Nhập môn công nghệ sinh học phần 2

CHƢƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Giảng viên: GS TS NCVCC Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ĐT: 091 534 3660; 02 379 11059; Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn TLU, 3.2020 NỘI DUNG I Mở đầu II Nuôi cấy mô nhân giống in vitro III Các kỹ thuật chuyển gen thực vật IV Sản xuất dƣợc liệu sinh học I MỞ ĐẦU cấy mô thực vật lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật + Kỹ thuật thuật vô trùng phân tách rời TV  Nhân giống in vitro thành cơng nhiều lồi trồng có giá trị mà phƣơng thức nhân giống truyền thống gặp nhiều khó khăn + Nhiều kỹ thuật áp dụng thành công:  Nuôi +Nuôi cấy đơn bội (1n) để tạo dòng chủng cho phục tráng giống trồng; + Dung nạp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo tính trạng mới; + Chọn dòng biến dị soma biến dị giao tử có khả chống chịu với đ/kiện môi trƣờng bất lợi, sản xuất bệnh virus từ thể nhiễm virus I MỞ ĐẦU Biến nạp biểu gen ngoại lai tế bào TV + Biến đổi di truyền TV cách đƣa DNA ngoại lại vào tế bào q trình phức tạp nhờ có: (1) RE; (2) kỹ thuật lai phân tử gen thị; (3) Thiết kế vector biểu cao; (4) Xây dựng kỹ thuật chuyển gen đại… + Thành công không mức tế bào mà mức độ thể hoàn chỉnh, truyền lại cho hệ sau   Chuyển gen quan trọng có giá trị kinh tế vào thực vật nhờ biến nạp tải nạp để cải thiện phẩm chất trồng  Nuôi cấy dịch huyền phù thực vật thành công bioreactor để khai hợp chất tự nhiên có giá trị sinh học cao (SX protein ngoại lai để điều trị bệnh TV có ƣu điểm chất nhiễm bẩn virus TV tác nhân gây bệnh cho ngƣời so với protein có nguồn gốc từ tế bào động vật) LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN • 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu • 1934 – 1954: - Nuôi thành công tế bào cà rốt (Gautheret, 1937); - Phát vitamine, auxin cytokinin • 1957 – 1992: - Tách ni tế bào đơn; - Vai trị auxin/cytokinin; - Tạo protoplast tái sinh cây; - Tạo đơn bội từ ni cấy túi phấn; • Sản xuất quy mô lớn diện rộng I Nuôi cấy mô nhân giống in vitro  Nuôi cấy mô (tissue culture) thuật ngữ dùng để q trình ni cấy vơ trùng in vitro phận tách rời khác thực vật (MĐ: nhân giống cải thiện di truyền,SX sinh khối sản phẩm hóa sinh, bệnh học TV, tì bảo quản nguồn gen quý= Các hoạt động CNSH TV)  Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay gọi vi nhân giống (micropropagation) đƣợc sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu nhiều phận khác thực vật có kích thƣớc nhỏ, sinh trƣởng điều kiện vô trùng ống nghiệm loại bình ni cấy khác CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MƠ- TẾ BÀO Tính tồn : - Tế bào thể sinh vật mang tồn lƣợng thơng tin di truyền cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh tế bào, loại mơ, thời kì sinh trƣởng, phát triển mà gen phù hợp hoạt động; gen không hoạt động nhƣ giai đoạn phát triển thể (do chế điều hòa hoạt động gen)  Tùy Câu hỏi: Em trình bày cấu trúc phân tử protein? - Protein đại phân