ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG Tên đề tài: Đa dạng sinh học vi khuẩn kỵ khí ơxy hóa Fe(II), khử nitrate số mơi trường sinh thái khả ứng dụng chúng Mã số: QG 07 23 Chủ trì đề tài: TS Đinh Thúy Hằng Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN Hà Nội, tháng năm 2010 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẤP DHQG BÁO CÁO TÓM TẮT Tên đề tài: Đa dạng sinh học vi khuẩn kỵ khí ơxy hố Fe(II), khử nitrate trongmột số mơi trường sinh thái khả ứng dụng chúng Mã số: QG.07.23 Thời gian thực hiện: năm (2007 - 2009) Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội Chủ trì đề tài: TS Đinh Thuý Hằng Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - ĐHQGHN Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: dthang@vnu.edu.vn Cán tham gia: CN Nguyễn Thị Tuyền ThS Nguyễn Minh Giảng Mục tiêu nội dung nghiên cứu Mục tiêu: - Nghiên cứu so sánh đa dạng sinh học vi khuẩn ơxy hố Fe2+/khử NO3 số môi - trường sinh thái khác Phân lập nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số loại môi trường sinh thái - nghiên cứu đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá chúng Nghiên cứu khả ứng dụng chủng vi khuẩn phân lập vào việc kết hợp loại bỏ Fe2+, Mn2+, NO3 môi trường ô nhiễm Nội dung nghiên cứu: - Mẫu trầm tích đáy hồ, mẫu đất ruộng lúa ngập nước mẫu trầm tích ven biển lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ơxy), đưa phịng thí nghiệm giữ 4C tiến hành phân tích vi sinh vật - Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II)/khử NO3 xác định theo phương pháp MPN (Most Propable Number) môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử NO3 chất - - - nhận điện tử điều kiện kỵ khí hồn tồn Thành phần khống môi trường đảm bảo tương ứng với môi trường sinh thái địa điểm lấy mẫu Đa dạng thành phần loài mẫu khác xác định thông qua phương pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trực tiếp từ lơ thí nghiệm nồng độ pha loãng khác dãy MPN phân tích tính đa dạng đoạn gen 16S rARN tập đoàn vi sinh vật thu lô phương pháp PCR/DGGE Các chủng vi khuẩn ơxy hố Fe(II)/khử NO3 đại diện, chiếm đa số địa điểm lấy mẫu phân lập từ ống pha lỗng cao có vi sinh vật phát triển dãy MPN phương pháp ống thạch bán lỏng Các chủng vi khuẩn phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hoá phân loại dựa trình tự 16S rDNA Kết nghiên cứu làm sở để tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh học (khả chuyển hóa Fe(II) NO3 ) cao nghiên cứu khả ứng dụng chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3 môi trường ô nhiễm Các kết đạt - Ba dạng mơi trường khác gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước trầm tích ven biển chọn để tiến hành nghiên cứu đa dạng vi khuẩn ơxy hố Fe(II) khử NO3 Đây dạng mơi trường vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hố sắt nitơ đóng vai trị quan trọng Mẫu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) môi trường sinh thái kể thu thập sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí - Số lượng vi khuẩn ơxy hố Fe(II), khử NO3 xác định phương pháp MPN môi trường dịch thể nước (đối với mẫu ao mẫu ruộng lúa) nước lợ (đối với mẫu trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3 làm chất nhận điện tử acetate/CO2 làm nguồn cacbon Sự sinh trưởng vi khuẩn ống MPN nhận biết thông qua thay đổi màu sắc môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu Fe(II) bị ơxy hố thành Fe(III) - DNA tổng số từ ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển tách chiết sử dụng làm khuôn phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA có độ dài 550 bp Phân tích điện di biến tính đoạn gen cho thấy tính đa dạng cao vi khuẩn ống MPN Một số băng điện di đại diện cắt thơi gel để đọc trình tự, qua xác định nhóm vi khuẩn chiếm ưu môi trường nghiên cứu, cụ thể Anaeromyxobacter, Pseudomonas Paracoccus - Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật sinh trưởng điều kiện oxy hố Fe(II) khử NO3 dãy MPN thơng qua phương pháp lai in situ sử dụng đầu dị huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn -, - -Proteobacteria - 12 chủng vi khuẩn kỵ khí phân lập tinh (4 chủng dạng mơi trường sinh thái) Tính đa dạng chủng mặt di truyền xác định thơng qua phân tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA dài 1500 bp sử dụng hai enzyme MspI HaeIII Các chủng đại diện cho nhóm ARDRA giải trình tự để xác định vị trí phân loại cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện - Bằng phương pháp xác định lượng Fe(II) NO3 môi trường nuôi cấy theo thời gian, chủng vi khuẩn IN12 chứng minh có khả chuyển hoá hai hợp chất cao, chủng có tiềm sử dụng lĩnh vực mơi trường Bên cạnh khả sử dụng Mn(II) thay cho Fe(II) nghiên cứu, nhiên