Tổng hợp nghiên cứu phức chất của tecbi dysprosi với l histidin axit l aspartic và bước đầu thăm dò hoạt tính sinh học của chúng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ BÍCH NGỌC TỔNG HỢP, NGHIÊN CỨU PHỨC CHẤT CỦA TECBI, DYSPROSI VỚI L-HISTIDIN, AXIT L-ASPARTIC VÀ BƯỚC ĐẦU THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG Chun ngành: HĨA VƠ CƠ Mã số: 60.44.01.13 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ HỮU THIỀNG THÁI NGUYÊN - 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Lê Thị Bích Ngọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo-PGS.TS.Lê Hữu Thiềngngười tận tình chu đáo giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng quản lý đào tạo Sau Đại học, Khoa Hóa học Trường ĐHSP Thái Ngun; phịng máy quang phổ, phịng thử hoạt tính sinh học Viện Hóa học - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam; phịng thí nghiệm Hóa lý trường Đại Học Sư Phạm I Hà Nội; phịng phân tích Hóa học- viện Khoa học Sự sống trung tâm Học liệu Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập nghiên cứu đề tài Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ giáo cán phịng thí nghiệm Khoa Hóa học, Khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Thái Nguyên bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Cùng với biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng ĐT -NCKH trường CĐSP Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2013 Tác giả Lê Thị Bích Ngọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình vi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Giới thiệu nguyên tố đất (NTĐH) 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo tính chất chung NTĐH .2 1.1.2 Giới thiệu số hợp chất NTĐH 1.1.3 Giới thiệu nguyên tố tecbi dysprosi .8 1.1.4 Trạng thái tự nhiên tầm quan trọng NTĐH 10 1.2 Giới thiệu aminoaxit, L-histidin axit L-aspartic 11 1.2.1 Giới thiệu aminoaxit 11 1.2.2 Giới thiệu L-histidin axit L-aspartic 12 1.3 Khả tạo phức NTĐH aminoaxit 14 1.3.1 Khả tạo phức NTĐH 14 1.3.2 Khả tạo phức aminoaxit với NTĐH 17 1.4 Hoạt tính sinh học ứng dụng phức chất NTĐH với aminoaxit 18 1.5 Một số phương pháp nghiên cứu phức chất 19 1.5.1 Phương pháp phân tích nhiệt .19 1.5.2 Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại 20 1.5.3 Phương pháp đo độ dẫn điện 21 1.6 Đối tượng thăm dị hoạt tính sinh học phức chất 23 1.6.1 Giới thiệu lạc 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 1.6.2 Giới thiệu protein, proteaza lipaza 23 1.6.3 Giới thiệu chủng vi sinh vật kiểm định .24 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 2.1 Hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Hóa chất .27 2.1.2 Thiết bị 28 2.2 Tổng hợp phức chất rắn 29 2.2.1 Phức chất Ln3+ với L-histidin 29 2.2.2 Phức chất Ln3+ với axit L-aspartic 29 2.2.3 Xác định thành phần phức chất .29 2.3 Nghiên cứu phức chất phương pháp phân tích nhiệt 31 2.4 Nghiên cứu phức chất phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại 36 2.5 Nghiên cứu phức chất phương pháp đo độ dẫn điện 41 2.6 Bước đầu thăm dị hoạt tính sinh học số phức chất NTĐH với L-Histidin axit L-aspartic 43 2.6.1 Thăm dò ảnh hưởng nồng độ phức Tb(His) Cl 8H O Tb(HAsp)3.3H2O đến nảy mầm phát triển mầm hạt lạc .43 2.6.2 Thăm dò ảnh hưởng nồng độ phức chất đến số tiêu sinh hóa có mầm hạt lạc …………………… ……………… …………49 2.6.3 Hoạt tính