p h Kho h H GHN: Kho h nhi n v C ng ngh p 33 2S (2017) 77-83 Nghi n ứu huyển gen mã hó ho GA20-oxid se s điều khiển ủ promoter CAD4 biểu hi n đặ hi u xylem vào Thu (Nicotiana tabacum) Nguyễn Hồng Nhung1 Bùi Phương hảo1 Nguyễn Văn o i1, Nguyễn Văn Phong2 L hị Vân Anh3, Ph m B h Ng 1,* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Viện Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp, Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Nh n ng y 16 tháng năm 2017 Chỉnh sử ng y 20 tháng năm 2017; Chấp nh n đăng ng y 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Nhiều ng trình nghiên cứu giới chuyển gen mã hóa cho GA20-oxidase vào th c v t t o dịng chuyển genGA20ox có tác dụng khả kéo d i thân v gi tăng sinh kh i Tuy nhiên, s tác giả nh n thấy s biểu hi n mức GA20ox s điều khiển củ promoter định mang l i tính tr ng bất lợi ho ây giảm k h thước s phát triển rễ Trong nghiên cứu này, vector chuyển gen nhị thể pBI121 chứa gen GA20ox mã hóa cho GA20-oxid se s điều khiển củ promoter CAD4 đặc hi u xylem (phân l p từ ây Dương l i (Populus trichocarpa) thiết kế Vector thiết kế chuyển gen vào gi ng Thu c (Nicotiana tabacum) K326 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thu kết gen chuyển biểu hi n đặc hi u vùng xylem qua phản ứng RT-PCR Các dòng thu c chuyển gen có khả sinh trưởng t t so với mẫu đ i chứng, chiều o ây tăng từ 20-60%, t độ sinh trưởng trung bình gấp đến 1,66 lần Gen chuyển GA20ox s điều khiển củ promoter CAD4 tăng khả bi t hó xylem độ rộng vùng xylem dòng chuyển gen tăng l n từ 17-59% so với ây đ i chứng Vector chuyển gen mã hóa cho GA20-oxid se s điều khiển củ promoter CAD4 thiết kế chuyển gen vào mơ hình sử dụng t o gi ng trồng lâm nghi p có khả sinh trưởng nhanh cho sinh kh i gỗ lớn Từ khóa: Nicotiana tabacum, GA20-oxidase, CAD4 Mở đầu có ảnh hưởng đến q trình phát triển khác th c v t bao gồm s nảy mầm h t sinh trưởng thân, hoa t o GA ũng đượ biết đến với v i trò k h th h phân hi tế b o tầng phát hi n v tăng trưởng nhanh chóng ủ sợi xylem kéo d i Cho đến n y xá định 136 chất thuộc nhóm này, nhiên vài chất có ho t tính sinh h c, ví dụ GA1 v GA4 [1] Gibberellin (GA) hợp chất sinh trưởng thuộc d ng diterpenes có vai trò quan tr ng vi điều hò trình sinh trưởng _ giả li n h : 84-912247887 Email: pbngoc@ibt.ac.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4586 77 78 N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 Trong s gen tham gia vào trình sinh tổng hợp GA d ng ho t động, gen mã hoá cho GA20-oxidase (GA20ox) nắm giữ vai trị vi điều khiển q trình [2] Cá nghi n ứu gần tá h dịng gen mã hó ho enzyme sinh tổng hợp GA mở r triển v ng ải biến s biểu hi n ủ húng ây huyển gen để nghi n ứu v hế điều hò ăng ường s tổng hợp GA20ox mã hóa cho GA20-oxidase dẫn đến mứ độ tổng hợp GA d ng ho t động tăng l n [3-5] Khi tăng ường biểu hi n gen mã hó ho GA20-oxid se ây dương huyển gen s sinh trưởng kéo d i ủ lóng thân v tăng sinh kh i gỗ đượ ghi nh n uy nhi n biểu hi n mứ GA20ox s điều khiển ủ promoter định ó thể gây n n t nh tr ng bất lợi ho giảm k h thướ thân v r rễ [6] Do vi sử dụng promoter đặ hi u nhằm mụ đ h kiểm soát mứ độ biểu hi n ủ GA20oxở s m qu n định l ần thiết Chuyển gen v o th v t sử dụng promoter đặ hi u m h dẫn (phloem/xylem) ho phép gen đ h biểu hi n đặ hi u m h dẫn v l bi n pháp đầy hẹn vi kiểm soát b nh h m ch [7-8] Promoter ủ gen CAD4 sử dụng nghi n ứu đượ phân l p từ ây Dương l i (Populus trichocarpa) Gen CAD4 mã hóa cho Cinamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) – enzyme đóng v i trị qu n tr ng trình tổng