chủng IN12 khả ứng dụng để loại bỏ Mn(II) môi trường - Các kết nghiên cứu công bố 02 báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham gia hội nghị sinh thái sinh vật 02 trình tự gen đăng ký GenBank - Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học Tình hình sử dụng kinh phí - Tổng kinh phí đề tài duyệt: - Tổng kinh phí đề tài chi: + Chi phí thuê mướn: + Chi phí nghiệp vụ chun mơn: + Văn phịng phẩm: + Chi khác (lệ phí đơn vị DT): Xác nhận quan 60.000.000 VNĐ 60.027.400, bao gồm mục: 24.000.000 29.522.400 505.000 6.000.000 Chủ trì đề tài Xác nhận Đại học Quốc gia SUMMARY Project title: Diversity of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in some ecological environments and their potential use Code: QG.07.23 Duration: 2007 – 2009 Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH) Project leader: Dr Dinh Thuy Hang Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH Key participants: BSc Nguyen Thi Tuyen MSc Nguyen Minh Giang Objectives and study contents Objectives - Comparatively study biodiversity of Fe(II) oxidizing – nitrate reducing bacteria in some ecological environments in Vietnam - Isolate representative strains that dominate in each environment and study their physiological, and phylogenetic characteristics - Study the application potential of the isolates in elumination of Fe(II), Mn(II) and NO 3 in contaminated water sources Study contents - Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at 4C as the sources for microbiological studies - Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor, NO3 as electron acceptor and trace acetate as corbo source Mineral content of the media would respect to the natural conditions where the samples have been collected - Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series - Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing dilution series in semi-liquid agar tubes - Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study of application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3 in contaminated waters The obtained results - Samples from three ecological environments, namely mud sediment freshwater pond, flooded paddy soil and sediment from estuarine environment were collected for studying Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria These environments are known for significant involvement of bacteria in Fe and nitrogen cycles Samples at 10 cm depth below the sediment surface were used for this study - Number of Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method carried out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine environment) These media contained Fe(II) as electron donor, NO3 as electron acceptor and trace acetate as carbon source Growth of bacteria in the MPN series was recognized by colour changing in the media, from white (FeII precipitation) to dark brown (FeIII precipitation) - Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments to amplify 550 bp fragments of the V3 region of the 16S rDNA and used for analyzing diversity of bacteria in the communities with DGGE method Most prominent DGGE bands were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the respective baterial groups - Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the -, - and -Proteobacteria - 12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment) Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of 16S rDNA with two endonucleases MspI and HaeIII 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic affiliation of the ARDRA groups - Quantitative analyzes of the amount of Fe(II) and NO3 in growth media of the isolated strains allowed to select strain IN12 as a candidate for application for simultaneous elimination of Fe(II) and NO3 in contaminated waters Besides that, the ability of strain IN12 in oxidation of Mn(II) with nitrate was also studied, however it was revealed that tis strain did not growth with Mn(II) as electron donor for nitrate reduction Xác nhận quan Chủ trì đề tài Xác nhận Đại học Quốc gia ... tài: Đa dạng sinh học vi khuẩn kỵ khí ôxy hoá Fe( II) , khử nitrate trongmột số môi trường sinh thái khả ứng dụng chúng Mã số: QG.07.23 Thời gian thực hiện: năm (2007 - 2009) Cấp quản lý: Đại học. .. sánh đa dạng sinh học vi khuẩn ơxy hố Fe2 + /khử NO3 số môi - trường sinh thái khác Phân lập nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số loại môi trường sinh thái - nghiên cứu đặc điểm phân loại, sinh. .. cứu đa dạng vi khuẩn ôxy hố Fe( II) khử NO3 Đây dạng mơi trường vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hố sắt nitơ đóng vai trị quan trọng Mẫu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) môi trường sinh thái