Nội dung chính gồm: Chương 1. Sản xuất, xác nhận và độ bền vững của cây trồng chuyển gen 1 1.1. Các phương pháp chuyển gen 1 1.1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2 1.1.2. Chuyển gen bằng phương pháp phi sinh học 10 1.1.3. Chuyển gen bằng tế bào trần 14 1.2. Hệ thống chọn lọc và chỉ thị 15 1.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh 18 1.4. Xác nhận sự thay đổi gen 19 1.5. Biểu hiện của DNA ngoại lai 23 1.5.1. Biểu hiện gen ngoại lai ở nhiều vị trí 24 1.5.2. Biểu hiện gen ở tế bào hoặc mô đặc hiệu 24 1.5.3 Biểu hiện antisense 25 1.5.4. Sự bền vững của cây chuyển gen 27 1.5.5. Sự bất hoạt do methyl hoá 28 1.5.6. Đồng ức chế 28 Chương 2. Những đặc tính mới của cây chuyển gen 30 2.1. Tăng tính kháng và thích nghi với môi trường 32 2.1.1. Kháng thuốc diệt cỏ 32 2.1.2. Kháng côn trùng gây hại 37 2.1.3. Kháng virus gây bệnh 40 2.1.4. Kháng vi khuẩn và nấm 43 2.1.5. Kháng các điều kiện ngoại cảnh bất lợi 45 2.2. Nâng cao chất lượng sản phẩm 47 2.2.1. Carbohydrate và acid béo 47 2.2.2. Hàm lượng protein và amino acid không thay thế 50 2.2.3. Vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng 51 2.2.4. Tăng khả năng bảo quản và hương vị 54 2.2..5. Giảm các chất gây dị ứng 552.2.6. Vaccine thực phẩm 55 2.3. Những ứng dụng mới của cây trồngnguồn nguyên liệu và cải tạo đất 56 2.3.1. Carbohydrate và acid béo là nguồn nguyên liệu 57 2.3.2. Chất tổng hợp 57 2.3.3. Protein thực vật 58 2.3.4. Cải tạo đất 58 2.4. Cây dược liệu 59 2.4.1. Alkaloid 59 2.4.2. Chất miễn dịch 61 2.5. Thực vật biến đổi gen 62 2.5.1. Thay đổi màu hoa 62 2.5.2. Thay đổi hình dạng hoa 66 2.6. Bất dục đực nhân tạo để sản xuất hạt lai 68 Chương 3. Công nghệ chuyển gen ở động vật 71 3.1. Công nghệ gen trong tạo giống động vật mới 71 3.1.1. Tạo giống vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao 74 3.1.2. Tạo giống vật nuôi chuyên sản xuất protein quí dùng trong y dược 75 3.1.3. Tạo giống vật nuôi kháng bệnh và sự thay đổi của điều kiện môi trường 79 3.1.4. Tạo giống vật nuôi có năng suất và chất lượng cao bằng cách thay đổi các con đường chuyển hóa trong cơ thể động vật 80 3.2. Công nghệ sinh sản 81 3.2.1. Siêu bài noãn 81 3.2.2. Thụ tinh nhân tạo 81 3.2.3. Cấy chuyển phôi và các công nghệ liên quan 85 3.2.4. Tạo dòng vô tính động vật 89 3.3. Sản xuất vaccine thú y 94 3.4. Sản xuất kháng thể đơn dòng 9 3.5. Sản xuất protein đơn bào 983.6. Sản xuất hormone sinh trưởng 100 Chương 4. Những lợi ích và thách thức của cây trồng chuyển gen 102 4.1. Sử dụng cây trồng chuyển gen 104 4.2. Các nghiên cứu về sự an toàn của cây chuyển gen 109 4.2.1. Xác nhận sự chuyển gen bằng hạt phấn 109 4.2.2. Nghiên cứu sự bền vững của DNA trong đất 115 4.2.3. Nghiên cứu sự chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật 116 4.2.4. Phân tích sự tiếp nhận gen chuyển trong thực phẩm 120 4.3. Nguy cơ đối với môi trường và hệ sinh thái 124 4.3.1. Thực trạng môi trường hiện nay ra sao 125 4.3.2. Những lợi ch của cây chuyển gen 125 4.3.3. Đánh giá cây chuyển gen đối với an toàn môi trường 126 4.3.4. Những rủi ro có thể của cây chuyển gen 126 4.3.5. Ảnh hưởng của cây chuyển gen trực tiếp lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt 127 4.4. Nguy cơ đối với con người 128 4.4.1. Quản lý chặt sản phẩm biến đổi gen 128 4.4.2. Nguy hiểm cho sức khỏe con người 128
TRẦN THỊ LỆ (chủ biên) NGUYỄN HOÀNG LỘC-TRẦN QUỐC DUNG GIÁO TRÌNH CƠNG NGHỆ GEN TRONG NƠNG NGHIỆP HUẾ 2006 Lời nói đầu Giáo trình biên soạn nhằm cung cấp cho sinh viên kiến thức ứng dụng công nghệ gen lĩnh vực nông nghiệp Do sách xuất lần đầu công nghệ sinh học ngành khoa học phát triển nhanh chóng đặc biệt thời gian gần nên khó tránh khỏi thiếu sót Tuy vậy, mạnh dạn xuất với mong muốn phục vụ cho nhu cầu học tập sinh viên ngành nông nghiệp Chúng mong đồng nghiệp sinh viên đóng góp nhiều ý kiến lần biên soạn sau đạt chất lượng tốt Những nhận xét ý kiến đóng góp xin vui lịng gửi Khoa Nơng học, Trường đại học Nơng Lâm, Đại học Huế Chúng trân trọng cảm ơn TS Lê Việt Dũng đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho giáo trình Xin chân thành cám ơn Dự án Giáo dục Đại học Huế giúp đỡ tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành giáo trình Các tác giả Chương Sản xuất, xác nhận độ bền vững trồng chuyển gen 1.