hợp lignin.Cá nghi n ứu trướ hứng minh promoter ủ CAD4 có t nh đặ hi u m h dẫn (xylem) [9] Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 V t liệu 2.1.1 V t liệu thực v t Cây Thu (Nicotiana tabacum) K326 nu i điều ki n in vitro Phòng C ng ngh tế b o th v t Vi n C ng ngh Sinh h ung ấp 2.1.2 Chủng vi khuẩn vector Chủng vi khuẩn E coli DH5α A tumefaciens C58 Phòng C ng ngh tế b o th v t Vi n C ng ngh Sinh h ung ấp Ve tor tá h dòng pB gen GA20ox phân l p từ ây Arabidopsis thaliana vector huyển gen pBI 101 promoter CAD4 điều khiển biểu hi n gen GUS phòng C ng ngh tế b o th v t - Vi n C ng ngh Sinh h ung ấp 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm - Kit tinh s h DNA (A uPrep Gel Purification Kit) - Kit tá h hiết v tinh s h pl smid (Plasmid Extraction Kit) - Cặp mồi nhân gen ủ hãng Bioneer (H n u ) rình t ặp mồi đặ hi u sử dụng để nhân đo n gen GA20ox F/GA20-SmaI R/GA20 CCCGGGATGGCCGT AAGTTTCGTAACAA GAGATGAGTTTCTGTT CGATGGGTTTGGTG - Cá lo i enzyme giới h n (SmaI, SacI), Taq polymerase dN Ps th ng DNA kb hãng Ferment s (Mỹ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20ox điều khiển promoter CAD4 Ve tor huyển gen pBI101/CAD4::GUS vector pBT/GA20ox đượ ặp enzyme giới h n SmaI SacI sau ghép n i với nh u để t o pl smid tái tổ hợp Pl smid tái tổ hợp n y đượ biến n p v o E oli DH5α phương pháp s nhi t v kiểm tr phản ứng olony – PCR với ặp mồi đặ hi u khuế h đ i gen GA20ox Chu kỳ nhi t độ phản ứng PCR s u: 94oC: phút, 35 hu kỳ [94oC: 40 giây,58oC:40 giây, 72oC: phút], 72oC: phút, 4oC: ∞ Pl smid Extr tion Kit (Bioneer) đượ sử dụng để tá h hiết pl smid đ i với khuẩn N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 l m ng gen huyển s u kiểm tr phản ứng PCR Cá mẫu pl smid tái tổ hợp đượ kiểm tr enzyme giới h n SacI HindIII 2.2.2 Phương pháp tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen CAD4::GA20ox Pl smid tái tổ hợp đượ biến n p v o tế b o A Tumefaciens khả biến phương pháp xung n v đượ kiểm tr phản ứng colony-PCR sử dụng ặp mồi đặ hi u khuế h đ i đo n gen GA20ox để h n l dòng tế b o mang vector biến n p 2.2.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Phương pháp huyển gen v o thu thông qu vi khuẩn A tumefaciens đượ tiến h nh theo phương pháp ủ opping v ộng s (1998) ó ải tiến [10] 2.2.4 Phương pháp đánh giá biểu gen chuyển chuyển gen Cá dòng thu huyển gen v đ i hứng đượ thu để tá h hiết DNA tổng s theo phương pháp C AB ủ Collins v ymons (1992) s u đượ kiểm tr s ó mặt ủ gen huyển phản ứng PCR với ặp mồi đặ hi u gen huyển GA20ox RNA tổng s tá h hiết từ ph n nh u (thân v lá) đượ dùng để tổng hợp DNA v kiểm tr phản ứng PCR với ặp mồi đặ hi u nhân đo n gen GA20ox (RT-PCR) 2.2.5 Phương pháp đánh giá tiêu sinh lý chuyển gen Đánh giá tốc độ sinh trưởng: o hiều o thân ây dòng thu huyển gen v đ i hứng t nh từ g ho đến đỉnh sinh trưởng s u tháng Phương pháp giải phẫu: Lát ng ng thân lóng thứ ủ dòng thu huyển gen v đ i hứng đượ nhuộm xylem ỏ C rmine v X nh methylene i u đượ soi k nh hiển vi v t k nh 4X 10X v hụp ảnh ộ rộng vùng xylem đượ đo phần mềm xử lý hình ảnh Im geJ 79 Phương pháp xử lý số liệu: li u đượ xử lý phần mềm Mi rosoft Ex el Kết thảo luận 3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang gen GA20ox điều khiển promoter CAD4 Vector tách dòng pBT/GA20ox điểm ủ enzyme giới h n SmaI SacI t i đầu 5’ v 3’ ủ gen GA20ox (gắn đu i cmyc) ồng thời ve tor pBI101/CAD4::gus ũng điểm ủ enzyme giới h n SmaI SacI t i đầu ủ gen gus Kết phản ứng thể hi n hình 1A ho thấy sản phẩm plasmid pBT/GA20ox gồm ó băng DNA rõ r ng: băng DNA ó k h thướ khoảng