kháng khuẩn phức Tb(His)3Cl3.8H2O Tb(HAsp)3.3H2O ….56 KẾT LUẬN 58 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN…59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ NTĐH Nguyên tố đất Ln Lantanit Ln3+ Ion Lantanit His L-histidin Asp Axit L-aspartic IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry DTPA Đietylen triamin pentaaxetic IR Infared (hồng ngoại) DTA Differential thermal analysis 10 TGA Thermogravimetry or Thermogravimetry analysis 11 NTA Nitrilotriaxetic 12 IMDA Iminođiaxetic 13 dixet  -đixetonat 14 leu Lơxin 15 ADN Acid Deoxyribo Nucleic Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các phân nhóm dãy nguyên tố đất Bảng 2.1 Kết phân tích thành phần (%) nguyên tố (Ln, C, N, Cl) phức chất 31 Bảng 2.2 Kết phân tích giản đồ nhiệt phức chất 34 Bảng 2.3 Các tần số hấp thụ đặc trưng (cm-1) L-histidin, axit L-aspartic phức chất 39 Bảng 2.4 Độ dẫn điện mol phân tử (μ) L-histidin, axit L-aspartic, TbCl 3, DyCl3 phức chất 25 ± 0,50C 42 Bảng 2.5 Ảnh hưởng nồng độ phức Tb(His)3Cl3.8H2O Tb(HAsp)3.3H2O đến nảy mầm hạt lạc 43 Bảng 2.6 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến phát triển mầm hạt lạc 44 Bảng 2.7 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến phát triển mầm hạt lạc 45 Bảng 2.8 Ảnh hưởng phức Tb(His)3Cl3.8H2O, TbCl3 L-histidin đến nảy mầm hạt lạc 46 Bảng 2.9 Ảnh hưởng phức Tb(HAsp)3.3H2O, TbCl3 axit L-aspartic đến nảy mầm hạt lạc 47 Bảng 2.10 Kết so sánh ảnh hưởng phức Tb(His)3Cl3.8H2O, TbCl3 Lhistidin đến phát triển mầm hạt lạc 47 Bảng 2.11 Kết so sánh ảnh hưởng phức Tb(HAsp)3.3H2O, TbCl3 axit Laspartic đến phát triển mầm hạt lạc 48 Bảng 2.12 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào khối lượng protein 50 Bảng 2.13 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ tyrosin 51 Bảng 2.14 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng protein mầm hạt lạc 52 Bảng 2.15 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng protein mầm hạt lạc 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii Bảng 2.16 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng proteaza mầm hạt lạc 54 Bảng 2.17 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng proteaza mầm hạt lạc 54 Bảng 2.18 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng lipaza mầm hạt lạc 55 Bảng 2.19 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng lipaza mầm hạt lạc 56 Bảng 2.20 Kết thử hoạt tính kháng sinh………………………………………57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Giản đồ phân tích nhiệt phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O 32 Hình 2.2 Giản đồ phân tích nhiệt phức chất Dy(His)3Cl3.8H2O 32 Hình 2.3 Giản đồ phân tích nhiệt phức chất Tb(HAsp)3.3H2O 33 Hình 2.4 Giản đồ phân tích nhiệt phức chất Dy(HAsp)3.3H2O 33 Hình 2.5 Phổ hấp thụ hồng ngoại L-histidin 36 Hình 2.6 Phổ hấp thụ hồng ngoại phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O 37 Hình 2.7 Phổ hấp thụ hồng ngoại phức chất Dy(His)3Cl3.8H2O 37 Hình 2.8 Phổ hấp thụ hồng ngoại axit L-aspartic 38 Hình 2.9 Phổ hấp thụ hồng ngoại phức chất Tb(HAsp)3.3H2O 38 Hình 2.10 Phổ hấp thụ hồng ngoại phức chất Dy(HAsp)3.3H2O 39 Hình 2.11 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến phát triển mầm hạt lạc 44 Hình 2.12 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến phát triển mầm hạt lạc 45 Hình 2.13 Ảnh hưởng phức