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật Cho đến 150 loài thực vật khác nhau, có nhiều lồi trồng, chuyển gen thành công Những thực vật chuyển gen diễn biến bật công nghệ gen thực vật giới thiệu bảng 1.1 Để tạo biến đổi gen năm qua loạt phương pháp khác thực Trong đó, ba phương pháp sau sử dụng phổ biến (giới thiệu mục từ 1.1.1 đến 1.1.3) Bảng 1.1 Diễn biến bật công nghệ gen thực vật Năm Những phát triển quan trọng 1980 - Lần chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 1983 - Marker chọn lọc, Ti-plasmid loại bỏ gen không cần thiết 1984 - Biến nạp vào tế bào trần 1985 - Kháng thuốc diệt cỏ 198 - Kháng virus - Lần đưa biến đổi gen đồng ruộng 1987 - Kháng côn trùng - Biến nạp phi sinh học 1988 - Điều khiển chín cà chua 1989 - Kháng thể thực vật bậc cao 1990 - Biến nạp phi sinh học ngơ - Tính bất dục đực nhân tạo 1991 - Thay đổi thành phần carbohydrate - Tạo alkaloid tốt Công nghệ gen nông nghiệp 1992 - Thay đổi acid béo - Biến nạp phi sinh học lúa mỳ - Lần phân giải plastic nhờ biến đổi gen - Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất thị trường 1994 - Lần 10 gen chuyển đồng thời vào thực vật 1998 - Trên giới có 48, Mỹ có 35, loại thực vật biến đổi gen thị trường hóa - Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt - Cây biến đổi gen trồng diện tích 40 triệu 1999 - Cho đến khoảng 9.000 thí nghiệm biến đổi gen đưa đồng ruộng (ở EU: 1.360) Phương pháp chuyển gen chọn lựa tùy thuộc loại vector biến nạp sử dụng Các vector plasmid thiết kế thích hợp 1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục đích cơng nghệ gen thực vật tạo biến đổi gen có đặc tính Ở đây, DNA ngoại lai đưa vào tế bào thực vật tồn bền vững hệ gen (genome) Các vi khuẩn đất A tumefaciens số lồi họ hàng chúng có khả chuyển phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật qua kích thích tạo khối u (callus) Những khối u không gian sống vi khuẩn Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn tạo khối u Những opine phổ biến nopalin octopin Về hóa học opine sản phẩm ngưng tụ amino acid với cetoacid amino acid với đường Octopin tạo nên từ amino acid arginine pyruvate, nopalin tạo nên từ arginine -cetoglutaraldehyd Công thức cấu tạo opine trình bày hình 1.1 A tumefaciens thực “kỹ thuật gen” với mục đích tạo biến đổi gen có lợi cho Như vậy, việc khẳng định kỹ thuật gen trình nhân tạo khơng hồn tồn Khả chuyển DNA A tumefaciens ứng dụng công nghệ gen đại Để hiểu Công nghệ gen nông nghiệp trình này, điều cần làm rõ tương tác sinh học Agrobacterium với thực vật COOH HC NH CH2 H2N COOH CH COOH HC CH3 NH COOH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH NH NH C C NH H2N NH Octopin Nopalin Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo opine Việc sử dụng A tumefaciens 1970, người ta phát vi khuẩn có khả tạo nên khối u hai mầm bị thương, gọi khối u cổ rễ (Hình 1.2) Trong năm 1970, nhà khoa học tìm thấy chủng A tumefaciens tạo khối u có plasmid lớn kích thước khoảng 200-800 kb Từ thí nghiệm chủng A tumefaciens khơng độc (khơng có plasmid này), người ta khẳng định plasmid nói cần thiết cho việc tạo khối u Vì vậy, chúng gọi Tiplasmid (tumor inducing-plasmid) Công nghệ gen nơng nghiệp Hình 1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a: Dưới kính hiển vi điện tử b: Khối u từ khối u xuất chồi cách tự nhiên Ti-plasmid mang gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết tế bào thực vật bị thương, cắt vận chuyển đoạn T-DNA (transfer-DNA) T-DNA phần Ti-plasmid, chuyển vào thực vật Trên định vị gen tạo khối u tổng hợp opine T-DNA giới hạn hai vùng, bờ trái bờ phải (LB: left border RB: right border) Các bờ gồm trình tự lặp lại 25 bp, trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA đưa vào DNA nhân tế bào thực vật Vị trí gắn vào thường ngẫu nhiên, nhiên thường vùng có khả chép Q trình lây nhiễm mơ tả hình 1.3 Bị thương Nhiễm sắc thể vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Vi khuẩn bám vào tế bào thực vật chuyển T-DNA vào nhân Agrobacterium khối u Khối u Công T-DNA vi khuẩn DNA nhân tế gen bào thực nghệ trongvật nông nghiệp Các tế bào khối u thực vật Hình 1.3 Sơ đồ lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trong opine người ta phân biệt hai loại octopin nopalin Một số chủng vi khuẩn A tumefaciens chứa Ti-plasmid loại octopin số khác nopalin Những plasmid octopin tạo octopin phân giải chúng, khơng tạo phân giải nopalin Có khác loại plasmid Agrobacterium, Tiplasmid