Xác định đồng thời một số độc tố nhóm ergot alkaloids trong ngũ cốc bằng phương pháp LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN HOÀNG GIANG C Đ NH Đ NG THỜI M T S Đ CT NHÓM ERGOT ALKALOIDS TRONG NGŨ C C BẰNG PHƢƠNG PH P LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN HOÀNG GIANG C Đ NH Đ NG THỜI M T S Đ CT NHÓM ERGOT ALKALOIDS TRONG NGŨ C C BẰNG PHƢƠNG PH P LC-MS/MS Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Trần Cao Sơn PGS TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng Hà Nội – 2021 LỜI CẢM ƠN Đề tài đƣợc thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Phƣờng Mai Dịch, Quận Cầu Giấy, Thành phố Hà Nội Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn TS Trần Cao Sơn PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, đồng nghiệp Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa phân tích, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em kiến thức quan trọng, cần thiết bổ ích Cuối xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình ln bên cạnh ủng hộ, động viên để em hồn thành khóa luận cách tốt Trong trình thực hiện, dù cố gắng nhƣng khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót, kính mong nhận đƣợc bảo, đánh giá từ quý thầy cô ngƣời in chân thành cảm ơn! i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Hiệp hội cộng đồng phân Analytical Communities tích thức CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản DEFRA Department of Enviroment, Food Bộ Môi trƣờng, Thực phẩm and Rural Affairs Nơng thơn phủ Anh Dispersive Solid Phase Chiết phân tán pha rắn d-SPE Extraction EA Ergot Alkaloids Ergot Alkaloids ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent Kỹ thuật thử miễn dịch liên kết Assay enzyme ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FERA Food and Enviroment Research Cục Nghiên cứu Thực phẩm Agency Môi trƣờng thuộc Bộ Môi trƣờng, Thực phẩm Nơng thơn phủ Anh FLD Fluorescent Detector Detector huỳnh quang GC-MS Gas chromatography Sắc ký khí HLB Hydrophilic Lipophilic Balance Cân thân nƣớc thân dầu HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ hai lần mass spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng ii Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt QCVN National Technical Regulation Quy chuẩn quốc gia MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng MS Mass spectrometry Khối phổ R Recovery Độ thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn SXC Strong Cation Exchange Trao đổi Cation mạnh TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultra Violet Tử ngoại iii DANH MỤC C C BẢNG Bảng 1.1 Phân nhóm ergopeptine Bảng 1.3 Môi trƣờng chiết EA 12 Bảng 1.4 Phƣơng pháp làm mẫu chiết pha rắn 15 Bảng 1.5 Một số nghiên cứu xác định EA sử dụng LC/MS-MS 20 Bảng 2.1 Các độc tố EA đƣợc sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Các EA đƣợc sử dụng nghiên cứu điều kiện MS/MS 31 Bảng 3.2 Các thông số tối ƣu MS để phân tích EA 33 Bảng 3.3 Chƣơng trình gradient phân tích EA 34 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ amoni acetate đến hiệu suất thu hồi EA 38 Bảng 3.5 Tỷ lệ ion EA 44 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi Ergosine 48 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi Ergocryptine 48 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi Ergocornine 49 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ thu hồi Ergocristine 49 Bảng 3.10: Kết phân tích mẫu chuẩn T22149QC 50 Bảng 3.11 Kết phân tích mẫu thực tế 53 iv DANH MỤC C C HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hệ thống vòng ergoline tetracyclic Hình 1.2 Cấu trúc chung ergopeptine Hình 1.3 Đồng phân cấu hình R S ergosine Hình 1.4 Phản ứng epimer hóa peptid alkaloids C-8 Hình 