chất Tb(His) Cl 8H O, TbCl L-histidin đến phát triển mầm hạt lạc 48 Hình 2.14 Ảnh hưởng phức chất Tb(HAsp) 3H O, TbCl axit Laspartic đến phát triển mầm hạt lạc 49 Hình 2.15 Đường chuẩn xác định protein 50 Hình 2.16 Đường chuẩn xác định proteaza 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hóa học phức chất lĩnh vực quan trọng hóa học đại Việc nghiên cứu phức chất nhiều nhà khoa học giới quan tâm, chúng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác như: nông nghiệp, công nghiệp, sinh học, y dược công nghệ Phức chất nguyên tố đất (NTĐH) với aminoaxit đa dạng phong phú, chúng nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Một vài phức chất NTĐH với glixin, histidin, axit glutamic, phenylalanin, L-tyrosin tổng hợp nghiên cứu theo tài liệu [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30].… Đến tạo phức aminoaxit với khoảng 50 ion kim loại nghiên cứu, kết thu khẳng định nhiều phức chất NTĐH với aminoaxit có hoạt tính sinh học, nâng cao suất chất lượng vật nuôi trồng Các viên thuốc chứa lượng nhỏ NTĐH định thử nghiệm thực tế lâm sàng, tạo nhiều triển vọng nghiên cứu chúng y học Ở nước ta việc nghiên cứu, sử dụng NTĐH chế phẩm chúng vào lĩnh vực nông nghiệp giai đoạn đầu Từ năm 1990, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Thổ nhưỡng tiến hành thử nghiệm sử dụng NTĐH cho số trồng thu kết khả quan Trong lĩnh vực y học, năm 1995 bắt đầu thử nghiệm hoạt tính chống ung thư số đất aspartat chuột trắng Swiss trường Đại học Y Hà Nội Đã có nhiều cơng trình, với nhiều phương pháp khác nghiên cứu tạo phức NTĐH với aminoaxit Phức chất NTĐH với L-histisdin, axit L-aspartic nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu xong số lượng cơng trình nghiên cứu cơng bố chưa nhiều Trên sở đó, tiến hành thực đề tài:“Tổng hợp, nghiên cứu phức chất Tecbi Dysprosi với L-histidin, axit L-aspartic bước đầu thăm dị hoạt tính sinh học chúng” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Hình 2.13 Ảnh hưởng phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O, TbCl3 L-histidin đến phát triển mầm hạt lạc STT Mẫu H2 O Tb(His)3Cl3.8H2O TbCl3 L-histidin ● So sánh ảnh hưởng phức chất Tb(HAsp)3.3H2O, TbCl3 axit L-aspartic đến phát triển mầm hạt lạc Kết trình bày bảng 2.11, hình 2.14 Bảng 2.11 Ảnh hưởng phức Tb(HAsp)3.3H2O, TbCl3 axit L-aspartic đến phát triển mầm hạt lạc Mẫu Dung dịch H2 O Tb(HAsp)3.3H2O TbCl3 axit L-aspartic Nồng độ (ppm) 120 120 360 Thời gian (ngày) dT (cm) 1,66 1,23 1,37 1,17 d R (cm) 3,91 1,93 2,72 1,87 AT (%) 100 74,09 82,53 70,48 AR (%) 100 49,36 69,56 47,83 n Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 Hình 2.14 Ảnh hưởng phức chất Tb(HAsp)3.3H2O, TbCl3 axit L-aspartic đến phát triển mầm hạt lạc Mẫu Dung dịch H2 O Tb(HAsp)3.3H2O TbCl3 axit L-aspartic Từ kết bảng 2.10, 2.11, hình 2.13, 2.14 cho thấy phức chất, phối tử muối có tác dụng ức chế phát triển mầm hạt lạc Phức chất có tác dụng ức chế phối tử tốt muối, phức Tb(His)3Cl3.8H2O ức chế tốt phức Tb(HAsp)3.3H2O, phối tử L-histidin ức chế tốt phối tử axit L-aspartic, ức chế diễn rõ rệt trình phát triển rễ 2.6.2 Thăm dò ảnh hưởng nồng độ phức chất đến số tiêu sinh hóa có mầm hạt lạc Để xác định số tiêu sinh hóa : hàm lượng protein (theo phương pháp Lowry), hoạt độ proteaza (theo phương pháp Anson cải tiến) tiến hành xây dựng đường chuẩn: * Xây dựng đường chuẩn xác định protein: Dùng ống hút lấy 0,1 ÷ 0,5 ml dung dịch protein huyết bò (0,5 mg/ml) cho vào ống nghiệm đánh số từ đến Cho vào ống ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3 2% NaOH 0,1N, ml dung dịch CuSO4 0,5% 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến thể tích ml Lắc đều, để yên 15 phút, bổ sung vào ống ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc để yên 30 phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Mẫu so sánh protein: ml dung dịch D, ml nước ml dung dịch E Đo độ hấp thụ quang A dung dịch bước sóng 750 nm [3] Kết trình bày bảng 2.12, hình 2.15 Bảng 2.12 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào khối lượng protein Mẫu Khối lượng protein (huyết bò) (mg) A750 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,0601 0,0986 0,1331 0,1821 0,2153 y = 0.7878x + 0.0197 R2 = 0.9968 0.25 Độ hấpMật thụđộ quang quang 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 mg protein Hình 2.15 Đường chuẩn xác định protein * Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza: Dùng ống hút lấy thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1μmol/ml cho vào bình định mức cỡ 25 ml Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml Lấy 1ml ống nghiệm cho vào ống nghiệm có đánh số thứ tự, thêm vào ống ml dung dịch Na2CO3 6% Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng lần, để yên 30 phút nhiệt độ phòng Mẫu so sánh khơng có tyrosin: ml nước cất, ml dung dịch Na2CO3 6% ml thuốc thử Folin-Ciocalto Đo độ hấp thụ quang dung dịch bước sóng 750 nm[3] Kết trình bày bảng 2.13, hình 2.16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 Bảng 2.13 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ tyrosin Tyrosin (μmol/ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 A750 0,0454 0,0903 0,141 0,1772 0,2212 Độ hấp thụ quang Mẫu Hình 2.16 Đường chuẩn xác định proteaza 2.6.2.1 Ảnh hưởng nồng độ phức chất đến hàm lượng protein mầm hạt lạc Phương pháp thí nghiệm: Cân mẫu gam mầm lạc, nghiền nhỏ cối chày sứ, thêm vào mẫu 10ml dung dịch đệm photphat có pH = 6, trộn sau lọc li tâm, lấy phần dịch Lấy mẫu 0,2 ml dung dịch chiết cho vào ống nghiệm có đánh số, thêm vào ống nghiệm ml dung dịch D, bổ sung thêm nước cất đến thể tích ml, lắc đều, để yên 15 phút Sau lại thêm vào ống ml dung dịch E, lắc tiếp tục để 30 phút Mẫu so sánh khơng có dung dịch chiết: 5ml dung dịch D, 4ml nước ml dung dịch E Đo độ hấp thụ quang mẫu thí nghiệm bước sóng 750 nm Đối chiếu với đường chuẩn protein, tính số mg protein có mẫu Hàm lượng protein tính theo cơng thức: X = a.HSPL 100% m Trong đó: m: khối lượng mẫu (mg) X: hàm lượng protein (% khối lượng khô) a: nồng độ thu đo máy HSPL: hệ số pha lỗng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Kết phân tích hàm lượng protein mầm hạt lạc tác động phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O (dựa theo cơng thức đường chuẩn hình 2.15) trình bày bảng số 2.14 Bảng 2.14 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng protein mầm hạt lạc Nồng độ phức (ppm) Hàm lượng protein (%) Tỷ lệ % so với đối chứng 24,68 100 30 26,16 105,99 60 27,08 109,72 120 28,13 113,97 180 28,88 117,01 240 29,12 117,99 Kết phân tích hàm lượng protein mầm hạt lạc tác động phức chất Tb(HAsp)3.3H2O trình bày bảng số 2.15 Bảng 2.15 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng protein mầm hạt lạc Nồng độ phức (ppm) Hàm lượng protein (%) Tỷ lệ % so với đối chứng 24,68 100 30 25,22 102,19 60 25,97 105,22 120 26,45 107,17 180 27,00 109,40 240 27,89 113,00 Nhận xét: Qua bảng 2.14, 2.15 thấy rằng: khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240ppm, phức chất có tác dụng làm tăng hàm lượng protein Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 mầm hạt lạc Hàm lượng protein tăng theo nồng độ phức Phức Tb(His)3Cl3.8H2O làm tăng hàm lượng protein nhiều phức Tb(HAsp)3.3H2O 2.6.2.2 Ảnh hưởng nồng độ phức chất đến hoạt độ enzim proteaza mầm hạt lạc Phương pháp thí nghiệm: Cân mẫu gam mầm lạc, nghiền nhỏ cối chày sứ, thêm vào mẫu 10ml dung dịch đệm photphat có pH = 6, trộn sau lọc li tâm, lấy phần dịch Cho vào ống nghiệm có đánh số thứ tự ml tyrosin nồng độ μmol/ml, ml dịch chiết mẫu, lắc đều, để yên 300C 10 phút Thêm vào ống ml axit tricloaxetic 5%, lắc đều, tiếp tục giữ 300C 30 phút Mẫu kiểm tra làm tương tự cho dung dịch axit tricloaxetic 5% vào trước Mẫu so sánh thay ml tyrosin nồng độ μmol/ml nước cất Cho vào ống nghiệm khác ml dung dịch lọc mẫu thí nghiệm, mẫu kiểm tra mẫu so sánh, thêm vào ống ml dung dịch Na2CO3 6% ml thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng lần, lắc giữ 30 phút nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ quang mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra bước sóng 750 nm Lấy hiệu số giá trị độ hấp thụ quang mẫu kiểm tra mẫu thí nghiệm Dựa vào đồ thị chuẩn proteaza tính lượng μmol tyrosin tương ứng Từ tính đơn vị hoạt độ (ĐVHĐ) proteaza Hoạt độ proteaza tính theo cơng thức: ĐVHĐ/mg = Trong đó: (n  k) HSPL T m n: Số đo máy mẫu thí nghiệm (mg/ml) k: Số đo máy mẫu kiểm tra (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng T: Thời gian ủ enzim với chất (phút) m: Khối lượng mẫu (mg) Kết phân tích hàm lượng proteaza mầm hạt lạc tác động phức chất (dựa theo công thức đường chuẩn hình 2.16) trình bày bảng số 2.16, 2.17 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Bảng 2.16 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng proteaza mầm hạt lạc Nồng độ phức chất Đơn vị hoạt độ (mg/ml) Tỷ lệ % so với đối chứng 0,482 100 30 0,501 103,94 60 0,513 106,43 120 0,526 109,13 180 0,532 110,37 240 0,541 112,24 (ppm) Bảng 2.17 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng proteaza mầm hạt lạc Nồng độ phức chất Đơn vị hoạt độ (mg/ml) Tỷ lệ % so với đối chứng 0,472 100 30 0,482 102,11 60 0,491 104,02 120 0,505 106,99 180 0,512 108,47 240 0,527 111,65 (ppm) Qua bảng 2.16, 2.17 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240 ppm, phức chất có tác dụng làm tăng hàm lượng proteaza mầm hạt lạc Hàm lượng proteaza tăng theo nồng độ phức Phức Tb(His)3Cl3.8H2O làm tăng hàm lượng proteaza nhiều phức Tb(HAsp)3.3H2O 2.6.2.3 Ảnh hưởng nồng độ phức chất đến hoạt độ lipaza mầm hạt lạc *Phương pháp tiến hành thí nghiệm (theo tài liệu [9]) - Cân 5g hạt lạc, nghiền nhỏ thành hạt đồng thể chuyển vào bình nón 100ml, cho thêm 10 ml nước cất, lắc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 - Cho thêm 1ml dầu lạc làm chất 5ml dung dịch đệm axetat vài giọt toluen Trộn hỗn hợp cho vào tủ ấm 30oC thời gian từ 20h đến 24h - Sau ngừng phản ứng cho thêm 25ml etanol 18ml ete - Bình kiểm tra phải đun sôi dung dịch enzim 3-5 phút để làm hoạt động enzim trước cho tiếp xúc với chất - Chuẩn độ NaOH 0,1N với 0,5ml thị phenol phtalein 1% Hoạt độ lipaza dược biểu thị số minilit NaOH 0,1N 10g hạt theo công thức :  ( a  b ) f 10 w Trong đó: X: hoạt độ lipaza a: số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra b: số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm f: hệ số chỉnh lý NaOH 0.1N w: khối lương hạt (mg) Kết phân tích hàm lượng lipaza mầm hạt lạc tác động phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O (dựa theo cơng thức) trình bày bảng số 2.18 2.19 Bảng 2.18 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O đến hàm lượng lipaza mầm hạt lạc Nồng độ phức chất (ppm) Đơn vị hoạt độ (mg/ml) Tỷ lệ % so với đối chứng 0,745 100 30 0,776 104,16 60 0,778 104,43 120 0,850 114,09 180 0,876 117,58 240 0,891 119,59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Bảng 2.19 Ảnh hưởng nồng độ phức chất Tb(HAsp)3.3H2O đến hàm lượng lipaza mầm hạt lạc Nồng độ phức chất (ppm) Đơn vị hoạt độ (mg/ml) Tỷ lệ % so với đối chứng 0,745 100 30 0,749 100,53 60 0,747 100,26 120 0,812 108,99 180 0,831 111,54 240 0,849 113,95 Qua bảng 2.18, 2.19 nhận thấy: khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ppm đến 240 ppm, phức chất Tb(HAsp)3.3H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng lipaza mầm hạt lạc Hàm lượng lipaza tăng theo nồng độ phức Phức Tb(His)3Cl3.8H2O làm tăng hàm lượng lipaza nhiều phức Tb(HAsp)3.3H2O 2.6.3 Hoạt tính kháng khuẩn phức Tb(His)3Cl3.8H2O Tb(HAsp)3.3H2O 2.6.2.1 Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm thăm dị hoạt tính kháng khuẩn phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O tiến hành Phịng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa học Các chủng vi sinh vật kiểm định (6 loại vi khuẩn nấm) nuôi cấy môi trường sau: môi trường MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth) TSA (Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn, cịn mơi trường SAB, SA cho nấm Sau tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định sau: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thực dựa phương pháp pha loãng đa nồng độ Đây phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu mẫu thử thông qua giá trị thể hoạt tính MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 - Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu pha lỗng DMSO nước cất vơ trùng thành dãy nồng độ thích hợp theo yêu cầu mục đích thử Nồng độ thử cao 128 g/ml, 32 g/ml, g/ml, g/ml 0,5 g/ml - Thử hoạt tính: chuẩn bị dung dịch vi khuẩn nấm với nồng độ 5.10-5 CFU/ml tiến hành thử Lấy 10ul dung dịch mẫu thử theo nồng độ pha loãng, thêm 200ul dung dịch vi khuẩn, ủ 37oC Sau 24h, đọc giá trị MIC mắt thường Giá trị MIC xác định giếng có nồng độ chất thử thấp gây ức chế hoàn toàn phát triển vi sinh vật Giá trị IC50 tính tốn dựa số liệu đo độ đục tế bào máy đo quan phổ TECAN phần mềm raw data[31] 2.6.2.2 Kết Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn phức Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O thể bảng 2.20 Bảng 2.20 Kết thử hoạt tính kháng sinh phức chất Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Tb(His)3Cl3.8H2O Tb(HAsp)3.3H2O Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật kiểm định Giá trị IC50 (g/ml) Bacillus subtilis >128 >128 Staphylococcus aureus >128 >128 Escherichia coli >128 >128 Pseudomonas aeruginosa >128 >128 Candida albicans >128 >128 Lactobacillus fermentum >128 >128 Enterococcus faecium >128 >128 Sau tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O với vi sinh vật kiểm định nồng độ nêu trên, kết cho thấy mẫu thử khơng thể hoạt tính kháng khuẩn nồng độ thử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 KẾT LUẬN Đã tổng hợp phức rắn Ln3+ với L-histidin axit L-aspartic (Ln3+: Tb3+, Dy3+) Bằng phương pháp: phân tích nguyên tố, phân tích nhiệt, đo độ dẫn điện quang phổ hồng ngoại kết luận: - Các phức rắn có thành phần Tb(His)3Cl3.8H2O, Dy(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O, Dy(HAsp)3.3H2O - Mỗi phân tử L-histidin axit L-aspartic chiếm vị trí phối trí phức chất, liên kết với ion Ln3+ qua nguyên tử nitơ nhóm amino -NH2 qua nguyên tử oxi nhóm cacboxyl -COO- - Các phức chất nước chất điện li, ion phức phân li tương đối bền Bước đầu thăm dò ảnh hưởng phức Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O đến nảy mầm, phát triển mầm hàm lượng protein, proteaza lipaza mầm hạt lạc Chúng kết luận: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 đến 240 ppm: - Các phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O có tác dụng ức chế nảy mầm phát triển mầm hạt lạc, đặc biệt phần rễ Sự ức chế tăng theo nồng độ Phức chất có tác dụng ức chế phối tử tốt ion trung tâm - Phức chất làm tăng hàm lượng protein, proteaza lipaza có mầm hạt lạc Đã thử hoạt tính kháng khuẩn phức chất Tb(His)3Cl3.8H2O, Tb(HAsp)3.3H2O số loại vi sinh vật kiểm định (6 loại vi khuẩn nấm) Kết cho thấy phức chất hoạt tính kháng khuẩn nồng độ thử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Hữu Thiềng, Lê Thị Bích Ngọc (2012), “Tổng hợp, nghiên cứu phức chất Tecbi, Dysprosi với L-Histidin”, Tạp chí Hóa học, T.50(5B), tr.83 - 87 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng việt Đàm Anh (2010), Đất gì, http://laodong.com.vn/tintuc/Dat-hiem-lagi/19140, ngày 03/11/2010 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1998), Hóa sinh học, Nxb Giáo dục Nguyễn Lân Dũng (2001), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập III, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 107 - 235 Lê Song Dự, Nguyễn Thế Cổn (1979), Giáo trình lạc, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Được (2011), Đất - nguyên liệu kỷ, http:// www.tapchicongnghiep.vn, ngày 25/04/2011 Trần Ích (1978), Hóa sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr 12-20 Nguyên Khê (2008), Phân bón vi lượng đất hiếm, http:// www.baomoi.com, ngày 22/12/2008 Lê Chí Kiên (2007), Hóa học phức chất, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.116-117 10 Hồng Nhâm (2001), Hóa học vơ tập 3, Nxb Giáo dục 11 Ma Thị Phượng (2005), Bài giảng lạc, Đại học nông lâm – Đại học Thái Nguyên 12 Đỗ Đình Rãng, Đặng Đình Bạch, Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Thị Thanh Phong (2009), Hóa học hữu cơ, tập III, Nxb Giáo dục Việt Nam 13 Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1998), Hóa học hữu cơ, tập 2, trường ĐHSP Hà Nội I 14 Lê Hữu Thiềng (2002), Nghiên cứu tạo phức số nguyên tố đất với L - phenylalanin thăm dị hoạt tính sinh học chúng, Luận án tiến sĩ Hóa học, Hà Nội 15 Nguyễn Trọng Uyển (1979), Giáo trình chuyên đề nguyên tố hiếm, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 16 Nguyễn Trọng Uyển, Lê Xuân Thành, Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn Sĩ Tuấn (1993) , “Tổng hợp nghiên cứu tính chất số phức chất aspartat – đất nhẹ”, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, Tạp chí hóa học T.31(số 4), tr.12 - 14 17 Nguyễn Viết (2010), Đất có ý nghĩa người, http://dantri.com.vn, ngày 01/11/2010 18 Nguyễn Khắc Vinh, Bùi Đức Thắng (2010), Đất hiếm, tiềm lớn Việt Nam, http://nld.com.vn, ngày 24/10/2010 19 V.N.Alecxeiep(1971), Phân tích định lượng(tập II)- Phân tích thể tích, Lê Thị Vinh dịch, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr.261- 263 20 Http://timtailieu.vn/tai-lieu/tieu-luan-trong-trot-chu-de-cay-lac-3662/ II Tiếng Anh 21 Http://www.862 Aspartic acid 22 R Celia Carubelli, Ana M G Massabni and Sergio R de A.l eite (1998), ''L- Histidine-europium(III) complex: a spectroscopical study'', J Brazil Chem 23 Krystyna Bukietyfiska, Zofia Karwecka and Halina Podsiadty (1996), “Vanadium(III) complexes with L-histidine in aqueous solution”, Poland, pp 2613-2619 24 Yang li (1998), “Synthesis and Disinfectant activity test of the solid complexes of histidine with lanthanide nitrates”, Journal of Baoji Collecge of Atrs and siances (Natural Scince) Vol 18 No1 25 T S Martins, A A S Aráujo, M P B M Aráujo, P.C Isolani, G Vicentini(2002), “ Synthesis, characterization and thermal analysis of lanthanide picrate complexes with Glycine”, Journal of Alloys and Compounds 344, p.p 75-79 26 Yang Yuetao, Zhang Shuyi(2003), “Photoacoustic spectra of complexes of phenylalanine with La3+, Nd3+, Sm3+ and Tb3+, Journal of Molecular structure 646, p.p 103 - 109 27 Hao Xu, Liang Chen(2003), “Study on the complex site of L- Tyrosine with rare - earth element Eu3+”, Spectrochimica Acta Part A 59, p.p 657 – 662 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 28 Zhang, Zhong - Hai KU, Zong - Jun LIU, Yi QU, Song - Sheng(2005), “ Study on Thermochemistry and Thermal Decomposition Kinetics of Dy(Tyr)(Gly)3Cl3.3H2O”, Chinese Journal of Chemistry 23, p.p 1146 - 1150 29 T S Martins, J R Matos, G Vicentini and P C Isolani(2006) , “Synthesis, characterization, spectroscopy and thermal analysis of rare earth picrate complexes with L- Leucine”, Journal of Thermal Analysis and calorimetry Vol 862, p.p 351 - 357 30 Yang Zupei, Zhang Banglao, Yu Yueying, Zhang Houngyu (1998), ''Synthesis and characterazation on solid compounds of L-histisine with light rare earth chlrorides '', Journal of shaanxi normal University, Vol 26, No1, p.p 57-59 31 Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J Vlietinck, Dirk Vanden Berghe (2005), “ Bioassay for antibacterial and antifungal activities”; Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium, p.p 1-13 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... tài:? ?Tổng hợp, nghiên cứu phức chất Tecbi Dysprosi với L- histidin, axit L- aspartic bước đầu thăm dò hoạt tính sinh học chúng? ?? Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... http://www.lrc-tnu.edu.vn 29 2.2 Tổng hợp phức chất rắn 2.2.1 Phức chất Ln3+ với L- histidin (Ln3+ : Tb3+, Dy3+) Phức chất đất với L- histidin tổng hợp theo tài liệu [30] Hòa tan L- histidin nước,... nhận, liên kết thứ hai liên kết qua ngun tử oxi nhóm -COOH l? ??i có đặc tính ion nhiều Trong luận văn tổng hợp, nghiên cứu phức chất Tb3+ Dy3+ với L- histidin axit L- aspartic 1.4 Hoạt tính sinh học