kb với k h thướ ủ ve tor pB ; băng DNA ó k h thướ khoảng kb ( h nh xá l 1176 bp) tương ứng với gen GA20ox ản phẩm cắt pl smid pBI101/CAD4::gus gồm ó băng: băng DNA ó k h thướ khoảng 12 kb tương ứng với ve tor pBI101/CAD4 v băng DNA ó k h thướ khoảng kb tương ứng với gen gus, điều n y hứng tỏ phản ứng enzyme giới h n xảy r ho n to n v vị tr Kết sản phẩm kiểm tr pl smid tái tổ hợp pBI101/CAD4::GA20 enzyme SmaI SacI hình 1C ho băng k h thướ khoảng 12 kb v kb với k h thướ t nh toán ủ ve tor pBI101 m ng promoter CAD4 gen GA20ox Ve tor n y đượ biến n p v o vi khuẩn A tumerfaciens hủng C58 v h n l tr n m i trường bổ sung 50mg/l Kanamycin 50mg/l Rifamycin, phản ứng PCR khuẩn l ũng đượ th hi nvới ặp mồi đặ hi u khuế h đ i đo n gen GA20ox cho kết dương t nh (kết kh ng hỉ r đây) Cá kết tr n chứng tỏ t o đượ thành công hủng vi khuẩn A.tumefaciens m ng ve tor huyển gen GA20ox s điều khiển ủ promoter CAD4 (sơ đồ ve tor huyển gen thể hi n hình 1C) 80 N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 A B C Hình Kết thiết kế ve tor huyển gen m ng gen GA20ox s điều khiển ủ promoter CAD4 A: Kết n di sản phẩm ve tor pBI101/CAD4::gus pBT/GA20 enzyme SmaI SacI B: Kết n di sản phẩm ve tor pBI101/CAD4::GA20 enzyme SmaI SacI C: đồ ấu trú ve tor huyển gen nhị thể pBI101/CAD4::GA20ox 3.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc CAD4::GA20ox 3.2.1 Kết chuyển cấu trúc CAD4::GA20ox vào thuốc Trong nghi n ứu n y gi ng thu K326 (N tabacum) l m đ i tượng để huyển ấu trú CAD4::GA20ox thiết kế nhằm đánh giá nh nh ảnh hưởng ủ ấu trú n y đến khả tái sinh v tỷ l huyển gen ủ mẫu nu i ũng mứ độ biểu hi n ủ gen huyển B l th nghi m đượ th hi n v thu đượ kết tỷ l tái sinh hồi huyển gen l 76 67% tỷ l r rễ l 91 11% 3.2.2 Kết kiểm tra biểu gen chuyển dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20ox Kết kiểm tr s ó mặt ủ gen huyển 15 dòng thu r rễ tr n m i trường h n l v dòng đ i hứng kh ng huyển gen (W ) thu đượ hình 2A ho thấy tất ả dòng huyển gen xuất hi n băng DNA k h thướ khoảng kb với k h thướ lý thuyết ủ đo n gen GA20 (1176bp) Kết th hi n R -PCR hình 2B ho thấy gen huyển đượ biểu hi n nhiều mẫu thân mẫu kh ng biểu hi n khẳng định s điều khiển biểu hi n gen ủ promoter CAD4 ó t nh đặ hi u xylem L hị Vân Anh v ộng s huyển gen gus s điều khiển ủ promoter CAD4 v o ây Dương ũng nh n thấy biểu hi n ủ GU m nh ph n ó xylem [11] tăng ường biểu hi n ủ gen GA20ox vùng xylem dẫn đến s mở rộng vùng xylem ủ dòng huyển gen so với dòng đ i hứng iều n y đượ thể hi n kết giải phẫu lát ng ng thân dịng huyển gen (hình 2D) v đo độ rộng vùng xylem (3C) 3.2.3 Kết đánh giá sơ tiêu sinh lý dòng thuốc chuyển cấu trúc CAD4::GA20ox Sau tháng trồng nh lưới ả dòng thu huyển gen pCAD4::GA20ox đượ l h n ngẫu nhi n o so với ây đ i hứng kh ng huyển gen kết đượ thể hi n hình 3A hú ý h i dòng s v ho kết hiều d i thân lớn tương ứng gấp 61 v 39 lần so với ây W độ tăng trưởng trung bình ủ dịng huyển gen v 11 l 59 m/ng y v 51 m/ng y so với ây đ i hứng l 36 m/ng y Kết n y gi ng với nghi n ứu ng b trướ huyển gen GA20ox v o đ i tượng th v t nh u kho i tây [12]; thu [9]; dương; ải dầu [13] Kết đo đường k nh thân hình 3B ho thấy biểu hi n ủ GA20ox s điều khiển ủ promoter CAD4 h n hế đượ t nh tr ng bất lợi Kết đánh giá ảnh hưởng ủ GA20ox đến s hình th nh xylem thể hi n hình 3C ho thấy độ rộng vùng xylem ủ mẫu N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 thu huyển gen lớn so với mẫu đ i hứng ụ thể l tăng từ 17-59% (dịng 1-4) so với mẫu đ i hứng Do GA20-oxidase có vai trị qu n tr ng đ i với q trình bi t hó xylem v ảnh