2.1 Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ 26 Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc EA 28 Hình 3.1 Sự phụ thuộc diện tích vào giá trị pH EA 34 Hình 3.2 Sắc ký đồ tổng (TIC) EA 35 Hình 3.3 Sắc ký đồ (MRM) EA 35 Hình 3.4 Ảnh hƣởng phƣơng pháp chiết đến hiệu suất thu hồi 36 Hình 3.6 Minh họa sắc ký đồ khảo sát nồng độ nồng độ amoni acetate Ergocristine 39 Hình 3.7 Sự phụ thuộc tín hiệu vào tỉ lệ dung mơi EA 39 Hình 3.8 Ảnh hƣởng thể tích dung mơi chiết đến hiệu suất thu hồi EAs 40 Hình 3.9 Ảnh hƣởng pha rắn đến hiệu suất thu hồi EA 41 Hình 3.10 Ảnh hƣởng khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi EA 42 Hình 3.11 Minh họa sắc ký đồ khảo sát khối lƣợng pha rắn Ergocristine 42 Hình 3.12 Quy trình xử lý mẫu tối ƣu 43 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn EAs 45 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ 0,3 µg/kg 46 Hình 3.15 Đƣờng chuẩn phân tích Ergocristine 47 Hình 3.16: Sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn T22149QC 51 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ergot alkaloids 1.1.1 Khái quát ergot alkaloids 1.1.2 Cấu trúc chung ergot alkaloids 1.1.4 Tính chất hóa lý nhóm ergot alkaloid 1.1.5 Độ ổn định nhóm ergot alkaloids 1.1.6 Độc tính nhóm ergot alkaloid 1.1.7 Quy định hành với ergot alkaloids 10 1.2 Phƣơng pháp xác định độc tố ergot alkaloids 11 1.2.1 Phƣơng pháp chiết 12 1.2.2 Phƣơng pháp làm 13 1.2.3 Phƣơng pháp xác định 16 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Đối tƣợng, nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.3.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 25 vi 2.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 26 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3.2 Dung mơi, hóa chất 27 2.3.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 28 2.4.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 28 2.4 Phƣơng pháp lấy mẫu 30 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 30 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời số EA thực phẩm 31 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 31 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 36 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 43 3.2.1 Độ đặc hiệu 44 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 46 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 48 3.3 Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích số sản phẩm ngũ cốc có thị trƣờng 50 3.3.1 Vật liệu chuẩn T22149QC 50 3.3.2 Phân tích mẫu thực tế 51 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC PL-1 vii MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngũ cốc (nhƣ lúa, ngơ, đại mạch, lúa mì, …) chế phẩm từ ngũ cốc (sữa bột, thực phẩm ăn kiêng, bảo vệ sức khỏe, làm đẹp…) tăng lên giá trị dinh dƣỡng mà chúng đem lại Trong đó, đặc biệt bột ngũ cốc nguồn thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, giàu chất xơ hịa tan; giúp bảo vệ tim mạch, giảm nguy bị tiểu đƣờng, béo phì, hen suyễn trẻ ngăn ngừa ung thƣ Vì vậy, chế phẩm ngũ cốc ăn kiêng, giảm cân; nhƣ sản phẩm làm đẹp cho phụ nữ, dinh dƣỡng cho trẻ ngày phổ biến nƣớc ta Nhƣng sản phẩm nguyên liệu chế biến gần nhƣ phải nhập hồn tồn nên việc kiểm định, kiểm sốt chất lƣợng thực phẩm cịn nhiều khó khăn Mặt khác, ngũ cốc tiềm ẩn nhiều loại độc tố vi nấm đe dọa đến sức khỏe ngƣời dùng [14] Ergot alkaloids (EA) độc tố vi nấm có nguồn gốc từ tryptophan đƣợc sinh lồi nấm Claviceps spp ký sinh ngũ cốc nhƣ: lúa mì, lúa mạch, yến mạch, … hình thành nên hạch nấm, tiết loại độc tố Khi tiêu thụ ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc chứa hạch nấm, ngƣời bị ngộ độc cấp tính nhƣ co giật với triệu chứng nhiễm độc thần kinh trung ƣơng ngộ độc mạn tính