loại nopalin chứa (copy) T-DNA, plasmid octopin chứa đến ba Ở hình 1.4, đoạn T-DNA định vị gen tổng hợp opine tạo khối u Khối u tạo nên hai loại phytohormone (auxin cytokinin) tạo tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích phân chia tế bào tạo nên mơ khơng phân hóa (callus) tms tmr nos T-DNA RB noc vir tra ori Hình 1.4.Ti-plasmid Agrobacterium dạng nopalin T-DNA: TransferDNA, LB: Bờ trái RB: Bờ phải, ori: khởi đầu chép A.tumefaciens noc: Phân giải nopalin, nos: Tổng hợp nopalin tmr: Tổng hợp cytokinin, Công nghệ gen nông nghiệp tms: Tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: Vùng virulence (vùng độc tính) Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết tế bào bị thương Khi tế bào bị thương chúng tiết hợp chất phenol (acetosyringone), chất có vai trị quan trọng việc nhận biết gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật Cơ chế nhận biết giải thích nhờ tính đặc hiệu A tumefaciens với hai mầm, mầm phản ứng có lồi Vì vậy, Agrobacterium sử dụng hạn chế cho việc biến nạp gen mầm Khi bổ sung syringone người ta biến nạp gen vào nấm nhờ A tumefaciens Thực vật mầm quan trọng ngơ biến nạp A tumefaciens Khối u xuất gen A tumefaciens Sự phát triển khối u sau nhiễm A tumefaciens dựa tác dụng hai phytohormone Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone mã hóa chủ yếu từ gen T-DNA Sự tổng hợp auxin thực hai gen tms1 tms2 Gen tms1 mã hóa tryptophan-2monooxygenase xúc tác cho biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamide Sản phẩm gen tms2 indol-3-acetamide-hydrogenase, xúc tác để tạo auxin indolylacetic acid (IAA) Ngoài ra, T-DNA cịn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase Enzyme gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin isopentenyladenin isopentenyladenosin Hydroxyl hóa tiền cytokinin enzyme thực vật để tạo nên cytokinin Auxin tạo nên với cytokinin làm cho khối u lớn lên, nhờ kích thích phân chia tế bào khơng phân hóa H - CH2-COO CH2OH C=C N H N N N Công nghệ gen nơng nghiệp CH3 HN-CH2 N H Hình 1.5 Cấu tạo indol-3-acetate (một loại auxin) zeatin (một loại cytokinin) A tumefaciens nhận biết acetosyringone nhờ chất nhận, mã hóa gen vùng vir (virulence), vùng vir bao gồm nhiều gen Sự nhận biết chất nhận dẫn đến hoạt hóa tất gen vir Một sản phẩm gen vir khác endonuclease nhận biết bờ phải trái TDNA cắt T-DNA vị trí Sau đó, protein gắn vào sợi đơn T-DNA phức hệ chuyển vào thực vật nhờ tác dụng sản phẩm gen vir (Hình 1.6) LB RB T-DNA LB RB LB RB virE2 virD2 virD2 LB RB Phức hệ T-DNA-Protein Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn trình di chuyển T-DNA Ti-plasmid 1: T-DNA với bờ phải bờ trái chèn vào Ti-plasmid 2: Sợi đơn cắt nhờ protein mã hóa gen virD2 3: Sợi đơn T-DNA Cơng nghệ gen nơng nghiệp giải phóng kết hợp với protein virD2 virE2 mã hóa, chỗ đứt sợi đơn thứ hai tổng hợp bổ sung 4: Lấp đầy chỗ trống Ti-plasmid (đường gạch nối đậm) Sợi T-DNA tự vận chuyển vào tế bào thực vật dạng phức hệ DNA-protein Q trình phức tạp nên khơng thích hợp cho việc ứng dụng cơng nghệ gen có ba nguyên nhân sau: - Do tạo khối u nên tái sinh hoàn chỉnh khỏe mạnh từ tế bào biến nạp gen - Sự tổng hợp opine khơng mong muốn tiêu tốn lượng không cần thiết - DNA lạ (ngoại lai) đưa vào Ti-plasmid T-DNA Những plasmid có kích thước > 200 kb q lớn, khó thao tác phịng thí nghiệm Người ta thành cơng việc sửa đổi Ti-plasmid T-DNA để phytohormone không tạo nên Trong bước gen tổng hợp opine cắt đưa vào gen thị (xem mục 1.2), ví dụ: gen kháng kanamycin Ngày nay, người ta sử dụng hệ thống gọi vector hai nguồn (binary vector), chức Ti-plasmid thực hai plasmid Plasmid lớn mang vùng vir plasmid nhỏ mang bờ trái phải T-DNA Đây vùng T-DNA cần thiết cho việc vận chuyển gen vào thực vật, plasmid nhỏ đủ cho vận chuyển xác chí với bờ Giữa bờ phải trái gen chọn lọc gen lạ chèn vào Sơ đồ cấu tạo vector hai nguồn giới thiệu hình 1.7 Ưu điểm vector thao tác thực với plasmid nhỏ Tất công việc tạo dịng, việc đưa DNA lạ, thực tế bào E coli, plasmid lớn hồn thiện chuyển vào A tumefaciens Q trình biến nạp thực mô thực vật phù hợp, ví dụ: mơ Chúng ủ với vi khuẩn A tumefaciens, sau vi khuẩn loại bỏ mơ tái sinh thành hồn chỉnh Cây Arabidopsis thaliana trở thành mơ hình quan trọng nghiên cứu di truyền thực vật Phương pháp biến nạp mô tả phương Công nghệ gen nơng nghiệp Lai giống truyền thống địi hỏi