Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 Nghiên cứu phương pháp sử dụng enzyme peroxidase tách chiết từ củ cải trắng ñể xác định hàm lượng thủy ngân nước nhiễm Trần Thị Hồng*, Trần Hoàng Thanh, Nguyễn Thị Hà Giang Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 29 tháng 12 năm 2007 Tóm tắt Bài báo ñã tiếp thu thành tựu lĩnh vực công nghệ enzyme xử lý môi trường nước, nghiên cứu sử dụng Enzyme Peroxidase (POD) tách chiết từ củ cải trắng ñể xác ñịnh hàm lượng thủy ngân nước ô nhiễm Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein củ cải 0,1269 mg/g; Enzyme POD hoạt ñộng mạnh giá trị pH = 6,5; Ion Hg2+ ảnh hưởng đến hoạt tính POD, enzyme hồn tồn hoạt tính giá trị nồng độ 5mg/l Hg2+ ðây hướng nghiên cứu thân thiện với mơi trường, có giá trị thực tiễn cao với phạm vi áp dụng rộng rãi Mở ñầu∗ máy lọc dầu, sản xuất sản phẩm cao su, chưng cất than ñá này…[2] Củ cải trắng tên khoa học Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae Củ cải trắng chứa 92% nước, 1,5% protit, 3,7% glucit, 1,8% cellulose Trong củ cải tươi có chứa glucose, pentosan, adenin, arginin, histidin, cholin, trigonellin, diastase… vitamin A, B, C Rễ chứa glucosit enzyme methyl mercaptan Củ cải có vị cay, đắng, tính bình khơng có độc, có tác dụng long ñờm, trừ viêm [1] Nước bị ô nhiễm thủy ngân vấn đề mơi trường quan tâm nghiên cứu độc tính tác động thủy ngân ñối với thủy sinh vật người Trong báo nghiên cứu sử dụng enzyme peroxidase tách chiết từ củ cải trắng ñể xác ñịnh hàm lượng thủy ngân nước ô nhiễm nhằm phát triển phương pháp sinh học dùng enzyme ñể phát ion Hg2+ môi trường, ứng dụng có giá trị loại củ cải trồng phổ biến Việt Nam Enzyme Peroxidase (POD) enzyme có nhiều củ cải trắng loại họ ðậu POD ñược sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực, đặc biệt xử lý mơi trường POD ñược sử dụng ñể xúc tác cho trình xử lý chất nhiễm khó phân hủy phenol thường có mặt nước thải cơng nghiệp nhà Thực nghiệm 2.1 Hóa chất thiết bị nghiên cứu _ ∗ a Hóa chất Tác giả liên hệ ðT: 84-4-5583001 E-mail: tthong@vnu.edu.vn + (NH4)2SO4 tinh khiết 23 24 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 23-27 + Dung dịch Na2 SO3 0,05% + Dung dịch ñệm photphat (pH = 5,7 - 8,0) + Dung dịch chuẩn Casein 0,1% + Chỉ thị Indigocacmin (Ind) 0,1% tủa thu túi xelophan với mơi trường ñệm axetat Na 0,01N Sau 2h lại thay ñổi dung dịch ñệm Na Tiếp tục cho ñến khơng cịn phản ứng NH4+ dung dịch đệm sau q trình thẩm tích kết thúc + Dung dịch H2O2 3% b Thiết bị Máy xay sinh tố Máy li tâm, Ranetki T30 (Nga) Máy ño pH Hanan (ðức) Máy UV - VIS (Labomed, INC) 2.2 Phương pháp chiết dung dịch enzyme Cân 100g củ cải tươi, thái nhỏ, cho vào máy xay sinh tố, thêm 20 ml nước cất, xay nhuyễn thành dung dịch keo ñặc Thêm 100ml dung dịch Na2SO3 0,05%, khuấy ñều, lọc bỏ cặn thơ Sau đó, đem ly tâm dung dịch lọc với tốc độ 3000 vịng/phút vịng 10 phút Thu lấy dịch loại bỏ cặn, xác ñịnh thể tích dung dịch (V) sau ly tâm, ta dung dịch enzyme 2.3 Phương pháp tách enzyme [3] Cân 20g (NH4)2SO4 tinh khiết, hòa tan dần vào 80ml dung dịch enzyme thu ñược cho ñến (NH4)2SO4 tan hết, ta ñược dung dịch enzyme chứa 20% (NH4)2SO4 Sau ñó, ñể lạnh 30 phút ly tâm Thu ñược dịch I kết tủa I Cho thêm (NH4)2SO4 vào dịch I thu ñược ñến nồng ñộ 40%, ñể lạnh 30 phút, li tâm thu ñược dịch II kết tủa II Thêm (NH4 )2SO4 vào dịch II cho ñến nồng ñộ 60%, ñể lạnh 30 phút, li tâm, gạn lấy dịch III kết tủa III Sau kết thúc q trình kết tủa tiến hành xác định hoạt tính POD ñể xem POD tách tốt giai ñoạn