hưởng đến s phát triển ủ xylem thứ ấp vi tăng ường biểu hi n 81 GA dẫn đến độ rộng vùng xylem tăng l n Kết n y tương đồng với kết nghi n ứu trướ ủ Jeon v ộng s (2015) tr n đ i tượng ây Arabidopsis thaliana dương [13] A C B D Hình Kết kiểm tr s biểu hi n ủ gen huyển dòng thu huyển gen CAD4::GA20ox A: Kết kiểm tr s ó mặt ủ gen GA20ox dịng thu huyển gen (- : Đối chứng âm - sản phẩm PCR với thành phần phản ứng không chứa DNA; WT: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số tách chiết từ WT; 1-13: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số tách chiết từ chuyển gen CAD4::GA20ox dòng 1-13 tương ứng; (+): Đối chứng dương - sản phẩm colony- PCR vi khuẩn A.tumefaciens C58 mang vector chuyển gen CAD4::GA20ox; M: Thang chuẩn DNA 1kb) B: Kết kiểm tr s biểu hi n ủ gen GA20ox s điều khiển ủ promoter CAD4 dòng thu huyển gen (WT(T), (L): Kết RT-PCR mẫu thân, dòng đối chứng;1(L): Kết RT-PCR mẫu dòng chuyển gen 1; 1(T), 2(T), 3(T), 4(T): Kết RT-PCR mẫu thân dòng chuyển gen 1, 2, 3, 4) C: Hình ảnh ây thu huyển gen dòng (trái) v dòng đ i hứng (phải) s u tháng trồng điều ki n nh lưới D: Kết giải phẫu lát ng ng thân ủ dòng thu huyển gen CAD4::GA20ox 1-5 v đ i hứng (W ) 82 N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 A B C Hình Kết đánh giá sơ hỉ ti u sinh lý ủ dòng thu huyển ấu trú CAD4::GA20ox A: Kết đo hiều o thân dòng thu huyển gen CAD4::GA20ox 1-5 v dòng đ i hứng (W ) s u tháng trồng điều ki n nh lưới B: Kết đo đường k nh thân (phần h mặt đất m) dòng thu huyển gen CAD4::GA20ox 1-5 dòng đ i hứng (W ) s u tháng trồng điều ki n nh lưới C: Kết giải phẫu lát ng ng thân v đo độ rộng vùng xylem ủ dòng thu huyển gen CAD4::GA20ox 1-5 v đ i hứng (W ) Kết luận Vector chuyển gen nhị thể pBI121 chứa gen GA20ox mã hóa cho GA20-oxid se s điều khiển củ promoter CAD4 đặc hi u xylem (phân l p từ ây Dương l i Populus trichocarpa) thiết kế chuyển gen vào gi ng thu c Nicotiana tabacum K326 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.Thông qua phản ứng RT-PCR, gen chuyển biểu hi n đặc hi u vùng xylem Các dịng thu c chuyển gen có khả sinh trưởng t t so với mẫu đ i chứng, chiều o ây tăng từ 20-60%, t độ sinh trưởng trung bình gấp đến 1,66 lần Gen chuyển GA20ox s điều khiển promoter CAD4 làm tăng khả bi t hó xylem độ rộng vùng xylem dòng chuyển gen tăng lên từ 17-59% so với ây đ i chứng Lời cảm ơn Nghi n ứu đượ th hi n kinh ph ề t i “Nghi n ứu h n t o v đánh giá dòng xo n t biến đổi gen sinh trưởng nh nh ó triển v ng” Chương trình C ng ngh sinh h N ng nghi p – hủy sản Bộ N ng nghi p v Phát triển N ng thôn Tài liệu tham khảo [1] Dayan J., Gibberellin transport Annual Plant Reviews 49 (2016) 95 [2] Hedden P., Thomas S G., Gibberellin biosynthesis and its regulation, Biochemical Journal 444 (2012) 11 [3] Eriksson, M E., Israelsson, M Olsson, Moritz T., Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length, Nature Biotechnology 18 (2000) 784 [4] Yaxley J R., Gibberellin Biosynthesis Mutations and Root Development in Pea, Plant Physiology 125 (2011) 627 [5] Yamaguchi S., Gibberellin Metabolism and its Regulation, Annual Review of Plant Biology 59 (2008) 225 [6] Yamaguchi S., Kamiya Y., Gibberellin Biosynthesis: Its Regulation by Endogenous and Environmental Signals, Plant Cell Physiol 41 (2000) 251 [7] Hedden P., Kamiya Y., Gibberellin biosynthesis: Enzymes, Genes and Their Regulation, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48 (1997) 31 [8] Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., Grima-Pettenati J., Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants, Plant