trao đổi hàng ngàn gen hai để có tính trạng mong muốn Trong đó, nhờ cơng nghệ sinh học đại, lựa chọn đặc tính mong muốn chuyển riêng vào hạt giống Sự khác biệt hai kỹ thuật lớn Phương pháp công nghệ sinh học hợp lý hơn, có hiệu cao đem lại kết tốt Các kỹ thuật sử dụng công nghệ sinh học đại cung cấp cho nhà lai tạo giống cơng cụ xác cho phép họ chuyển đặc tính mong muốn vào trồng Hơn nữa, họ làm điều mà khơng bị chuyển thêm tính trạng khơng mong muốn vào thường xảy sử dụng lai giống truyền thống Công nghệ sinh học thực vật tạo điều kiện cho nhà khoa học kiểm sốt gen chuyển, nhờ nghiên cứu chi tiết tính trạng đưa vào Thực phẩm có nguồn gốc từ trồng chuyển gen phải trải qua nhiều thử nghiệm loại thực phẩm lịch sử Trước đưa thị trường, chúng phải đánh giá cho phù hợp với quy định vài tổ chức khoa học quốc tế đưa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương (FAO), Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD)… Những quy định sau: - Các sản phẩm chuyển gen cần đánh giá giống loại thực phẩm khác Các nguy gây thực phẩm có nguồn gốc từ cơng nghệ sinh học có chất giống loại thực phẩm thông thường - Các sản phẩm xem xét dựa độ an toàn, khả gây dị ứng, độc tính dinh dưỡng chúng dựa vào phương pháp kỹ thuật sản xuất - Bất kỳ chất đưa thêm vào thực phẩm thông qua công nghệ sinh học phải cho phép trước đưa thị trường việc loại chất phụ gia chất bảo quản hay màu thực phẩm cần phải cho phép trước thương mại hóa Một số nhận định vấn đề an toàn thực phẩm, sau: - Mức độ ăn tồn thực phẩm chuyển gen tương đương với thực phẩm khác q trình đánh giá an tồn thực phẩm chuyển gen kỹ lưỡng nhiều so với việc đánh giá thực phẩm khác Quá trình đánh giá an toàn thực phẩm đảm bảo thực phẩm chuyển gen mang lại tất lợi ích thực phẩm thơng thường khơng có thêm tác hại Công nghệ gen nông nghiệp 121 - Chưa có chứng cho thấy thực phẩm chuyển gen có thị trường gây lo ngại sức khoẻ người hay có khía cạnh an tồn so với trồng tạo nhờ lai giống truyền thống - Một điểm đặc trưng kỹ thuật chuyển gen đưa vào hay nhiều gen xác định rõ Điều giúp cho việc thử nghiệm độc tính trồng chuyển gen dễ thực so với trồng bình thường + Các chất gây dị ứng Một mối quan tâm lớn thực phẩm chuyển gen chất gây dị ứng (một protein gây phản ứng dị ứng) chuyển vào thực phẩm May mắn nhà khoa học biết nhiều thực phẩm gây dị ứng trẻ nhỏ người trưởng thành Khoảng 90% dị ứng thức ăn có liên quan tới tám thực phẩm nhóm thực phẩm-động vật có vỏ (tơm, cua, sị, hến), trứng, cá, sữa, lạc, đậu tương, hạch lúa mỳ Những loại thực phẩm nhiều chất gây dị ứng khác xác định rõ khó tin chúng đưa vào thực phẩm chuyển gen Tuy vậy, việc kiểm tra tính dị ứng khâu quan trọng việc kiểm tra an toàn trước giống trồng đưa làm thực phẩm Hàng loạt thử nghiệm câu hỏi phải xem xét kỹ để định liệu thực phẩm có làm tăng dị ứng hay không Các chất gây dị ứng có đặc tính chung như: chúng khơng bị phân hủy q trình tiêu hóa, chúng có xu hướng khơng bị phân hủy q trình chế biến thực phẩm, chúng thường có nhiều thực phẩm Khơng có protein chuyển vào thực phẩm chuyển gen thương mại hóa lại mang đặc tính Chúng phải khơng có tiền sử khả gây dị ứng hay độc tính, chúng không giống với chất gây dị ứng hay độc tố biết chức chúng biết rõ Chúng có hàm lượng thấp thực phẩm chuyển gen, nhanh chóng bị phân hủy dày kiểm tra lại xem có an tồn khơng nghiên cứu thực phẩm cho động vật Các gen mã hóa thơng tin di truyền có mặt tất loại thực phẩm việc ăn chúng không gây ảnh hưởng xấu Khơng có Cơng nghệ gen nông nghiệp 122 tác hại di truyền xảy tiêu hóa DNA Trên thực tế, ln nhận DNA ăn có mặt tất thực vật động vật + Đánh giá độ an toàn thực phẩm Bất kỳ sản phẩm chuyển gen trước đưa thị trường phải thử nghiệm toàn diện, nhà khoa học giám định viên đánh giá độc lập xem có an tồn hay khơng dinh dưỡng, độc tính, khả gây dị ứng khía cạnh khoa học thực phẩm dựa quy định tổ chức có thẩm quyền nước Chúng bao gồm: hướng dẫn sản phẩm, thông tin chi tiết mục đích sử dụng sản phẩm, thơng tin phân tử, hóa sinh, độc tính, dinh dưỡng khả gây dị ứng Các câu hỏi điển hình đặt là: (1) Các thực phẩm chuyển gen có tạo từ thực phẩm truyền thống cơng nhận an tồn hay khơng (2) Nồng độ độc tố hay chất gây dị ứng thực phẩm có thay đổi hay khơng (3) Hàm lượng chất dinh dưỡng có thay đổi hay khơng (4) Các chất thực phẩm chuyển gen có đảm bảo tính an tồn hay khơng (5) Khả tiêu