Tiến hành thẩm tích kết 2.4 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzyme [4,5] Sử dụng dung dịch enzyme tách nồng độ (NH4)2 SO4 thích hợp ñể xác ñịnh hoạt ñộ enzyme Lấy dãy bình tam giác 100ml, dãy đối chứng dãy thí nghiệm cho vào bình 2ml nước cất, 2ml ñệm photphat (pH = 6,0), thêm 3ml dung dịch enzyme, 1ml thuốc thử Indigocacmin 0,1%, lắc Sau cho 2ml H2O2 3% theo dõi trình màu Indigocacmin tính theo thời gian từ bắt đầu cho H2O2 ñến dung dịch chuyển sang màu vàng xanh 2.5 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng Protein [6] Lấy dãy ống nghiệm 10 ml, sử dụng dung dịch Casein chuẩn (0,01%) pha thành dung dịch có nồng ñộ khác ðo ñộ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn bước sóng 280 nm Dựa vào ñộ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn, xây dựng ñường chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng protein mẫu 2.6 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng Hg2+ [3] Peroxidase xúc tác cho q trình oxy hóa Ind có mặt H2 O2: Ind + H2O2 → Ind + H2O + O2 (màu xanh) (màu vàng) Khi enzyme bị ức chế Hg2+, tốc độ oxy hóa chất nhỏ ñi, thời gian màu dài Như vậy, thời gian màu tỉ lệ thuận với nồng ñộ Hg2+ ức chế enzyme 25 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 23-27 Chuẩn bị dãy bình tam giác 100ml, cho vào bình 10ml dung dịch enzyme, 2ml dung dịch Hg2+ có nồng độ từ 0,5 đến 5mg/l 1ml dung dịch thuốc thử Ind 0,1% lắc Sau đó, cho 2ml H2O2 3% Tiến hành ño mật ñộ quang dãy dung dịch bước sóng 670nm theo dõi q trình màu dãy dung dịch So sánh thời gian màu dãy dung dịch với thời gian màu bình đối chứng m1 = 10 × (0,574 + 0,0251) = 0,0423(mg ) (0,1415 × 1000) Thể tích dung dịch chiết thu ñược từ 200g nguyên liệu 300ml Hàm lượng protein trong 1g nguyên liệu ñược xác ñịnh theo công thức: mprotein = V1 m1 N V2 a Trong đó: Kết V1 : Thể tích dịch chiết thu ñược sau ly tâm; 3.1 Khảo sát hàm lượng protein củ cải trắng V2 : Thể tích mẫu ñem ño m1 : Khối lượng protein V2 ml mẫu ño; Xây dựng ñường chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng protein dịch chiết trình tách enzyme ðồ thị chuẩn ñược xây dựng với dung dịch Casein có nồng độ: 1; 2; 3; 4; 5; mg/l Sử dụng ñồ thị chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng enzyme dịch chiết OD N : Hệ số pha loãng a : Khối lượng nguyên liệu chiết tách ban đầu (g) mprotein = 300 × 0,0423 × 20 = 0,1269(mg / g ) 10 × 200 3.2 Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt ñộ POD y = 0.1415x - 0.0251 R = 0.9971 0.8 Tiến hành xác ñịnh hoạt ñộ enzyme POD mơi trường đệm photphat có pH khác (pH = 5,5 - 8,0) Kết hoạt ñộ POD hình 0.6 0.4 0.2 0 Case in (mg/l) OD 0.8 Hình ðồ thị xác ñịnh hàm lượng protein theo lượng Casein 0.6 Phương trình ñường chuẩn Casein là: y = 0,1415x - 0,0251 0.2 Trong đó: y mật độ quang; x hàm lượng protein Mật ñộ quang dung dịch enzyme mẫu ño ñược y1 = 0,574 Hàm lượng protein 10 ml mẫu phân tích là: 0.4 pH Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt độ POD Qua hình ta thấy, pH tối ưu cho phản ứng xúc tác POD khoảng 6,5 Chúng tiến hành nghiên cứu giá trị pH = 6,5 26 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 3.3 Ảnh hưởng nồng ñộ Hg2+ ñến hoạt ñộ POD ðể ñánh giá ảnh hưởng Hg2+ ñến hoạt ñộ POD, tiến hành phản ứng ức chế với nồng ñộ Hg2+ từ 0,5 - 5,0 mg/l Kết hình Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy: - Hàm lượng protein củ cải 0,1269 mg/g Enzyme POD hoạt ñộng mạnh giá trị pH = 6,5 - Ion Hg2+ ảnh hưởng đến hoạt tính POD, giá trị nồng độ Hg2 