NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 3 ppt

CHƯƠNG III CÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG NGHỆ GEN I- SƠ ĐỒ KHÁI QUÁT II- CÁC CÔNG CỤ III- CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CĂN BẢN IV- PHƯƠNG PHÁP PCR V. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC NUCLEOTIDE CỦA GEN • Vào năm 1972 – 1973, Berg, Boyer và Cohen ở Mó đã tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp in vitro từ ba nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Tiếp theo, 1973 – 1974, nhóm Cohen, Helinski, Boyer đã lần đầu tiên nhận được DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học. Sự khác nhau căn bản của kó thuật mới với phương pháp cũ ở chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in vitro (trong ống nghiệm) tạo thành (ghép nối) các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở vào tế bào sống từ các đoạn DNA khác nhau có lựa chọn. Kể THUAT TAI TO HễẽP DNA. 1. Sụ ủoõ khaựựi quaựựt. [...]... Phân huỷ cả 2 đầu mút 3 và 5’ của DNA không cắt nội liên kết Nuclease BAL31 S1 nuclease Phân huỷ DNA mạch đơn Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3 –> 5’ Taq DNA polymerase DNA polymerase chòu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquatus 2 CÁC VECTOR CHUYỂN GEN - Vector plasmid - Phage lamda - Cosmid - YAC (Yeast artificial chromosome –NST nhân tạo của nấm men) • - Ti-plasmid từ vi khuẩn... là c-DNA (complementary DNA) từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hoá học Nhờ enzyme reverse transcriptase này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có mặt mRNA của gen đó Các c-DNA mạch đơn có thể được biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là c-DNA kép (c-DNA duplex) • Đoạn c-DNA kép được gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng c-DNA... phóng xạ • 3 Điện di trên gel • 4 Lai nucleic acid 3 Thu nhận gen • a Tách các đoạn DNA từ bộ gen • b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học • - Hormone somatostatin • - Insulin • c Sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen tương ứng ORNL Wadsworth Center ORNL Wadsworth Center 4 TẠO PLASMID TÁI TỔ HP • 1 Phương pháp đơn giản dùng các đầu cố kết • 2 Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers) • 3 Phương pháp... Vi tiêm (micro-injection) d Bắn DNA vào tế bào Các hạt kim loại tungsten hay vàng 6.CHỌN LỌC, TẠO DÒNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN • a Xác đònh dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp • - Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid • - Tế bào nhận được plasmid không có gen lạ vào • - Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp • Thấp hơn 1 phần tỉ • a Lai nucleic acid • b Bổ sung - (α -Comflementation)... dụng nhiều thế kỉ trong sản xuất bánh mì và bia, đưa vào danh sách sinh vật an toàn thực phẩm c Các hệ thống tế bào thực vật d Các hệ thống tế bào động vật • – Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney (COS) • – Tế bào thận chuột đồng con (Baby hamster kidney (BHK) • – Tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney (HEK- 239 ) • – Tế bào tử cung chuột bạch (Chinese hamster ovary (CHO) •... của DNA (nhiều bản sao giống nhau) • – Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA • – Chuyển gen vào tế bào các sinh vật khác • – Sản xuất RNA • – Sản xuất protein từ gen được tạo dòng a) Các vector plasmid • Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất là pBR322 (hình 3. 4) Như mô tả, plasmid này có gen kháng ampicilline (ampR), gen kháng tetracyline (tetR), trình tự xuất phát sao chép... và nhiều trình tự nhận biết đặc hiệu cho các RE như EcoRI , HindIII, BamHI, SalI, Nó có khả năng sao chép độc lập với bộ gen tế bào E.coli và tồn tại với số lượng trung bình 20 – 30 bản sao cho mỗi tế bào Plasmid pBR322 3 Các hệ thống tế bào chủ • – Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng • – Dùng để biểu hiện gen tái tổ hợp, đặc biệt ở Eukaryotae bậc cao như tế bào động thực vật... Thermophilus aquatus 2 CÁC VECTOR CHUYỂN GEN - Vector plasmid - Phage lamda - Cosmid - YAC (Yeast artificial chromosome –NST nhân tạo của nấm men) • - Ti-plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens • - Phage 1 mach M 13 • • • • MCR : MULTICLONING REGION Các vector chuyển gen phải thoả mãn các yêu cầu tối thiểu : • – Có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập • – Có các trình tự... bạch (Chinese hamster ovary (CHO) • – Tế bào côn trùng nuôi Baculovirus biểu hiện protein người • – Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans III CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CĂN BẢN 1 Lai nucleic acid 3 phương pháp lai trên pha rắn được sử dụng rộng rãi nhất : – Thấm Southern (Southern blot), do ông E Southern tìm ra, dùng cho DNA – Thấm Northern (Northern blot) dùng cho RNA – Phương pháp dot (điểm) . CHƯƠNG III CÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG NGHỆ GEN I- SƠ ĐỒ KHÁI QUÁT II- CÁC CÔNG CỤ III- CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CĂN BẢN IV- PHƯƠNG PHÁP PCR V. XÁC ĐỊNH TRÌNH. GEN • - Vector plasmid • - Phage lamda • - Cosmid • - YAC (Yeast artificial chromosome –NST nhân tạo của nấm men) • - Ti-plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens • - Phage 1 mach M 13.