tử đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc đa phân với đơn phân axit amin + Các axit amin kết hợp với thành mạch dài nhờ liêt kết peptid (chuỗi polypeptide) +Các chuỗi xoắn cuộn gấp nếp theo nhiều cách khác để tạo nên cấu trúc không gian khác định nên chức protein - Protein chất đại phân tử đƣợc tạo thành từ nhiều đơn phân axit amin + Axit amin đƣợc cấu tạo phần: nhóm amin (-NH2), nhóm cacboxyl (-COOH) nguyên tử cacbon trung tâm đính với nguyên tử hydro nhóm biến đổi R - định tính chất axit amin + Protein có tính đa dạng có 20 axit amin thành phần - Cấu trúc hóa học protein + Là hợp chất hữu gồm nguyên tố C, H, O, N thƣờng có thêm S đơi lúc có P + Thuộc loại đại phân tử, đơn phân axit amin + Có 20 loại axit amin + Mỗi axit amin có kích thƣớc trung bình 3Ao + Các axit amin liên kết với liên kết peptid tạo nên chuỗi polypeptide Liên kết peptide đƣợc tạo thành nhóm cacboxyl axit amin liên kết với nhóm amin axit amin giải phóng phân từ nƣớc + Mỗi phân tử protein gồm hay nhiều chuỗi polypeptide loại + Từ 20 loại axit amin tạo nên vô số protein khác + Mỗi loại protein đƣợc đặc trƣng số lƣợng - thành phần trật tự xếp axit amin phân tử tạo nên tính đa dạng hay đặc thù protein - Cấu trúc khơng gian protei Protein có cấu trúc nhƣ sau: a Cấu trúc bậc 1: + Là trình tự xếp axit amin vị trí liên kết hóa trị chuỗi liên kết polypeptide (chủ yếu liên kết disulfite) + Đầu mạch polypeptide nhóm amin axit amin thứ cuối mạch nhóm cacboxyl axit amin cuối + Vai trò cấu trúc bậc protein: vai trị quan trọng trình tự axit amin chuỗi polypeptide thể tƣơng tác phần chuỗi polypeptide Từ đó, tạo nên hình dạng lập thể protein, định tính chất chức nhƣ vai trò protein Sự sai lệch trình tự xếp axit amin dẫn đến sƣ biến đổi cấu trúc tính chất protein b Cấu trúc bậc (cấu trúc thứ cấp): -Biểu thị cấu trúc thông thƣờng chuỗi polypeptide - Chuỗi popypeptide thƣờng không dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α, gấp nếp ß xoắn hay vịng hình chữ U nhờ liên kết hydro axit amin gần bên c Cấu trúc bậc 3: - Là cấu trúc bậc tiếp tục co xoắn trogn không gian tạo thành cấu trúc khơng gian hình cầu đặc trƣng cho loại protein nhờ liên kết disulfua (S=S), liên kết ion, liên kết tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết Vander Waals… giúp làm tăng tính bền vững phân tử protein d Cấu trúc bậc 4: - Các chuỗi polypeptide liên kết với theo cách tạo nên cấu trúc bậc protein Tức nhiều cấu trúc bậc kết hợp thành khối cầu - Hai hay nhiều chuỗi polypeptide xoắn khơng gian tạo hình cầu nhờ liên kết yếu nhƣ liên kết hydro - Protein thực đƣợc chức chúng cấu trúc không gian tức cấu bậc bậc Câu hỏi: Em trình bày trình tách chiết tinh protein? Tùy thuộc cấu trúc, đặc điểm sinh hóa protein khác mà protein khác có q trình tách chiết tinh khác Tuy nhiên trình tách chiết tinh protein gồm bƣớc nhƣ sau: Thu hồi -Yêu cầu giảm thiểu hoạt tính protein 1.1 Thu hồi protein ngoại bào: dễ thu hồi tinh sạch; thu hồi protein từ dịch nuôi