hóa thức ăn có bị thay đổi hay khơng (6) Các thực phẩm có tạo nhờ quy trình chấp nhận hay khơng Ngay câu hỏi câu hỏi khác thực phẩm chuyển gen trả lời, nhiều việc phải làm trình phê chuẩn trước thực phẩm chuyển gen thương mại hóa Thực tế, thực phẩm chuyển gen loại sản phẩm nghiên cứu nhiều loại sản xuất + Gen kháng kháng sinh Một vài giống trồng chuyển gen có chứa gen quy định tính trạng kháng kháng sinh Các nhà khoa học sử dụng tính trạng thị (marker) để nhận biết tế bào chuyển gen vào Ngày có nhiều lo lắng gen thị phát tán từ trồng chuyển gen sang vi sinh vật cư trú ruột người chúng làm tăng khả đề kháng kháng sinh Đã có nhiều nghiên cứu thử nghiệm khoa học vấn đề để tới kết luận sau: Công nghệ gen nông nghiệp 123 Khả gen kháng kháng sinh phát tán từ vây trồng chuyển gen sang sinh vật khác vô thấp; chí kiện xảy gen kháng sinh phát tán sang sinh vật khác tác động việc không đáng kể thị sử dụng trồng chuyển gen có ứng dụng thú y y học hạn chế Tuy nhiên, để làm dịu lo lắng xã hội, nhà nghiên cứu yêu cầu tránh sử dụng gen kháng kháng sinh trồng chuyển gen Việc sử dụng thị thay khác đánh giá phát triển 4.3 Nguy môi trường hệ sinh thái Mặc dù “thế hệ thứ nhất” giống trồng công nghệ sinh học tập trung vào việc đem lại lợi ích kinh tế đáng kể cho người nông dân, song ngày có nhiều chứng cho thấy cơng nghệ sinh học cịn mang lại lợi ích lớn an tồn lương thực mơi trường Những kết sử dụng công nghệ sinh học Mỹ cho thấy, việc sử dụng thuốc trừ sâu giảm đáng kể, môi trường bảo đảm sản lượng tăng tiết kiệm chi phí sản xuất Mặc dù kết sử dụng công nghệ sinh học vùng có khác lợi ích kinh tế mang lại rõ ràng, khơng người sử dụng mà mơi trường người tiêu dùng Các lợi ích giống lai cơng nghệ sinh học phụ thuộc hóa chất đầu vào, nguy gây ô nhiễm nguồn nước thấp hơn; việc hạn chế sử dụng hóa chất tăng độ an tồn nước, đảm bảo môi trường tốt cho sinh vật tự nhiên; vụ mùa ứng dụng công nghệ sinh học cho suất cao Tuy nhiên, tranh luận xung quanh ảnh hưởng chuyển gen môi trường ngày phức tạp Vấn đề phức tạp có nghiên cứu cơng bố Như chuyển gen có an tồn với mơi trường hay khơng Việc đánh giá ảnh hưởng chuyển gen tới môi trường thường khó khăn phải xem xét nhiều yếu tố Một số nhà khoa học tập trung vào nguy tiềm tàng chuyển gen số khác lại nhấn mạnh triển vọng lợi nhuận Công nghệ gen nông nghiệp 124 4.3.1 Thực trạng môi trường Dân số gia tăng, trái đất ngày nóng lên đa dạng sinh học (biodiversity) dần ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Sự phá hủy rừng môi trường tự nhiên, sử dụng ngày nhiều than đá dẫn tới gia tăng khơng ngừng lượng khí CO làm trái đất nóng lên Người ta dự đốn nhiệt độ trung bình trái đất tăng từ 2-3oC tính đến năm 2100, đồng thời với biến động thời tiết Sự thay đổi khí hậu làm thay đổi chế độ mưa, gây nên di cư người biến đổi hoạt động nơng nghiệp Thêm vào dân số gia tăng (theo dự đoán đến năm 2020, dân số giới lên tới tỷ người) dẫn đến phá hủy tự nhiên, giảm chất lượng nước thay đổi dòng chảy Sinh cảnh (biotope) bị làm cho nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Bởi vậy, để bảo tồn rừng, sinh cảnh đa dạng sinh học, cần phải đảm bảo nhu cầu lương thực tương lai dựa quỹ đất có 4.3.2 Những lợi ích chuyển gen Cây chuyển gen có lợi ích tiềm tàng môi trường Chúng giúp bảo tồn nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh động-thực vật địa Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mịn đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng nơi cư ngụ động vật hoang dại Thực vật với khả tự bảo vệ chống lại côn trùng cỏ dại giúp giảm liều lượng nồng độ thuốc trừ sâu sử dụng Ví dụ: Trung Quốc, Bt giúp giảm lượng thuốc diệt trùng xuống cịn 40 kg/ha Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước vùng sử dụng thuốc Ví dụ: nước chảy qua cánh đồng bơng Bt Mỹ hồn tồn khơng cịn nhiễm thuốc trừ sâu suốt năm nghiên cứu Bộ Nông nghiệp Mỹ Thực vật kháng thuốc diệt cỏ giúp cho việc sử dụng biện pháp không cày đất (yếu tố quan trọng việc bảo tồn đất đai) trở nên phổ biến Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen Canada phải cày cấy so với trồng cải dầu truyền thống Công nghệ gen nông nghiệp 125 Cây chuyển gen tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, với diện tích đất canh tác thu nhiều lương thực Ví dụ: Ở Mỹ, vào năm 1999 có 66 triệu ruộng ngô tránh sâu đục thân 4.3.3 Đánh giá chuyển gen