Khảo sát đa hình gen CYP2C93 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Lệ Hằng KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1 TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Thị Lệ Hằng, học viên cao học khóa 25 (2016-2018), chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn của: TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm Ngƣời viết cam đoan Đỗ Thị Lệ Hằng LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung người hướng dẫn khoa học, người Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tơi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội, mã số: QG.17.29 cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Trung Kiên, chủ nhiệm đề tài hỗ trợ tạo điều kiện cho thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy cô, nhà Khoa học Hội Đồng chấm đề cương luận văn tốt nghiệp đóng góp ý kiến q báu, giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu nhà trường, phịng Đào Tạo sau Đại Học, Thầy Cơ Khoa Sinh học Thầy Cô môn Sinh học Tế Bào Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội cho kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Các cán Bộ môn Y Dược học sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Các bác sĩ nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội giúp đỡ tơi nhiều q trình hồn thành luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn Bố Mẹ người thân gia đình với bạn bè đồng nghiệp chỗ dựa vững tơi, ln thương u, khuyến khích, động viên tạo điều kiện tốt tinh thần giúp hồn thành tốt chương trình học tập thực thành công luận văn Cuối xin gửi lời tri ân tới bệnh nhân tham gia vào nhóm nghiên cứu, đóng góp bệnh nhân giúp tơi có thành cơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lý van tim thay van tim 1.2 Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim 1.3 Dược di truyền học acenocoumarol 1.4 Tổng quan đa hình di truyền gen CYP2C9*3 gen VKORC1 1.4.1 Khái niệm đa hình đơn nucleotide 1.4.2 Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 mối liên quan tới liều thuốc acenocoumarol 11 1.4.3 Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 mối liên quan tới liều thuốc acenocoumarol 15 1.4.4 Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 18 1.5 Tình hình nghiên cứu mối liên quan di truyền học liều thuốc acenocoumarol giới nước 21 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 26 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 26 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 27 2.3.1 Hóa chất 27 2.3.2 Thiết bị 28 2.3.3 Dụng cụ 28 2.3.4 Mẫu nghiên cứu 28 2.4 Các bước nghiên cứu 29 2.4.1 Quy trình nghiên cứu 29 2.4.2 Thu thập, xử lý bảo quản mẫu 30 2.4.3 Tách chiết kiểm tra chất lượng DNA tổng số 30 2.4.4 Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 32 2.4.5 Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 phương pháp PCR 32 2.4.6 Tinh sản phẩm PCR 33 2.4.7 Xác định kiểu gen SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải trình tự gen 34 2.4.8 Xác định kiểu gen SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự gen 35 2.4.9 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 37 2.5 Xử lý phân tích số liệu 37 2.6 Các loại sai số cách khắc phục 37 2.6.1 Sai số mắc phải 37 2.6.2 Cách khắc phục sai số 37 2.7 Đạo đức nghiên cứu 38 Chƣơng KẾT QUẢ 39 3.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 39 3.2 Kết phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKOCR1 40 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 40 3.2.2 Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 41 3.2.3 Kết khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 47 3.2.4 Kết phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 50 3.3 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 55 3.3.1 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 55 3.3.2 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP rs9923231 rs99 rs9934438 gen VKORC1 56 3.4 Tỷ lệ kiểu gen phối hợp SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 57 Chƣơng BÀN LUẬN 58 4.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 59 4.2 Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 60 4.3 Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934348 gen VKORC1 62 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 76 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AHA American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Mỹ AVK Anti Vitamin K : Kháng vitamin K AF Atrial Fibrillation: Rung nhĩ bp Base pair (cặp bazơ) cs cộng COA Thuốc chống đông máu đường uống họ Coumarinic DVT Deep Venous Thrombosis: Huyết khối tĩnh mạch sâu dNTP Deoxyrinucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate DNA Deoxyribonucleic Acid (Acid deoxyribonucleic) HVR Heart Valve Replacement: Thay Van Tim EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid INR International Normalized Ratio: Chỉ số bình thường hố Quốc Tế NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase PT Prothrombin RE Restriction Enzym: enzym cắt giới hạn RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn SNP Single Nucleotide