tách khỏi tế bào nuôi ly tâm lọc (0,25 điểm) 1.2 Thu hồi protein nội bào: từ nguồn động thực vật mơ phải phá vỡ để giải phóng protein 1.2.1 Phá vỡ tế bào: a Nguyên lý chung + Làm khô mô để ổn định phá vỡ tế bào động - thực vật đƣợc dễ dàng + Làm khô mô điều kiện chân không khơng khí, kết tủa dung mơi trộn với nƣớc Sau đó, thu dịch chiết enzyme từ nguyên liệu khơ cách hydrate hóa trở lại ngun liệu dung dịch đệm thích hợp + Phá vỡ học: nghiền đồng thể + Với tế bào vi sinh vật: tế bào có thành tế bào dai thành tế bào động thực vật kích thƣớc tế bào nhỏ nên dùng dung mơi không trộn nƣớc phƣơng thức vật lý: siêu âm kỹ thuật thích hợp nhất; dùng áp suất cao (ở quy mơ lớn) - Có phƣơng pháp để giải phòng protein nội bào là: phƣơng pháp enzyme, hóa học vật lý b Phƣơng pháp enzyme: + Sử dụng lysozyme, nhiên giá thành đắt, khó áp dụng quy mô lớn c Các phƣơng pháp hóa học để phân giải tế bào: + Xử lý kiềm; + Xử lý chất tẩy rửa (chú ý đến nồng độ sử dụng làm biến tính protein, ảnh hƣởng đén bƣớc tinh tiếp theo…) d Các phƣơng pháp vật lý để phân giải tế bào: + Shock thẩm thấu; + Nghiền +Trƣợt rắn: đẩy tế bào đông lạnh qua lỗ hẹp áp suất cao nhiệt độ ngồi khoảng -20oC + Trƣợt lỏng: tế bào dịch huyền phù đƣợc chuyển qua lỗ hẹp nén dƣới áp suất cao; quy mô nhỏ dùng thiết bị French Press quy mơ lớnthiết bị đồng hóa (homogenizer); Tốc độ phá vỡ tế bào giải phóng protein phụ thuộc vào số yếu tố nhƣ: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng độ tiền xử lý 1.2.2 Phân lập enzyme hòa tan: Sau phá vỡ tế bào cần phải: + Làm lạnh + Dùng dung dịch đệm thích hợp + Có diện tác nhân bảo vệ enzyme nhƣ mercaptoethanol - Các nhân tố ức chế protein phải đƣợc bổ sung để làm giảm ảnh hƣởng phân hủy protease - Các enzyme hịa tan thu thập phƣơng pháp lọc qua màng ly tâm - Các chất ổn định nhƣ ammonium sulphate đƣợc bổ sung cần thiết Tinh sơ - Chỉ áp dụng với protein có giá trị ứng dụng cao; - Quy mơ q trình tinh định lựa chọn kỹ thuật phân tách 2.1 Loại bỏ mảnh vỡ tế bào - Sau phá vỡ tế bào, bước trình tinh protein nội bào cần loại bỏ mảnh vỡ tế bào phương pháp ly tâm lọc 2.2 Ly tâm mẻ - dùng cho lượng dung tích nhỏ 2.3 Ly tâm dòng chảy liên tục: sử dụng cho quy mô lớn để loại bỏ chất dạng hạt với dạng + Ly tâm thùng rỗng + Ly tâm đĩa + Ly tâm thúng- lọc ly tâm 2.4 Lọc màng: cần phải có màng lọc có diện tích lớn có tượng lỗ màng bị bít Có thể khắc phục cách dùng phương pháp lọc dòng chảy (cross – flow) tiếp tuyến (tangential) -Trong thực tế: hạn chế phương pháp ly tâm quy mô lớn nên kỹ thuật lọc màng ly tâm phối hợp để đảm bảo dịch chiết thật cho bước sắc ký Hệ phân tích hai pha nƣớc (hay chất lỏng-chất lỏng) - Các hệ hai pha nƣớc đặc trƣng đƣợc tạo cách trộn dung dịch polyethylene glycol (PEG) dextran PEG loại muối nhƣ potassium phosphate ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt - Các protein mảnh vỡ tế bào có khả hịa tan khác hai pha, kỹ thuật đƣợc dùng cho hai trƣờng hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào phân chia protein suốt trình tinh -Sự phân chia xác protein tùy thuộc vào thơng số nhƣ khối lƣợng phân tử điện tích chúng, nồng độ khối lƣợng phân tử polymer, nhiệt độ, pH lực ion hỗn hợp diện muối đa trị nhƣ phosphate sulphate Phƣơng pháp kết tủa -Các enzyme/protein kết tủa đơn giản, phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleimine polyallylamine với dung môi hữu isopropanol, ethanol, acetone -Các streptomycin sulphate, polyetheleneimine polyamine khác kết tửa chất có tính chất axit nucleic nucleoprotein - Kết tủa đơn giản giúp loại bỏ protease giảm thể tích hoạt động tổng số, thường thừa số 20 Thay đổi pH nhiệt độ tạo kết tủa chọn lọc loại bỏ protein không mong muốn +Kết tủa ammonium + Kết tủa dung môi hữu + Kết tủa polymer khối lượng phân tử cao + Kết tủa nhiệt Các phƣơng pháp sắc ký Nguyên lý: cho phép tách biệt hợp phần khác hỗn hợp Phép phân tích sắc ký dựa vào di chuyển khác pha động chất hòa tan đƣợc gắn pha tĩnh trạng thái rắn Tƣơng tác chất hịa tan pha tĩnh tƣơng tác hấp thụ, tƣơng tác ion (trao đổi ion), tƣơng tác kỵ nƣớc, tƣơng tác kiểu rây phân tử tƣơng tác đặc hiệu sinh học 5.1 Sắc ký lọc gel: phân tách protein đƣợc dựa sở kích thƣớc phân tử Pha tĩnh chứa hạt gel (polymer) xốp có lỗ nhỏ ly ty đƣợc bao quanh pha dung môi chuyển động - Khi dung dịch chứa protein chảy qua cột phân tử lớn hỗn hợp có đƣờng kính lớn lỗ hạt gel nên khuếch tán vào bên hạt (qua lỗ nhỏ) chúng qua kẽ hở cột bị rửa khỏi cột trƣớc với thể tích dịch rửa thể tích hạt gel Vo -Các phân tử nhỏ qua lỗ nhỏ để khuếch tán vào hạt gel đƣợc rửa khỏi cột sau, thể tích dịch rửa chúng tổng thể tích cột Vt - Cần lƣu ý khơng có tƣơng tác khn chất hịa tan, mơi trƣờng lọc gel lý tƣởng phải trơ hoàn toàn Để sức chứa cực đại hạt gel phải rắn có độ xốp cao 5.2 Sắc ký trao đổi ion: - Được sử dụng rộng rãi nhất, bao gồm trao đổi cation anion mạnh yếu Các protein enzyme nói chung hấp phụ lực ion thấp giá trị pH điện tích ion tổng số đủ mạnh để tương tác với điện tích đối nhựa trao đổi ion Sự tách rửa protein thực dễ dàng cách thay đổi pH tăng lực ion dung dịch rửa - Nhựa trao đổi ion khung vật liệu rắn khơng hịa tan có gắn với nhóm ion hóa liên kết đồng hóa trị Các nhóm mang điện tích lại liên kết với ion đối (opposite ions) ion đối lại trao đổi thuận nghịch với ion trái dấu Một khung có mang nhóm tích điện dương ion đối tích điện âm, gọi nhựa trao đổi anion (anion exchange resin) Ngược lại, nhựa trao đổi cation mang điện tích âm - Các protein hỗn hợp cần phân tích thường có nhóm bên ion hóa khác nhau, có pH khác Ở giá trị pH định protein có điện tích khơng giống nhau, chúng giữ nhiều hay tương tác ion nhựa trao đổi ion cho với pha di động cho - Quá trình phân tách cột bao gồm hai giai đoạn: - Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh (và protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion - Khử hấp phụ protein cách: (1) thay đổi pH dịch rửa dẫn đến thay đổi độ ion hóa thay đổi điện tích tổng protein, (2) tăng