Molecular Biology 27 (1995) 651 [9] Niu S., Li Z., Yuan H., Fang P., Chen X., Li W., Proper gibberellin localization in vascular tissue N.H Nhung nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, T p 33, Số 2S (2017) 77-83 is required to regulate adventitious root development in tobacco, Journal of Experimental Botany 64 (2013) 3411 [10] Topping J., Tobacco Transformation, Plant Virology Protocols (1998) 365 [11] Le Thi Van Anh, T D E., Characterization of poplar metal transporters to improve rehabilitation of metal polluted soils, Institut des Sciences du Végétal, 2012 83 [12] Carrera E., Bou J., Garcia-Martínez, J L., Prat S., Changes in GA 20-oxidase gene expression strongly affect stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants, Plant Journal 22 (2012) 247 [13] Jeon H W., Cho J S., Park E J., Han K H., Choi Y I., Ko J H., Developing xylempreferential expression of PdGA201, a gibberellin 20-oxidase from Pinus densiflora, improves woody biomass production in a hybrid poplar, Plant Biotechnology Journal 14 (2015) 1161 Transformation of GA20-oxidase Gene under Regulation of Xylem-specific Promoter CAD4 in Tobacco (Nicotiana tabacum) Nguyen Hong Nhung1, Bui Phuong Thao1, Nguyen Van Doai1, Nguyen Van Phong2, Le Thi Van Anh3, Pham Bich Ngoc1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Institute of Forestry Biotechnology, Forestry University, Hanoi, Vietnam Journal of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Abstract: Overexpression of GA20ox gene encoding GA20-oxidase in plants have resulted in increasing stem elongation and improving growth rate However, constitutive overexpression of GA20ox driven by the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter is frequently accompanied by undesirable phenotypes such as poor rooting and small leaves In this study, transgenic binary vector pBI101 carrying GA20ox gene encoding GA20-oxidase (binding c-myc tail) under the control of xylem-specific promoter CAD4 was successfully constructed and transformed into Agrobacterium tumefaciens strain C58 All the transgenic lines showed the xylem-specific expression of GA20oxidase when using RT-PCR reaction All selected transgenic tobacco lines exhibited enhanced stem elongation compared to wild type (WT) control lines, the stem heights of transgenic lines increased from 20 to 60%, compared to that of WT lines The stem elongation of transgenic lines had rates of up to 1,66 folds higher than that of WT The histological staining of stem cross section showed that all the selected transgenic lines exhibit an substantial increase in xylem differentiation compared to WT, xylem widths of transgenic lines increase from 17-59% than WT The constructed vector can be used to transform in other woody plants to produce transgenic lines which grow rapidly and enhance wood formation Keywords: Nicotiana tabacum, GA20-oxidase, CAD4 ... gibberellin 20 -oxidase from Pinus densiflora, improves woody biomass production in a hybrid poplar, Plant Biotechnology Journal 14 (2015) 1161 Transformation of GA20- oxidase Gene under Regulation of Xylem- specific. .. Abstract: Overexpression of GA20ox gene encoding GA20- oxidase in plants have resulted in increasing stem elongation and improving growth rate However, constitutive overexpression of GA20ox driven by... GA20- oxidase (binding c-myc tail) under the control of xylem- specific promoter CAD4 was successfully constructed and transformed into Agrobacterium tumefaciens strain C58 All the transgenic lines showed