro pipet 10 – 100µl + Phần mềm chạy chƣơng trình Window XP Cách tiến hành : Bật máy Nhấn chuột vào biểu tƣợng Sperm Vision Màn hình hiển thị trang Sample ( mẫu ) Khai báo yêu cầu: + Time ( Thời gian : ngày, tháng, ) tự động hiển thị + Donor ID ( Đặc điểm gia súc lấy mẫu ) + Donor name ( Tên gia súc lấy mẫu ) + Breed ( Giống ) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 98 + Tech ( Kỹ thuật viên ) + Evat Tech ( Kỹ thuật đánh giá ) + Extender ( MôI trƣờng sử dụng để pha loãng ) Bấm chuột vào ô New sample ( Mẫu ) Màn hình hiển thị lên trang: New sample entry ( Khai báo yêu cầu mẫu ) Phải khai báo mục: + Ngày kiểm tra ( tự động ) + Giờ kiểm tra ( tự động ) + Donor ID : số hiệu gia súc kiểm tra + Tech : kỹ thuật viên + Eval Tech : kỹ thuật đánh giá + Đơn vị lƣợng tinh kiểm tra + Extender use : mơi trƣờng pha lỗng kiểm tra Nếu không khai báo đầy đủ phần mềm không chạy có câu hỏi đƣợc đƣa Bấm vào “ OK” Màn hình hiển thị trang : Mobility Analysis ( phân tích hoạt lực ) + Nhấn chuột vào cửa sổ giống ( Breed ) Chọn mục giống kiểm tra ( phần đƣợc cài đặt sẵn trƣơng trình giống ) + Nhấn chuột vào ô Dilution radio để chọn tỉ lệ pha loãng phù hợp với tỉ lệ pha mẫu kiểm tra Màn hình hiển thị hình ảnh kiểm tra bảng tiêu kiểm tra Chuẩn bị tiêu : Nhỏ lƣợng 20 microlit mẫu vào phiến kính có sẵn Đƣa phiến kính chuẩn bị sẵn lên kính hiển vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 99 Điều chỉnh độ nét Nháy chuột vào ô cửa sổ Analyze kết đƣợc tự động hiển thị hình hình ảnh số liệu Di chuyển sang vị trí khác để kiểm tra cách nhấn chuột vào ô field tiếp tục nhấn chuột vào Analyze để phân tích tiếp Đối với lợn mẫu làm lần ( field ) Các số liệu đƣợc tự động tính tốn theo field trung bình Các số liệu hình ảnh đƣợc lƣu giữ lại chuyển field liệu Field chuyển sang phần Exel để tính tốn Hết Field tự động hiển thị lên phần kiểm tra kì hình trực tiếp Field cho kết Những số liệu vấn đề liên quan đến gia súc kiểm tra đƣợc khai báo vào thƣ mục tƣơng ứng Các tiêu kì hình tỉ lệ tinh trùng sống, chết kỹ thuật viên phải trực tiếp quan sát hình nhấn chuột vào vị trí tinh trùng máy tính tự động ghi lại tính tốn Những tinh trùng chết đƣợc đánh dấu chấm đỏ đầu, tinh trùng kỳ hình kỹ thuật viên phải phân loại nhận biết xác Phƣơng pháp nghiên cứu nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) Nồng độ tinh trùng đƣợc đánh giá máy so màu SDM-S hãng Minitub (Đức) Cách đánh giá nhƣ sau: - Bƣớc 1: đặt phƣơng pháp đo Sử dụng phƣơng pháp để đo nồng độ tinh trùng lợn - Bƣớc 2: đo mật độ quang nƣớc muối sinh lý Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 100 Cho vào cuvet 3,5ml nƣớc muối sinh lý để đo - Bƣớc 3: so màu để tìm nồng độ tinh trùng Lấy cuvet khác, cho vào 3,5ml nƣớc muối sinh lý 70μl tinh dịch Lắc nhẹ cho mẫu đƣa vào máy để so màu - Bƣớc 4: đọc kết hình Phƣơng pháp nghiên cứu áp suất thẩm thấu Đo ASTT tinh dịch lợn máy đo tự động Osmometer Type hãng Minitub (Đức) Cách tiến hành: bật máy lên, máy khởi động – phút, hình hiển thị dãy số 9999, cho 0,1ml tinh dịch cần khảo sát vào tuýp nhựa chuyên dụng máy, sau lắp vào đầu đo đặt vào vị trí đo, lúc máy tự hoạt động theo chƣơng trình, hình máy hiển thị dãy số giảm dần từ số (+) đến số (-) Khi dãy số – 800 máy tự động phát tín hiệu tút…tút…tút…liên tục báo hiệu cho kỹ thuật viên chuẩn bị thao tác nâng kim kích đơng lên vị trí quy định Khi hình số – 1000 nhanh chóng thao tác đƣa kim kích đơng vào vị trí sau nhấc kim vị trí ban đầu, thời gian kích đơng 0,5 giây Sau thời gian kích đơng, hình hiển thị dãy số, dãy số có giá trị (+) giảm dần, dãy số dừng dao động xung quanh giá trị đó, ta xác định đƣợc kết Dãy số hình lúc giá trị áp lực thẩm thấu dung dịch Chú ý: trƣớc lần đo cần chỉnh máy cách đo áp suất thẩm thấu nƣớc cất Nƣớc cất có ( ASTT ) chỉnh vị trí máy 1miniosmol = 0,001860C = 0,0224 atm Phƣơng pháp nghiên cứu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Phƣơng pháp: làm tiêu cố định quan sát trực tiếp hình vi tính phần mềm Sperm Vision Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 101 Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khơ, nhỏ giọt tinh dịch lên phiến kính, dùng phiến kính gạt cho tinh dịch dàn mỏng Để hong khơ ngồi khơng khí khoảng phút Sau đƣa lên kính hiển vi hệ thống máy Sperm Vision Quan sát đếm tổng số tinh trùng, số tinh trùng kỳ hình vi trƣờng Sau xử lý thống kê để đánh giá tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 102 Bình nitơ dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 103 Tủ bảo ôn dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Máy đo áp suất thẩm thấu tinh dịch lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 104 Máy ly tâm tinh dịch lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 105 Hệ thống phần mềm Spermvision dùng đánh giá tiêu tinh trùng Một số hóa chất dùng kỹ thuật đơng lạnh tinh dịch lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 106 Môi trƣờng đông lạnh dùng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 107 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 108 Kiểm tra chất lƣợng tinh dịch trƣớc sau đông lạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 109 Tinh dịch sau cân đƣợc đóng vào cọng rạ Tinh dịch sau đƣợc đóng vào cọng rạ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 110 Đông lạnh tinh dịch Nitơ lỏng (- 1960C) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 111 Giải đông tinh cọng rạ Đàn lợn đƣợc sinh TTNT tinh cọng rạ đông lạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... ? ?Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo nhân giống lợn? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ - Sử dụng tinh dịch đông lạnh. .. nhân tạo lợn, đồng thời áp dụng kết nghiên cứu vào sản xuất, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo nhân giống lợn? ?? Thuộc đề tài công nghệ... ta kỹ thuật đơng lạnh tinh dịch bị đƣợc nghiên cứu, sản xuất, áp dụng rộng rãi sản xuất, nhiên kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu Một số nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh