Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn streptomyces natalensis VTCC a 3245 nhằm tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ó C G IA H À N Ộ I ùHOanH BÁO CÁO TỎNG KẾT K É T Q U Ả T H Ụ C H IỆ N Đ Ề T À I K H & C N CÁP ĐẬI h ọ c QUÓC g i a T ên đê tài: C ả i b iê n di tru y ề n c h ủ n g x k h u ấ n S tr e p to m y c e s n a ta le n sis V T C C -A -3 n h ăm tă n g k h ả n ă n g sin h c h ấ t k h n g sin h n a ta m y c in để ứ n g d ụ n g tro n g b ả o q u ả n th ự c p h ẩm Mă số đề tài: QG 14.62 C h ủ nhiệm đề tài: T S N g u y ễ n K im N ữ T h ả o ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĨRUNG TẦM THÔNG TIN THƯ VIỄN ũ ũ ũ ũ n a u M PHẢN I THÔiNG TIN CHUNG 1.1 lên đê tài: Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs VTCC-A-3245 nhằm tăng khả sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng bảo quản thực phẩm 1.2 Mã số: QG 14.62 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên Đon vị công tác Vai trò thực đề tài TS Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Quỳnh Uyển Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Thành viên ThS Nguyễn Thị Vân Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Thành viên ThS Phạm Thị Thu Hướng Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Thành viên 1.4 Đo'n vị chủ trì: Viện Vi sinh vật Cơng nehệ Sinh học 1.5 Thịi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 1.5.2 Gia hạn (nếu có): từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016 đến tháng năm 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016 1.6 N h ữ n g th a y đ ổ i so v ó i th u y ế t m inh ban đ ầu (nếu có): (Vệ mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiên Cơ quan quản lý) 1.7 Tơng kinh phí đưọc phê duyệt đề tài: 150 triệu đồng PHÀN II TỎNG QUAN KỂT QUẢ NGHIÊN c u Đặi vấn đề Striptomyces, chi lớn nhóm xạ khuẩn biết đến với khả tổng họp lượng lớn cá; chât trao đôi thứ câp bao gôm chât kháng vi sinh vật Trong số đó, natamycin, họp chât thuộc nhóm polyene thu hút nhiều quan tâm Natamycin sản xuất từ tình lên men sô chủng xạ khuân Streptomyces nơtalensis, Streptomyces chattcnoogensịs Strepiomyces gilvosporeus [8 ] Đặc điểm nồi bật natamycin chúng có khả tháng nâm mạnh, ức chê sinh trưởng nâm men, nấm mốc ngăn ngừa hình thành latoiin từ nâm sợi So với chât kháng nấm khác natamycin có độc tính thấp với tế bào động /ật có vú nên chúng ứng dụng nhiêu y học để điều trị hiệu bệnh nhiễm trùng ịiảc mạc Aspergillus Fusarỉum gây [6 ] Thêm vào đó, natamycin cịn sử dụns rộng ríi cơng nghiệp thực phâm đê kéo dài thòi gian bảo quản nhiều loại thực phẩm khác ihư mát, xúc xích, hoa uống Natamycin số chất kháng nâm clrợc khuyên cáo sử dụng thực phâm quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ (FDA Việt Nam, natamycin năm danh mục phụ gia thực phâm phép sử dụng sản Xiất, chế biến kinh doanh thực phẩm theo thông tư số 27/2012/TT-BYT Bộ Y Tế IV natamycin có vai trị phổ biến Việt Nam toàn lưọng natanvcin sử dụng đêu phải nhập Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học bảo quản chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 có khả ánh nataniycin Chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 chùng chuẩn Struyk cộng phân lập từ mẫu đất Nam Phi [11] lưu giữ bảo tàng giống Nhật Bản với ký hiệu JCM 4693 Tuy nhiên để tạo chủng sản xuất, nghiên cứu cải biến di truyén cần thực để tăng khả sinh natamycin Đối với chủng s natalensis, chưa có nghiên cứu Việt Nam thực cải biến di truyền cách tác động trực tiếp vào cụm gen sinh tông hợp natamycin Trong đó, giới, trình tự cụm gen mã hóa cho q trình sinh tơng họp natamycin cơng bơ; cụm gen có kích thước khoảng 85 kb bao gơm 13 gen mã hóa cho polyketide synthase, 12 gen mã hóa cho protein biến đổi sau dịch mã, protein vận chuyến protein điều hịa, có pim M [1,2] Gen pim M có kích thước 579 bp, tìm thây gen mã hóa cho protein điêu hịa dương q trình sinh tổng hợp natamycin [ 1] Khi xóa bỏ pimM, khả sinh natamycin biến Vì vậy, tác động vào gen pim M chìa khóa quan trọng có khả cho phép tạo chủng sản xuất sinh natamycin với hiệu suất cao Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M tách dòng chèn thêm phiên vào hệ gen chủng xạ khuẩn s natalensis, tạo nên chủng cải biến với hai phiên gen điều hòa dương pim M hiệu suất sinh tổng họp natamycin cao chủng tự nhiên Đồng thời, điều kiện nuôi cấy tách chiết, tinh natamycin nghiên cứu Ngoài ra, chủng s natalensis cải biến sàng lọc môi trường chứa kháng sinh rifamycin streptomycin, hai loại kháng sinh biết đến có gây đột biến gen liên quan đến trình phiên mã dịch mã vi khuẩn nhằm mục đích chọn lọc chủng đột biến với hiệu suất sinh natamycin cao chủng ban đầu [ ] Mục tiêu Mục tiêu đề tài cải biến dược chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis có khả sinh chât kháng nấm natamycin cao chủng tự nhiên 2-4 lần, xây dụng quy trình ni cấy tối ưu cho chủng Streptomyces natalensis cải biến quy trình tách chiết, tinh phân tích chât kháng nấm natamycin Ngồi mục tiêu đặt thuyết minh, chúng tơi cịn thử nghiệm nâng cao khả sinh natamycin chủng xạ khuẩn s natalensis cải biến bàng cách chọn lọc chủng đột biến kháng rifamycin streptomycin Phưong pháp nghiên cứu Chủng giong Chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis JCM 4693 = VTCC-A-3245, chủng vi sinh vật kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62 bảo quản Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật VTCC - Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Chùng E coli DH5a E coli E T 12567 [pUZ8002] quà tặng giáo sư Takuya Nihira (Đại học Osaka, Nhật Bản) Tách chiết DNA tong so từ chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs Chúng xạ khuân Streptomyces natalensis nuôi môi trường “seed medium” (g/1: glucose- 20; malt extract- ; peptone - ; NaCl-0,2 g/L pH 7.0-7.2), lắc ngày 30°c Ly tâm thu tế bào từ mỉ dịch nuôi cấy Tế bào nghiền nát que nghiền tế bào rửa lại với ml nước khử trùng Thêm 0,2 ml đệm ly giải (100 mM Tris HC1, 100 mM Na 2EDTA, 1,5 M NaCl, 1% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH 8,0), 50 Ịil lysozyme (30 mg/ml) 50 jil SDS 20% Vortex trộn mẫu ủ 65°c giờ, sau 25 phút lắc mẫu lần Ly tâm mâu 8000 g 10 phút, thu dịch sang ơng eppendorí' mới.Thêm thê tích C:I (Chloroíorm: Isoamylalcohol 24:1) thể tích mẫu ống Ly tâm 16000 g phút Thu dịch nơi, thêm lưọnơ isopropanol thể tích dịch ủ nhiệt độ - ° c giờ, 1} tâm 16000 g phút Bỏ dịch nổi, rửa cặn 70% ethanol lạnh Ly tâm 16000 g phút Bỏ dịch nổi, cô chân khơng cặn nhiệt độ phịng tới khơ Thêm 50 |il nước để hòa DNA, giữ DNA -20°c Phản ừng PCR khuếch đại gen điều hòa dương pim M Gen điều hòa dương pim M khuếch đại từ mẫu DNA tổng số phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PMD (5'-TCCTGGATCCGCCCTGTGCCCGCTCACTTCACGAAG-TCG-3’ì PMR (5 GGTTGGATCCTTGCGGTCGGTGGTGC-GGGCATTACGG- ỹ ) , vị trí gạch chân vị trí căt enzyme giới hạn Bamtìỉ Thành phần cho 10 Ị-il hỗn họp phản ứng ồm: jL.ll Go Taq Colorless Master (Promega, Madision, WI USA), 0,5 |iỉ mồi xuôi PMD; 0,5 (.li mồi ngược PMR; 3,5 Ịil H 20 ; 0,5 Ịil DNA Phản ứng khuếch đại gồm 30 chu kì, với phút biến tính 95°c, 15 giây bắt cặp mồi 62°c, phút 30 giây 72°c để kéo dài mạch, bước cuối 72°c phút giữ lạnh 4°c Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% Tạo vector tái to hợp pSE T pim M Gen pim M plasmid pSET152 căt bàng enzvme giới hạn BamHl Sau sản phâm căt lại ligation mix để tạo vector tái tổ họp pSETpimM Vector pSETpimM khuếch đại cách biến nạp vào chủng E coli DH5a chọn lọc kháng sinh apramycin sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng sử dụng IPTG X-gal Khuẩn lạc trắng lựa chọn để nuôi, tách kiểm tra plasmid pSETpimM bằne điện di với plasmid pSET152, giải trình tự gen pim M chèn plasmid pSET152 Biến nạp vector tái tồ hợp pSE T pim M vào chủng E coli ET12567 tiếp hợp với chủng s natalensis Vector pSETpimM biến nạp vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002] phương pháp sốc nhiệt 42°c phút Bằng chọn lọc kháng sinh: apramycin, kanamycin chloramphenicol; chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng, khuẩn lạc trắng lựa chọn kiểm tra có mặt vector tái tổ hợp bàng cách PCR nhân gen pimM Chủng E coli E T 12567 chứa vector tái tổ họp sử dụng để tiếp hợp với chùng s natalensis theo phương pháp Enríquez cs [5] Lựa chọn điều kiện ni cấy mơi trường thích hợp Để xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh natamycin, chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) ni cấy bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, tốc độ lắc 160 v/p, nhiệt độ 30°c ngày với điều kiện khảo sát bao gồm: - Mơi trường ni cấy: thí nghiệm tiến hành với loại môi trường dinh dưỡng khác gồm MT1 (glucose - 20, cao bò- , cao nấm men- 2, asparagin - 0,5, KH 2PO 4- 0,05 g/L); MT2 (tinh bột- 10 glucose - 10, bột đậu tương- 10, pepton - 5, CaCƠ 3~ g/1); MT3 (tinh bột - 50, bột đậu tương - 30, cao nấm men - , KH 2PO 4- 0,05, CaCC>3- g/1); MT4 (glucose - 10, peptone- 5, malt extraci - 3, cao nấm men - g/1, ml/1 MgCl2.6H20 2.5M); MT5 (glucose - 10, cao nấm men - 10 g/1); MT6 (glucose - 50, asparagines - 10, ZnS H 20 - 0,02; MgSƠ 4.7 H - 0,2; FeS 71rỈ2 0,02; CuSỏ 4.7 H 20 - 0,02 g/1); MT7 (cao nấm men - 20, tinh bột - 10 g/1) - pH môi trường MT3: điều chỉnh giá trị 5; ; 6,5; 7; 7,5; ; NaOH HC1 - Thê tích mơi trường bình ni 250 ml: thay đơi từ 25 ml đên 100 ml MT3 - Các nguồn cacbon khảo sát gồm: tinh bột, glucose, glycerol, malt extract, galactose, dextrin với nồng cộ 5% thử nghiệm thông qua việc thay tinh bột môi trường MT3 - N ing độ tinh bột trons MT3: thay đổi từ 10 đến 70 g/1 - N3ng độ K 2HPO MT3 thay đổi từ đến g/1 - Các nguồn nitơ: khảo sát gồm NaNC>3 , N H C I, (N H ) SƠ , urea, cao nâm men, cao bò với n n g CỘ g/1 đ ợ c th n g h iệm th ô n g q u a v iệc th ay th ế cao n ấm m e n tro n g m ô i trư n g M T - N ìng độ cao nấm men MT3 thay đổi từ đến 12 g/1 Lụa ctọn điều kiện tách chiết thích hợp Để xác định điều kiện tách chiết natamycin tối ưu, dịch nuôi cấy chủng xạ khn Síreptomyces natensis VTCC-A-3245 (M2) loại bỏ tế bào trộn với dung mơi Sau hỗn hợp tách chiết khuấy trộn liên tục bằns máy khuấy từ Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết khảo sát bao gồm: - Ảnh hưởng loại dung môi: dung môi tách chiết khảo sát bao gồm butanol, hexan eth /1 acetate, tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy 1:1 (v/v), hỗn hợp tách chiết đảo trộn liên tục v ố tốc độ 500 v/p 30°c - Ả ih hưởng tỷ lệ dịch nuôi cấv : dung môi (v/v): tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi thay đổi từ 1:0,5; 1:1; 1:2 1:3 (v/v) Hỗn họp tách chiết khuấy trộn liên tục với tốc độ 500 v/p 30°c - Ả ih hưởng thời gian tách chiết: thời gian tách chiết tăng dần từ 30 phút, giờ, 1,5 Ó với tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy 1:1 (v/v), tốc độ khuấy trộn 500 v/p ỡ 30°c - Ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn: tốc độ khuấy trộn khảo sát bao gồm 300, 500, 600 800 v/p Hỗn hợp tách chiết có tỷ lệ dung mơi : dịch nuôi cấy 1:1 (v/v) đảo trộn liên tục băng máy khuấy từ 30°c Gây đột biến kháng sinh Các đột biến kháng rifamycin thu nhận từ khuẩn lạc sống sót ngày sau trải giơng cấp đĩa thạch GYM chứa riíamycin với nồng độ khác Sau chủng đột biến kháng rifamycin tiềm tiếp tục gây đột biến theo quy trình tương tự với streptomycin Xác định hoạt tính natamycin Hoạt tính natamycin xác định định tính theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch [4] với chủng kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62 Ket vịng hoạt tính xác địah sau 24 ủ đĩa thạch 30 c Tinh natamycin sắc kỷ lỏng cao áp (HPLC) Natamvcin tinh cột sắc ký Eclipse Plus (5 um, 4,6 x 250 mm) (Agilent, Mỹ) Phương pháp HPLC cài đặt sau: nồng độ acetonitrile 15% phút, tăng đến 50% phút, tăng tiếp đến 85% phút, giữ 85% phút cuối cân lại cột băng 5% acetonitrile phút; tốc độ dịng 0,5 ml/phút; thu tín hiệu dải bước song từ 190 - 600 nm Đỉnh natamycin so sánh với phổ hấp thụ chất chuẩn natamycin thư viện HPLC Đại học Osaka, Nhật Bản Natamycin tinh gửi phân tích khối phố LCMS Khoa Y Dược, ĐHQGHN ’ Tông kết kết nghiên cứu 4.1 Cải biến di truyền, tạo chủng xạ khuẩn s natalensis có khả sinh chất kháng nam natamycin cao chủng tự nhiên Khuếch dại gen điểu hòa dương pim M từ DNA tong so chủng s natalensis Trong cụm gen sinh tống hợp natamycin, gen pim M chứng minh gen điều hòa dương đường tổng hợp natamycin pim M promoter (~ lkb) khuếch đại từ DNA tống số c ủ a c h u n g x k h uan s natalensis b an g P C R sứ d ụ n g cặp m i P M D v P M R S an p h â m P C R d ợ c điện di kiêm tra gel agarose 1% với băng xuất có kích thước gần kb mong đợi (hình 1) M Hình 1: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ DNA tổng số (M: l Marker; : pimM; 2: Đối chứnơ âm) Hình 2: Gel điện di vector tái tổ hợp pSETpimM tách từ khuân lạc trăng E c°li DH5ct (1: Đối chứng - pSET152; 2: pSETpimM) Tạo vector tái tổ hợp pSETpimM Plasmid pSET152 pim M cắt Bam ỉỉl nối lại ligation mix đế tạo vector tái tô họrp pSETpimM Vector pSETpimM bi ến nạp thành cône vào chủne; E coli DH5a nhàm khuếch đại vector pSETpimM Chủng E coli DH5a biến nạp nuôi tách plasmi d pSETpimM để kiểm tra có mặt vector tái tồ họp pSETpimM Bằng phương pháp điện di, vector pSETpimM có kích thước lớn kích thước vector pSET152 mong đợi (hình 2) Thêm vào đó, vector tái tổ họp pSETpimM gửi giải trình tự để kiêm tra đoạn chèn pim M Kết giái trình tự cho thấy đoạn gen pim M chèn vector có trình tự tương đồng 100% với gen pim M AM49372.1 ngân hàng gen sử dụng công cụ tìm kiếm blast Vì vậy, kết gi ải trình tự khơng có đột biến xuất đoạn gen pim M chèn vector tái tổ hợp Biến nạp vector tái tổ hợp pSE T pim M vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002] tiếp hợp với ch ủ ng s natalensis Bằng phương pháp sốc nhiệt, vector pSETpimM biến nạp vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002] Hai khuẩn lạc trắng lựa chọn cho thí nghiệm PCR nhân gen pỉm M để kiểm tra có mặt vector pSETpimM Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% kết cho thấy hai khuẩn lạc trắng có băng gần kb xuất trùng với đối chúng dương (hình 3) Như vậy, pSETpimM biến nạp thành công vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002] 925 bp Hình 3: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ khuẩn lạc E coli ET12567 biến nạp M: XMarker 1: Đối chứng dương (khuôn pSETpimM) 2: p im M PCR từ khuẩn lạc trắng 3: pim M PCR từ khuẩn lạc trắng 4: Đối chứng âm (khn pSET152) Hình 4: Các thể tiếp họp xuất đĩa thạch YS Đe chuyển copy gen pim M vào gen chủng s natalensis, chúng E coli E T 12567 [pUZ8002] chứa vector pSETpimM tiếp họp với bào từ s natalensỉs Bằng cách sử dụng 107 bào tử s natalensis cho thí nghiệm tiếp họp có khoảng 80 khuẩn lạc mọc đĩa thạch MS sau ngày ủ 30°c (hình 4) S àng lọc chủng s natalensis có chứa gen p im M tích hợp thêm vào hệ gen 60 khuẩn lạc dĩa MS agar cấy vạch lại môi trường YS bổ sung thêm kháng sinh apramycin nalidixic acid Một khuẩn lạc mọc đĩa YS có bổ sung kháng sinh lựa chọn đê nuôi cấy tách DNA tổng số đề làm khuôn cho phản ứnơ PCR nhân gen apramycin Chủng đánh số VTCC-A-3245 (M2) Trên gel agaroase 1%, có băng kb từ giếng mẫu sử d ụ n khuôn DNA tổng số chủng cải biến trùng với đối chứng dương sử dụng khn pSET152, khơng có băng từ mẫu đối chứng âm sử dụng DNA tổng số chủng hoang dại xuất (hình 5) Vì vậy, chùng cải biến tiếp họp thành công vector tái tổ hợp hệ M bp Hình 5: Gel điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Apramycin từ chủng cải biến 1: Đối chứng âm (khuôn DNA tổng số chủng s natalensis) 2: Chủng cải biến (khuôn DNA tổng số chủng S.nataỉensis cải biến) 3: Đối chứng dương (khuôn vector pSET152) M: X Marker Đảnh giá lượng natamycìn chủng xạ khuẩn cải biến Để kiểm tra khả sinh natamycin chủng s natalensis đột biến so với chủng dại, dịch nuôi cấy hai chủng tách chiết với n-butanol phân tích HPLC Ket phân tích diện tích đường cong peak natamycin hai mẫu dịch tách từ hai chủng cho thây chủng cải biến có lượng natamycin cao gấp gần lần so với chủng hoang dại (hình ) Kêt cân lượng sinh khối khơ hai chủng cho thấy tốc độ sinh trường hai chủng Hình : Kết HPLC mẫu tách chiết natamycin từ chủng s natalensis cải biến (B) s natalensis hoang dại (A) chủng 4.2 Xây dựng qui trình ni cấy tối ưu cho chủng s nataỉensis cải biến A n h hưởng loại m ôi trường dinh dưỡng Khả sinh natamycin chủng cải biến Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) khảo sát loại môi trường khác (kí hiệu MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT , MT7) Kết hình cho thấy, mơi trường tốt cho khả sinh natamycin chủng nghiên cứu môi trường MT3, MT2, MT5, MT4, MT1, MT7 Trong môi trường MT , chủng sinh trưởng khône; sinh natamycin Như môi trường MT3 (tinh bột - 50 bột đậu tương 30, cao nấm men - , KH 2PO 4- 0,05 CaCOi- g/1) lựa chọn mơi trưỊTig phù họp nhât cho khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) \ V V - *A "0 n \T>'5 v A t^ Hình 7: Ảnh hường loại môi trường dinh dưỡng lên khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê số liệu tính tốn bàng T test Ợ p < 0,05) A n h h n g thê tích mơi trường bình nuôi v p H m ôi trường Với mục đích xác định ảnh hưởng nồng độ oxi hịa tan môi trường nuôi đến khả sinh natamycin chủng nghiên cứu, tiến hành thay đổi thể tích mơi trường bình ni từ 25, 50, 75, 100 ml/bình 250 ml Kết hình cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhât thê tích mơi trường 50 mỉ Tăng giảm thê tích mơi trườnơ làm giảm tổng hợp natamycin chủng 30 Ị ") ■%-ị 20 H - - Ẽ = 15 í = 10 '2 15 * 10 r ỉ ỉ 00 Tké tich mơi trường (mL) pH Hình 9: Ảnh hưởng pH lên khả Hình : Ảnh hưởng thể tích mơi trường sinh natamycin chủng s natalensis lên khả sinh natamycin chủng s cải biến natalensỉs cải biên Sai khác thống kê số liệu tính tốn T test (*p < 0,05) Ảnh hưởng pH đến khả sinh natamycin chủng VTCC-A-3245 (M2) nghiên cứu xác định dải pH từ đến (hình 9) Kết hình cho thấy, chúng VTCCA-3245 (M2) có khả sinh trường sinh natamycin tốt dải pH rộng (từ pH đến 9), trons khoảng tối ưu từ pH đến Tại khống pH tối ưu này, kích thước vịng hoạt tính đạt 23 - 24 mm sau ngày nuôi cấy A nh hưởng nguồn cacboiĩ nồng độ tinh bột Anh hưởng nguôn cacbon lên khả sinh natamycin chủng s natalensis cải biên dược hình 10 Chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tôt tât nguôn cacbon khảo sát galactose nguồn cacbon tốt với đường kính vịng hoạt tính đạt 26.5 ram sau ngày nuôi cấy Tiếp theo nguồn tinh bột, malt extract dextrin có đường kính vịng hoạt tính đạt 23.5-24 ram sau ngày nuôi cấy Mặc dù, galactose nguồn cacbon ưu cho khả sinh natamycin chủng VTCC-A-3245 (M2) xem xét thêm khía cạnh vê mặt giá thành mức độ phong phú nguồn nguyên liệu thi tinh bột lựa chọn nguồn cacbon phù họp cho chủng 30 10 ỉ/ 10 GV)'" t i » v' 20 30 40 50 60 Nong độ tinh bộr (g L) (yữ V ‘ -" Hình 10: Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) 