an tồn mơi trường Các chuyển gen đánh giá cẩn thận ảnh hưởng tới môi trường trước đưa thị trường tuân theo quy tắc tổ chức chuyên gia môi trường khắp giới xây dựng Chẳng hạn, Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm (1989), Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm (1992), phủ Canada năm (1994) Những người đánh giá ảnh hưởng chuyển gen bao gồm người tạo chúng, quan kiểm soát nhà khoa học khác Hầu hết quốc gia sử dụng quy trình đánh giá tương tự để xem xét tương tác chuyển gen môi trường Bao gồm thông tin vai trò gen đưa vào, ảnh hưởng nhận gen, đồng thời câu hỏi cụ thể ảnh hưởng không mong muốn như: - Ảnh hưởng lên sinh vật sinh vật cần diệt môi trường - Cây chuyển gen có tồn mơi trường lâu bình thường xâm chiếm nơi cư ngụ không - Khả gen phát tán ý muốn từ chuyển gen sang loài khác hậu xảy 4.3.4 Những rủi ro chuyển gen Khả xảy lai chéo xa gen chuyển vào trồng với cỏ họ hàng, khả tạo loại cỏ Lai chéo xa lai không mong muốn trồng với có quan hệ họ hàng Lo ngại ảnh hưởng chuyển gen môi trường khả tạo lồi cỏ thơng qua lai chéo xa với họ hàng hoang dại đơn giản tồn lâu tự nhiên Khả xảy ra, đánh giá trước trình chuyển gen kiểm soát sau đưa trồng Một nghiên cứu năm 1990 kéo dài 10 năm chứng minh thực vật chuyển gen (như cải dầu, Công nghệ gen nông nghiệp 126 khoai tây, ngô, củ cải đường ) không làm tăng nguy xâm chiếm hay tồn lâu dài môi trường tự nhiên so với không chuyển gen tương ứng Các tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng điều tra đồng thời với không chuyển gen tương ứng (Crawley cs 2001) Tuy nhiên, nhà nghiên cứu cho kết khơng có nghĩa thay đổi di truyền khơng thể làm gia tăng tính hoang dại hay khả phát tán trồng mà chúng trồng suất cao khó tồn lâu dài khơng canh tác Do đó, việc đánh giá chuyển gen theo trường hợp quy định quan trọng 4.3.5 Ảnh hưởng chuyển gen trực tiếp lên sinh vật sinh vật cần diệt Tháng năm 1999, xuất báo cáo hạt phấn từ ngơ Bt có ảnh hưởng bất lợi ấu trùng bướm Monarch Báo cáo gây lo lắng nguy tiềm tàng bướm Monarch sinh vật sinh vật cần diệt khác Một số nhà khoa học lại cho cần phải thận trọng việc giải thích kết nghiên cứu nghiên cứu phản ánh tình khác với thực trạng môi trường Báo cáo cho thấy nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm khởi đầu vấn đề quan trọng, nhiên dựa vào khơng đủ sở để rút kết luận nguy quần thể bướm Monarch cánh đồng Một báo cáo khác Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ số liệu nghiên cứu chứng minh protein trồng khơng có ảnh hưởng bất lợi sinh vật sinh vật cần diệt Thêm vào đó, nghiên cứu trường Đại học Illinois (Mỹ) cho thấy bướm Monarch không bị gây hại hạt phấn Bt điều kiện đồng ruộng thực Nhìn chung, mối quan tâm tới sinh thái môi trường xuất phát từ chuyển gen đánh giá trước thương mại hóa chúng Đồng thời cần có kiểm sốt hệ thống nông nghiệp tốt để phát giảm thiểu mối nguy hại xảy Chúng ta cần so sánh phương pháp chuyển gen đại truyền thống để làm sáng tỏ Công nghệ gen nông nghiệp 127 mối rủi ro tương đối lợi ích việc áp dụng chuyển gen 4.4 Nguy có người 4.4.1 Quản lý chặt sản phẩm biến đổi gen Mọi hoạt động có liên quan đến loại sản phẩm xuất nhập khẩu, vận chuyển sử dụng, nghiên cứu khoa học, khảo nghiệm chuyển giao kết nghiên cứu phải nằm quản lý quyền để quản lý an tồn sinh vật biến đổi gen sản phẩm chúng, đảm bảo tuân thủ nghiêm ngặt biện pháp quản lý rủi ro Các tổ chức cá nhân thực hoạt động vi phạm quy chế, gây thiệt hại cho sản xuất, cho môi trường sức khỏe người phải bồi thường thiệt hại chi phí khắc phục hậu Trường hợp nghiêm trọng bị truy cứu trước pháp luật Các chuyên gia cho rằng, bên cạnh ưu điểm suất, chất lượng, khả chống chịu sâu bệnh thời tiết khắc nghiệt, sinh vật chuyển gen mối nguy gây an toàn sinh học Một số gen gen kháng thuốc hay gen mang chế "kết thúc" (terminator) nảy mầm khuếch tán vào mơi trường dẫn tới tình trạng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh khả nảy mầm nhiều loại trồng Bên cạnh đó, sản phẩm biến đổi gen gây dị ứng cho người tiêu dùng 4.4.2 Nguy hiểm cho sức khoẻ người Khơng có vấn đề quan trọng bật sức khỏe người liên quan đến trồng thực phẩm biến đổi di truyền (được tiêu thụ nhiều Mỹ) Tuy nhiên, thực phẩm biến đổi gen không đánh dấu, người dân chịu hậu xấu liên quan đến việc họ tiêu dùng loại thực phẩm Điều quan trọng cần nhớ 3-4 năm vừa qua, đậu tương ngô kháng côn