lực ion tăng nồng độ ion đối cạnh tranh Các protein có lực với nhựa trao đổi ion yếu bị đẩy trước tiên ngược lại Khi sử dụng gradient lực ion hoặc/và gradient pH thường làm tăng chất lượng phép phân tách protein 5.3 Sắc ký lực - Phƣơng pháp dựa vào khả liên kết đặc hiệu thuận nghịch protein với phân tử khác (phối tử), đƣợc gắn liên kết đồng hóa trị vào chất mang khơng hịa tan chứa cột sắc ký Khi cho hỗn hợp có chứa protein cần làm qua có protein quan tâm bị giữ lại, cịn tất protein khác không tƣơng tác đƣợc với phối tử (ligand) bị rửa trơi khỏi cột Tiếp đó, protein bị rửa giải phƣơng pháp khác - Phƣơng pháp sắc ký lực hiệu việc tinh enzyme, cho phép thu đƣợc enzyme có độ cao (hơn sắc ký trao đổi ion khoảng 10 lần) giai đoạn thời gian ngắn - Các nhân tố nhƣ chất mang, phối tử, phƣơng pháp gắn kết phối tử nhƣ điều kiện rửa giải enzyme có vai trị quan trọng sắc ký lực - Chất mang (pha tĩnh): phải có số tính chất sau: +Hồn tồn khơng hịa tan pha di động + Có độ bền hóa học sinh học + Có độ cứng học, có tính háo nƣớc tính thấm + Khơng có tƣơng tác phi đặc hiệu + Có chứa nhiều nhóm chức có khả biến đổi hoạt hóa điều kiện nhẹ nhàng - Phối tử thường chất tương tự chất enzyme muốn tinh sạch, chất kìm hãm cofactor Phối tử nói chung phải đặc hiệu với protein phải có lực trung bình với - Hoạt hóa chất mang - Rửa giải: Sau loại bỏ protein khác, enzyme cần tinh rửa giải khỏi cột sắc ký nhờ phức hợp với phối tử có chất phi đồng hóa trị thuận nghịch Dung dịch rửa giải thường phải có: (1) có chứa phối tử tự enzyme có khả cạnh tranh với phối tử trạng thái liên kết với enzyme, (2) pH gây biến tính thuận nghịch enzyme làm biến dạng tâm hoạt động enzyme 5.4 Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc: Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước protein bề mặt đặc điểm để chọn lọc Loại phân tách thích hợp tiến hành bước kết tủa ammonium sulphate, không cần thiết phải loại bỏ muối trước thực bước sắc ký 5.5 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC -Đây phương pháp phân tách chất cách dùng áp suất để đẩy nhanh dung dịch qua cột sắc ký với hiệu suất cao Ngồi ra, cịn áp dụng phương pháp phân tách protein khác siêu lọc (sau thẩm tích lọc gel để khử muối trao đổi đệm Tài liệu tham khảo Nguyễn Hồng Lộc (2007) Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học Nhà xuất Đại học Huế  Tài liệu trang web/google  ... dƣợc liệu sinh học I MỞ ĐẦU cấy mô thực vật lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật + Kỹ thuật thuật vô trùng phân tách rời TV  Nhân giống in vitro thành công nhiều... - Tiến hành bảo quản 2. 3.3 NHÂN GIỐNG TRONG CÁC NỒI PHẢN ỨNG SINH HỌC  Các nồi phản ứng sinh học hay cịn gọi bình lên men (fermenter) chủ yếu đƣợc dùng cho công nghệ vi sinh;  Vận hành theo... 1 .2 NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ 1 .2. 1.Tái sinh từ cấu trúc sinh dƣỡng a/ Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh - Phƣơng thức sử dụng phận nhỏ đỉnh chồi hay đỉnh sinh