Polymorphism: Đa hình đơn nucleotide TAE Tris base, acetic acid and EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Mối liên quan đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol 14 Bảng 1.2 Mối liên hệ kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol 16 Bảng 1.3 Tần số phân bố alen gen CYP2C9 quần thể người 23 Bảng 1.4 Tần số phân bố alen gen CYP2C9 quần thể người 23 Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa alen 32 Bảng 2.2 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen rs9923231 gen VKORC1 35 Bảng 2.3 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen rs9923231 gen VKORC1 36 Bảng 3.1 Một số đặc điểm chung nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 39 Bảng 3.2 Kết kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tổng số 41 Bảng 3.3 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 47 Bảng 3.4 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 48 Bảng 3.5 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 48 Bảng 3.6 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 55 Bảng 3.7 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Buồng tim vị trí van tim Hình 1.2 Cấu trúc hoá học acenocoumarol Hình 1.3 Ảnh hưởng gen CYP2C9 gen VKORC1 tới acenocoumarol Hình 1.4 Mô tả Single nucleotide polymorphisms Hình 1.5 Mơ tả Haplotype 10 Hình 1.6 Vị trí nhiễm sắc thể số 10 NST người 12 Hình 1.7 Vị trí gen CYP2C9 nhiễm sắc thể số 10 12 Hình 1.8 Vai trị Cytochrome P450 chuyển hố thuốc 13 Hình 1.9 Vị trí nhiễm sắc thể số 16 NST người 15 Hình 1.10 Vị trí gen VKORC1 nhiễm sắc thể số 16 15 Hình 1.11 Gen VKORC1 15 Hình 1.12 Giải trình tự gen máy tự động 19 Hình 1.13 Enzym cắt tạo đầu dính cắt tạo đầu 20 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0,7% 40 Hình 3.2 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 42 Hình 3.3 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 42 Hình 3.4 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 43 Hình 3.5 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 44 Hình 3.6 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 45 Hình 3.7 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 46 Hình 3.8 Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438 49 Hình 3.9 Kết giải trình tự SNP CYP2C9*3 50 Hình 3.10 Sản phẩm RFLP SNP rs9923231 gen VKORC1 51 Hình 3.11 Sản phẩm RFLP SNP rs9934438 gen VKORC1 52 Hình 3.12 Kết giải trình tự SNP rs9923231 gen VKORC1 53 Hình 3.13 Kết giải trình tự SNP rs9934438 gen VKORC1 54 PHỤ LỤC DANH SÁCH KẾT QUẢ KIỂU GEN CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU Kết kiểu gen STT Kí hiệu mẫu CYP2C9*3 rs9923231 rs9934438 gen VKORC1 gen VKORC1 Đt 01 AA AG AA Đt 02 AA AA AA Đt 03 AA AG AA Đt 04 AC AA AA Đt 05 AA AA AA Đt 06 AA AA AA Đt 07 AA AA AA Đt 08 AA AG AG Đt 09 AA AA AA 10 Đt 10 AA AA AA 11 Đt 11 AA AA AA 12 Đt 12 AA AA AA 13 Đt 16 AA AG AA 14 Đt 17 AA AG AA 15 Đt 18 AA AA AA 16 Đt 19 AA AA AA 17 Đt 21 AA AA AA 18 Đt 22 AA AG AA 19 Đt 23 AA AG AG 20 Đt 24 AA AA AA 21 Đt 25 AA AG AG 22 Đt 26 AA AA AA 84 23 Đt 27 AC AA AA 24 Đt 28 AA AG GG 25 Đt 31 AA AA AA 26 Đt 32 AA AA AA 27 Đt 33 AA AA AA 28 Đt 34 AA AA AA 29 Đt 35 AA AA AA 30 Đt 36 AA AA AA 31 Đt 38 AA AG GG 32 Đt 39 AA AG AG 33 Đt 40 AA AA AA 34 Đt 42 AC AG AA 35 Đt 44 AA AA AA 36 Đt 46 AA AG AG 37 Đt 48 AA AA AA 38 Đt 49 AA AA AA 39 Đt 51 AA AG AG 40 Đt 52 AA AA AA 41 Đt 53 AA AG AA 42 Đt 58 AA AG AA 43 Đt 61 AA AG AA 44 Đt 65 AA AA AA 45 Đt 67 AA AA AA 46 Đt 68 AA AA AA 47 Đt 69 AA AA AA 48 Đt 71 AA AG AA 49 Đt 72 AA AA AA 50 Đt 73 AA AG AA 85 51 Đt 74 AA AA AA 52 Đt 75 AA AA AA 53 Đt 78 AA AA AA 54 Đt 79 AA AA AA 55 Đt 80 AA AA AA 56 Đt 82 AA AA AA 57 Đt 84 AA 58 Đt 85 AA AG AA 59 Đt 86 AA AA AA 60 Đt 87 AA AA AA 61 Đt 88 AA AA AA 62 Đt 89 AA AG AA 63 Đt 90 AA 64 Đt 92 AA AG AA 65 Đt 93 AA AA AA 66 Đt 94 AA AA AA 67 Đt 95 AA AA AA 68 Đt 96 AA AA AA 69 Đt 97 AA AA AA 70 Đt 98 AA AG AA 71 Đt 99 AA AG AG 72 Đt 100 AA AA AA 73 Đt 101 AA AA AA 74 Đt 102 AA AA AA 75 Đt 103 AA AA AA 76 Đt 104 AA AA AA 77 Đt 105 AA AA AA 78 Đt 107 AA AA AA 86 AA AA AA AA 79 Đt 109 AA AG AG 80 Đt 110 AA AA AA 81 Đt 113 AA AA AA 82 Đt 114 AA AA AA 83 Đt 115 AC GG GG 84 Đt 117 AA AA AA 85 Đt 118 AA AA AA 86 Đt 123 AA AA AA 87 Đt 124 AA AG AG 88 Đt 126 AA AG AG 89 Đt 127 AA AA AA 90 Đt 128 AA AG AA 91 Đt 129 AA AG AA 92 Đt 130 AA AA AA 93 Đt 132 AA AG AA 94 Đt 136 AA AA AA 95 Đt 140 AA AA AG 96 Đt 141 AA AA AA 97 Đt 145 AA AG AA 98 Đt 146 AA AA AA 99 Đt 147 AA AG AA 100 Đt 148 AA AA AA 87 ... thuật, hoạt động van nhân tạo, biến chứng hay gặp việc sử dụng thuốc chống đơng máu sau thay van tim Có thể nói thay van tim thay ? ?bệnh van tim? ?? ? ?bệnh van tim nhân tạo” Nguyên nhân van tim thể người... QUAN 1.1 Bệnh lý van tim thay van tim Bệnh lý van tim bệnh phổ biến Việt Nam cấu bệnh lý tim mạch nói chung Nguyên nhân gây tổn thương van tim phần lớn di chứng bệnh lý thấp tim [2] Bệnh nhân có... rs9934438 gen VKORC1 Khảo sát đƣợc tần số phân bố alen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 quần thể bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol Bệnh Viện Tim Hà