mg/l +, enzyme hồn tồn hoạt tính A (%) 100 90 80 70 60 Kết rằng, dùng POD ñể xác ñịnh hàm lượng ion Hg2+ nước ô nhiễm với nồng ñộ 0,5 - 5,0 mg/l 50 40 30 20 10 0 Hg2+ (mg/l) Hình ðồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt ñộ peroxidase vào nồng ñộ Hg2+ Kết phân tích hình cho thấy, hoạt ñộ enzyme (A) tỷ lệ nghịch với hàm lượng ion Hg2+ khoảng nồng ñộ 0,5 5mg/l, nồng độ Hg2+ đạt đến mg/l, enzyme hồn tồn bị hoạt tính (A = 0%) Thử nghiệm xác ñịnh nồng ñộ Hg2+ mẫu nước thải ðể thử nghiệm sử dụng POD xác ñịnh hàm lượng ion Hg2+ nước ô nhiễm, lấy mẫu nước thải chưa qua xử lý Nhà máy khóa Việt Tiệp, tiến hành phản ứng ức chế enzyme POD theo bước tương tự với dung dịch chuẩn Hg2+ Dựa vào thực nghiệm đường chuẩn, chúng tơi tính tốn ñược nồng ñộ Hg2+ mẫu nước thải chưa qua xử lý Nhà máy khóa Việt Tiệp 0.8 mg/l, phù hợp với kết phân tích Bộ mơn Hóa học phân tích, Khoa Hóa học, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên Củ cải trắng nguồn ngun liệu phổ biến, rẻ sẵn có Ngồi ra, hóa chất sử dụng q trình nghiên cứu khơng mang tính chất độc hại Vì vậy, hướng nghiên cứu thân thiện với mơi trường, có giá trị thực tiễn cao, phạm vi áp dụng rộng Cơng trình hồn thành hỗ trợ kinh phí Chương trình Nghiên cứu Khoa học Tự nhiên Tài liệu tham khảo [1] Báo Khoa học Phổ thông 8/2004 [2] Kwang-SooShinI, Young Hwan Kimz, LongSoon Lim3, Purification and Characterization of Manganese Peroxidase, The Journal of Microbiology, Vol 43, No.6 (2005) 503 [3] Trần ðình Toại, ðỗ Ngọc Lanh, Mai Hữu Tuyên, Nguyễn Thị Vân Hải, Nguyễn Thu Hoài, 1998, Nghiên cứu phương pháp sinh học sử dụng enzyme để đánh giá mơi trường bị nhiễm kim loại nặng, Tuyển tập báo cáo khoa học Trung tâm nhiệt ñới Việt - Nga, - sinh thái nhiệt đới cơng nghệ sinh học, 1998, tr.155-167 [4] Nguyễn Văn Mùi, Xác ñịnh hoạt ñộ Enzyme, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 2002 [5] Trần ðình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, ðộng học trình xúc tác sinh học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 2005 [6] Н.П Мешковa; Севeрина С.Е., Практикум по биохимии Издательство Московского Университет, 1979, 87-88 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 27 Study of the application of peroxidase enzyme extracted from white radish in determination of mercury in contaminated water Tran Thi Hong, Tran Hoang Thanh, Nguyen Thi Ha Giang College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam We report the study of the application of peroxidase enzyme (POD) extracted from the white radish in determination of the mercury in contaminated water The results showed that the amount of protein in white radish was 0,1269 mg/g; the activation of POD was achieved at the pH = 6,5 and the concentration of Hg2+ ions that deactivated the POD was mg/l Hg2+ This study is environmentfriendly and has direct application in wide aspects ... xác định hoạt tính POD để xem POD tách tốt giai ñoạn Tiến hành thẩm tích kết 2.4 Phương pháp xác định hoạt ñộ enzyme [4,5] Sử dụng dung dịch enzyme tách ñược nồng ñộ (NH4)2 SO4 thích hợp ñể xác. .. nghiệm xác định nồng độ Hg2+ mẫu nước thải ðể thử nghiệm sử dụng POD xác định hàm lượng ion Hg2+ nước nhiễm, lấy mẫu nước thải chưa qua xử lý Nhà máy khóa Việt Tiệp, tiến hành phản ứng ức chế enzyme. .. 3.1 Khảo sát hàm lượng protein củ cải trắng V2 : Thể tích mẫu đem đo m1 : Khối lượng protein V2 ml mẫu ño; Xây dựng ñường chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng protein dịch chiết trình tách enzyme ðồ thị