70 Hình 11: Anh hưởng nồng độ tinh bột lên khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê số liệu tính tốn T test (*p < 0,05) Kết ảnh hường nồng độ tinh bột khác lên khả sinh natamycin chủng VTCC-A-3245 (M2) cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt nồng độ tinh bột 20 g/1 (hình 11) Ở nồng độ tinh bột 20 g/1, đường kính vịng hoạt tính đạt cao 29,5 mm sau ngày nuôi cấy A n h hưởng nông độ phosphate Ảnh hưởng nồng độ phosphate lên khả sinh naíamycin chủng VTCC-A-3245 (M2) xác định bàng cách thay đổi nồng độ KH2PO4 môi trường nuôi cấy từ đến 1,0 g/1 Kêt thu hình 12 cho thấy chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt tất nồng độ KH 2PO khảo sát, đường kính vịng hoạt tính đạt cao 23 mm sau ngày nuôi cấy nồng độ KH2PO4 0,05 g/1 lỡ zl 0,05 cụ ũ=_ 0.3 v,_, vt > ổ nơ độ K ọ H P (g L) Hình 12: Ảnh hường phosphate lên khả sinh natamycin chủng s natalensis VTCC-A3245 (M2) Sai khác thống kê sổ liệu tính tốn T test (*p < 0,05) A n h hưởng nguồn nitơ nong độ cao nấm men Sự tống hợp natamycin chủng VTCC-A-3245 (M2) khảo sát nguồn nitơ hữu vô khác NaNƠ 3- NH4CI, (NH^)2S0 , urea, cao nấm men, cao bò Chủng VTCC-A3245 (M2) sinh natamycin cao môi trường chứa nguồn nitơ cao nấm men với đường kính vịng hoạt tính đạt 24,5 mm sau ngày ni cấy Tiếp theo (NH )2SC>4 với đường kính vịng hoạt tính đạt 21mm, NH4CI - 17 mm NaNƠ - 16 mm sau ngày nuôi cấy Trong mơi trường chửa nguồn nitơ cao bị urea, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh trường tốt không sinh natamycin (hình 13) * N ỏ n g đ ộ c a o n â m m e n ( g /L ) Hình 13: Ánh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Hình 14: Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên khả sinh natamycin chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê số liệu tính tốn T test (*p < 0,05) Khả sinh natamycin chủns VTCC-A-3245 (M2) khảo sát nồng độ cao nấm men thay đổi từ đén 12 g/1 Kết hình 14 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt tất nồng độ cao nấm men thí nghiệm, dường kính vịng hoạt tính đạt cao 26 mm sau ngày nuôi cấy môi trường có nồng độ cao nấm men g/1 Tuy nhiên, so sánh nồng độ cao nấm men g/1 g/1 kích thước vịng hoạt tính đo khác không nhiều (24 mm 26 mm, tương ứng) nên nuôi cấy quy mô lớn có thê xem xét sử dụng nồng độ cao nấm men g/1 để giảm chi phí Để thấy rõ ảnh hưởng thành phần môi trường lên khả sinh natamycin chủng Sừeptomycẻs nulalensis VTCC-A-3245 (M2), tiên hành so sánh tông hựp natamycin chủng môi trường tối UXI mơi trường khơng tối ưu Ket hình 15 cho thây, đường kính vịng hoạt tính đạt cao mơi trưịng tối ưu khơng tối ưu 26 mm 18 ram, tương ứng, sau ngày ni cấy Như thấy sau q trình lựa chọn mơi trường ni cấy thích họp đường kính vịng hoạt tính tăng lên khoảng 44% so với môi trường ban đầu 30 = s ec* 25 DD i •p s - £ ‘I 10] - fuc ỷ 2Ỉắ.c ẳ)f!ẻị đécO.Ợ )ýi&Í.Ảdj>.CấÁ CÁ2 :{ểyih .^Ci Srỷ Áa ■■.tâ a f)ữ£i Ẳ ỉẩđ' .t/Cuhỹ .■^< ỳ - ứ cu b S } X x - ĩ í lr> $ D ,ữ a ó lÁ p ỷ' Ớ l K x r/^ r / Ẩxx ỉ, & i , l éýỉ đềit^./ộkỏiiủ : - ^f ổ -n ìd : -tÁ : n7ũ Ẵ'aS.‘.Ìtử ( S n ổ ịU ^ c C - Cctn ■■tứ m 4ÍT .{ĩịs\ ă & f -íVh -t£C- ■■(W/ĩ-