nhƣ hoại thƣ [14] Đồng thời, ergot ankaloids dễ bị chuyển từ dạng có độc tính sang dạng khơng độc ngƣợc lại trình bảo quản nguyên liệu, chế biến phân tích nên gây cản trở việc phát kiểm soát hàm lƣợng [25] Tại Việt Nam, Bộ Y tế có quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia giới hạn nhiễm độc vi nấm thực phẩm QCVN 8-1:2011/BYT với quy chuẩn aflatoxin, ochratoxin, patulin, deoxynivalenol, zearalenone fumonisin thực phẩm Tuy nhiên quy chuẩn chƣa có quy định giới hạn cho phép hàm lƣợng độc tố vi nấm EAs, đƣợc đặt nhiều nƣớc giới [12] Hiện nay, giới chƣa có phƣơng pháp kiểm nghiệm thức cho EA quy định hàm lƣợng tối đa chƣa cụ thể cho EA [7],[13] Tại Việt Nam, chƣa có khảo sát loại độc tố nhóm Do đó, để đảm bảo Sắc ký đồ khảo sát thành phần (NH4)2CO3 dung môi chiết Ergocornine Sắc ký đồ khảo sát thành phần (NH4)2CO3 dung môi chiết Ergocristine PL-10 Phụ lục 2-4 Khảo sát thể tích dung mơi chiết Sắc ký đồ khảo sát thể tích dung mơi chiết Ergosine Sắc ký đồ khảo sát thể tích dung mơi chiết Ergocryptine PL-11 Sắc ký đồ khảo sát thể tích dung mơi chiết Ergocornine Sắc ký đồ khảo sát thể tích dung môi chiết Ergocristine PL-12 Phụ lục 2-5 Khảo sát khối lượng pha rắn Sắc ký đồ khảo sát khối lƣơng pha rắn Ergosine Sắc ký đồ khảo sát khối lƣơng pha rắn Ergocryptine PL-13 Ergocornine Sắc ký đồ khảo sát khối lƣơng pha rắn Ergocornine Sắc ký đồ khảo sát khối lƣơng pha rắn Ergocristine PL-14 Phụ lục 2-6 Khảo sát pha rắn Sắc ký đồ khảo sát pha rắn Ergosine Sắc ký đồ khảo sát pha rắn Ergocryptine PL-15 Sắc ký đồ khảo sát khối lƣơng pha rắn Ergocornine Sắc ký đồ khảo sát pha rắn Ergocristine PL-16 Phụ lục Kết xác định độ lặp lại EA sắc ký đồ Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergosine mức thêm chuẩn 10 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergosine mức thêm chuẩn 50 µg/kg PL-17 Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergosine mức thêm chuẩn 100 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocrytine mức thêm chuẩn 10 µg/kg PL-18 Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocryptine mức thêm chuẩn 50 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocryptine mức thêm chuẩn 100 µg/kg PL-19 Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocornine mức thêm chuẩn 10 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocornine mức thêm chuẩn 50 µg/kg PL-20 Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocornine mức thêm chuẩn 100 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocristine mức thêm chuẩn 10 µg/kg PL-21 Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocristine mức thêm chuẩn 50 µg/kg Sắc ký đồ xác định độ lặp lại Ergocristine mức thêm chuẩn 100 µg/kg PL-22 Sắc đồ thêm chuẩn mức LOQ (1 µg/kg) Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức LOQ (1 µg/kg) Ergosine Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức LOQ (1 µg/kg) Ergocrytine PL-23 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức LOQ (1 µg/kg) Ergocornine Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn mức LOQ (1 µg/kg) Ergocristine PL-24 ... quy định kiểm soát độc tố nhóm EA thực phẩm Đề tài ? ?Xác định đồng thời số độc tố nhóm Ergot alkaloids ngũ cốc phƣơng pháp LC- MS/ MS” đƣợc thực với mục tiêu nhƣ sau: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp. .. định phƣơng pháp xác định đồng thời số độc tố ergot alkaloids thực phẩm sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng phƣơng pháp phƣơng pháp để phát định lƣợng độc tố nhóm ergot alkaloids ngũ cốc CHƢƠNG I TỔNG... quy định giới hạn cho ergot alcaloids cấp thiết 1.2 Phƣơng pháp xác định độc tố ergot alkaloids Hiện nay, giới có nhiều phƣơng pháp để xác định EA ngũ cốc sản phẩm từ ngũ cốc nhƣ phƣơng pháp định