trùng thuốc diệt cỏ trồng hàng triệu acre2 Mỹ sử dụng tiếp chế biến thực phẩm acre tương đương 0,4 hectare (ha) Công nghệ gen nông nghiệp 128 Ngăn cấm ngăn cấm phần nhập sản phẩm CNSH canh tác thương mại Yêu cầu dán nhãn sản phẩm CNSH Các nước thành viên European Union (EU): Austria, Belgium, Cyprus, Czech Rep., Denmark, Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Ireland, Italy, Latvia, Lithuania, Luxemboug, Malta, Netherlands, Poland, Portugal, Slovakia, Slovenia, Spain, Sweden, UK Hình 4.6 Bản đồ nước ngăn cấm yêu cầu dán nhãn thực phẩm công nghệ sinh học (CNSH) Liên minh châu Âu (European Union, EU) cam kết theo tiêu chuẩn quy định cho dán nhãn thực phẩm công nghệ sinh học, gần số nước thành viên thực Hơn thập kỷ qua, chuyên gia an toàn thực phẩm xác nhận số vấn đề tiềm tàng tăng lên kết trồng thực phẩm chuyển gen, bao gồm khả đưa độc tố chất gây dị ứng vào thực phẩm an toàn trước đây, làm tăng độc tính với mức độ nguy hiểm thực phẩm, mà trước sản xuất số chất không độc, làm giảm bớt giá trị dinh dưỡng thực phẩm Trong số tác động tiềm tàng này, nhà khoa học giám định viên lo lắng chất gây dị ứng mới, thực vậy, hai kiện thập kỷ vừa qua phù hợp với điều đó: - Đầu tiên, một báo cơng bố tờ New England Journal of Medicine (NEJM) vào năm 1996 xác nhận dự báo công nghệ di truyền chuyển chất gây dị ứng từ thực phẩm gây dị ứng biết vào thực phẩm khác (Nordlee cs 1996) Một vài năm trước đó, nhà khoa học Pioneer Hi-Bred Seed Company chuyển thành công gen từ dẻ Brazil (Brazil nut) vào đậu nành để cải thiện chất lượng dinh dưỡng trồng hạt Các thí nghiệm cho thấy Công nghệ gen nông nghiệp 129 người dị ứng với hạt dẻ Brazil dị ứng tương tự với đậu nành chuyển gen - Thứ hai, năm cuối thập niên 1990, người ta thông báo dạng biến dị ngô Βt (StarLink) chứa tác nhân gây dị ứng tiềm tàng đưa vào thực phẩm cách bất hợp pháp làm lên sóng tranh luận điều đó, cuối giảm xuất ngô, gây hoang mang cho ngành công nghiệp thực phẩm, tạo nghi ngờ rộng lớn cấu tổ chức giám định Mỹ Cục Bảo vệ Môi trường (EPA) không chấp thuận sử dụng ngô StarLink làm thực phẩm cho người lo ngại độc tố Βt gây phản ứng dị ứng người tiêu dùng Năm 1998, quan đồng ý cho phép sử dụng StarLink dùng làm thức ăn gia súc Hai năm sau, liên minh nhóm có chung lợi ích cơng cộng kiểm tra sản phẩm quầy thực phẩm bán lẻ tìm thấy ngơ StarLink vỏ bánh thịt chiên dịn (taco shell) Sau đó, ngơ chuyển gen khơng chấp thuận lại tìm thấy nhiều sản phẩm khác Người ta bắt buộc phải thu hồi lại đóng cửa nhà máy, ngừng xuất khẩu, mua lại ngô bị nhiễm bẩn Sự cố StarLink minh họa rõ ràng yếu hệ thống giám định Mỹ khu vực hậu thương mại hóa, tiếp tục ám ảnh nơng dân Mỹ, nhà chế biến thực phẩm, công ty công nghệ sinh học Câu hỏi Những lợi ích trồng chuyển gen? Các nghiên cứu an toàn trồng chuyển gen? Thách thức trồng chuyển gen? Công nghệ gen nơng nghiệp 130 MỤC LỤC Lời nói đầu Chương Sản xuất, xác nhận độ bền vững trồng chuyển gen 1.1 Các phương pháp chuyển gen 1.1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.1.2 Chuyển gen phương pháp phi sinh học 1.1.3 Chuyển gen tế bào trần 1.2 Hệ thống chọn lọc thị 1.3 Tái sinh hoàn chỉnh 1.4 Xác nhận thay đổi gen 1.5 Biểu DNA ngoại lai 1.5.1 Biểu gen ngoại lai nhiều vị trí 1.5.2 Biểu gen tế bào mô đặc hiệu 1.5.3 Biểu antisense 1.5.4 Sự bền vững chuyển gen 1.5.5 Sự bất hoạt methyl hoá 1.5.6 Đồng ức chế 10 14 15 18 19 23 24 24 25 27 28 28 Chương Những đặc tính chuyển gen 2.1 Tăng tính kháng thích nghi với môi trường 2.1.1 Kháng thuốc diệt cỏ 2.1.2 Kháng côn trùng gây hại 2.1.3 Kháng virus gây bệnh 2.1.4 Kháng vi khuẩn nấm 2.1.5 Kháng điều kiện ngoại cảnh bất lợi 2.2 Nâng cao chất lượng sản phẩm 2.2.1 Carbohydrate acid béo 2.2.2 Hàm lượng protein amino acid khơng thay 2.2.3 Vitamin, chất khống nguyên tố vi lượng 2.2.4 Tăng khả bảo quản hương vị 2.2 Giảm chất gây dị ứng 30 32 32 37 40 43 45 47 47 50 51 54 55 2.2.6 Vaccine thực phẩm 2.3 Những ứng dụng trồng-nguồn nguyên liệu cải tạo đất 2.3.1 Carbohydrate acid béo nguồn nguyên liệu 2.3.2 Chất tổng hợp 2.3.3 Protein thực vật 2.3.4 Cải tạo đất 2.4 Cây dược liệu 2.4.1 Alkaloid 2.4.2 Chất miễn dịch 2.5 Thực vật biến đổi gen 2.5.1 Thay đổi màu hoa 2.5.2 Thay đổi hình dạng hoa 2.6 Bất dục đực nhân tạo để sản xuất hạt lai 55 56 Chương Công nghệ chuyển gen động vật 3.1 Công nghệ gen tạo giống động vật 3.1.1 Tạo giống vật ni có tốc độ lớn nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao 3.1.2 Tạo giống vật nuôi chuyên sản xuất protein q dùng y dược 3.1.3 Tạo giống vật ni kháng bệnh thay đổi điều kiện môi trường 3.1.4 Tạo giống vật ni có suất chất lượng cao cách thay đổi đường chuyển hóa thể động vật 3.2 Cơng nghệ sinh sản 3.2.1 Siêu noãn 3.2.2 Thụ tinh nhân tạo 3.2.3 Cấy chuyển phôi công nghệ liên quan 3.2.4 Tạo dịng vơ tính động vật 3.3 Sản xuất vaccine thú y 3.4 Sản xuất kháng thể đơn dòng 3.5 Sản xuất protein đơn bào 71 71 74 57 57 58 58 59 59 61 62 62 66 68 75 79 80 81 81 81 85 89 94 98 3.6 Sản xuất hormone sinh trưởng Chương Những lợi ích thách thức trồng chuyển gen 4.1 Sử dụng trồng chuyển gen 4.2 Các nghiên cứu an toàn chuyển gen 4.2.1 Xác nhận chuyển gen hạt phấn 4.2.2 Nghiên cứu bền vững DNA đất 4.2.3 Nghiên cứu chuyển gen từ thực vật vào vi sinh vật 4.2.4 Phân tích tiếp nhận gen chuyển thực phẩm 4.3 Nguy môi trường hệ sinh thái 4.3.1 Thực trạng môi trường 4.3.2 Những lợi ch chuyển gen 4.3.3 Đánh giá chuyển gen an tồn mơi trường 4.3.4 Những rủi ro chuyển gen 4.3.5 Ảnh hưởng chuyển gen trực tiếp lên sinh vật sinh vật cần diệt 4.4 Nguy người 4.4.1 Quản lý chặt sản phẩm biến đổi gen 4.4.2 Nguy hiểm cho sức khỏe người 100 102 104 109 109 115 116 120 124 125 125 126 126 127 128 128 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Quốc Dung 2001 Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) phương pháp vi tiêm Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Mộng Hùng 2004 Cộng nghệ tế bào phôi động vật NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Đặng Hữu Lanh, Trần Đình Miên Trần Đình Trọng 1999 Cơ sở di truyền chọn giống động vật NXB Giáo dục, Hà Nội Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford Univercity Press, Inc New York, USA Chopra VL and Nasim A 1990 Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing Co Pvt Ltd New Delhi Dingermann T 1999 Gentechnik Biotechnik Wissenschafltiche Verlagsgsselschaf mbH, Stuttgart, Deutsch Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles and applications of Recombinant DNA 3rd Edition ASM Press, USA Birch RG 1997 Plant tranformation: Problems and strategies for practical applications Annual Review of plant physiology plant Molecular Biology 48:297326 Chrispleels MJ and Sadava DE 2003 Plants, Genes, and Crop Biotechnology.2nd Edition Jones and Bartlett publishers, Massachusetts, USA Eastham K and Sweet J 2002 Gentietically Modified Organisms (GMOS): The Significance of Gene Flow through Pollen Trasfes European Enviroment Agency (EEA), Copenhagen, Denmark Kempenken F and Kempken R 2000 Gentecknik bei Pflanzen, Springer, Deutsch Houdebine LM 2003 Animal Trasgenenesis and Cloning John Willey and Sons, Ltd USA National Research Council 2002 Animal Biotechnology, Printed in the USA Nordlee J, Taylor S, Townsend J, Thomas L and Bush R 1996 Identification of a Brazil-nut allergen in transgenic soybean New Enland Journal of Medicine 334: 688-692 Ratledge C and Kristiansen B.2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Raven PH and Johnson GB 1996 Biology, 4th Edition Wm C Brown publishers, Dubuque, IA Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology.4th Edition The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK http://www.biotechvn.com http://binas.unido.org BINAS Online: The enviromental risks of transgenic crops: an agroecological assessment http://www.ucsusa.org Special Feature: Enviromental offects of genetically modified food crops http://www2.dupont.com Dupont Biotechnology: Horizontal gene transfer and transgenic crops http://www.fftc.agnet.org/library/article/tb15a.html Technical spects of the recovery, handling and transfer of embryos ... từ gen T-DNA Sự tổng hợp auxin thực hai gen tms1 tms2 Gen tms1 mã hóa tryptophan-2monooxygenase xúc tác cho biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamide Sản phẩm gen tms2 indol-3-acetamide-hydrogenase,... biệt tồn nhiều gen lạ gần (sự xếp nhiều phân tử vector hệ gen biến nạp gen nhiều gen biến nạp) tạo nên trình Người ta cho bất hoạt gen biến nạp lặp lại chế bảo vệ chống lại nhân tố gen di động transposone... ngoại lai thực vật chuyển gen? Công nghệ gen nông nghiệp 29 Chương Những đặc tính chuyển gen Trong thập kỷ qua, nhờ thành tựu to lớn công nghệ gen, người ta chuyển thành công gen phân lập từ sinh