Đa dạng vi khuẩn oxy hóa Fe(II) khử NO3- tại một số môi trường sinh thái ở Việt Nam

Header Page of 120 ĐA DẠNG VI KHUẨN OXY HĨA Fe(II), KHỬ NO3 TẠI MỘT SỐ MƠI TRƢỜNG SINH THÁI Ở VIỆT NAM Nguyễn Thị Tuyền1, Đinh Thúy Hằng2 Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Viện vi sinh vật công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội TÓM TẮT Vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 mẫu bùn thu thập thủy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước vùng nước lợ ven biển nghiên cứu số lượng tính đa dạng thành phần lồi Kết thí nghiệm MPN cho thấy ba dạng môi trường nghiên cứu, mẫu bùn chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn cao (9,3  103 TB/g), gấp lần mẫu bùn thủy vực nước lần so với mẫu bùn ven biển Dựa khác biệt hình thái khuẩn lạc,12 chủng đơn phân lập từ mẫu MPN khác Theo kết phân tích ARDRA sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII MspI, chủng xếp vào nhóm di truyền khác nhau, chứng tỏ tính đa dạng cao vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 mơi trường nghiên cứu Phân tích thành phần lồi quần thể độ pha lỗng tới hạn dãy MPN phương pháp PCRDGGE gen 16S rDNA cho thấy Anaeromyxobacter sp có mặt ba dạng môi trường sinh thái Kết hợp với nghiên cứu chủng đơn phân lập từ dạng mơi trường nghiên cứu cho thấy nhóm Paracoccus Pseudomonas hai nhóm vi khuẩn thực q trình oxy hố Fe(II), khử NO3, tương ứng đóng vai trò quan trọng mơi trường ao nước chân ruộng ngập nước Giải trình tự gen 16S rDNA so sánh kết với ngân hàng liệu ba chủng đại diện IN2, IN7 IN12 cho phép xếp chủng tương ứng vào chi vi khuẩn Anaeromyxobacter, Pseudomonas Paracoccus Ba chi vi khuẩn kể nhóm chiếm ưu chu trình chuyển hố sắt ba dạng môi trường sinh thái nghiên cứu Từ khóa: Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3, MPN, DGGE, ARDRA, Anaeromyxobacter, Paracoccus, Pseudomonas luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 MỞ ĐẦU Sắt kim loại phổ biến trái đất Thông thường sắt tồn dạng oxid Fe(III) tan nước có màu vàng nâu Trong mơi trường pH trung tính, dạng hòa tan nước (Fe(II)) tồn điều kiện khơng có oxy, ví dụ đáy thủy vực, nơi oxy hòa tan nước bị vi sinh vật hiếu khí sử dụng để phân hủy hợp chất hữu Với hiệu điện oxy hóa khử Fe3+/Fe2+ pH vào khoảng +200 mV, ion Fe(II) trở thành nguồn điện tử cho trình hơ hấp kỵ khí, điển hình khử NO3 thành N2 số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Benz et al., 1998) Q trình oxy hóa Fe(II) NO3 diễn sau: 10 Fe2+ + NO3 + 24 H2O → 10 Fe(OH)3 ↓ + N2 ↑ + H2 ↑ Trong tự nhiên, q trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử NO3 chủ yếu diễn ranh giới hiếu khí (có oxy) kỵ khí (khơng có oxy) lớp trầm tích đáy thủy vực Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử NO3 đóng vai trò quan trọng môi trường ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) NO3 cao (do chất hữu bị phân hủy tạo thành) (Weber et al., 2006) Các loài vi khuẩn với khả tiến hành phản ứng oxy hóa khử lúc thực hai nhiệm vụ, thứ chuyển Fe(II) hòa tan nước dạng Fe(III) kết tủa, hai loại bỏ NO3, chuyển thành dạng N2 Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử NO3 phân lập từ lớp trầm tích ao, hồ nước Bremen, Đức năm 1996 (Straub et al., 1996) Một số cơng trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy có mặt phổ biển nhóm vi khuẩn với mật độ cao (106 tế bào/g trầm tích) điều kiện mơi trường khác nhau, bao gồm nước ngọt, nước lợ nước mặn nhiều vị trí địa lý khác giới (Straub, Buchholz, 1998) Các loài vi khuẩn phổ biến nhóm biết đến loài thuộc chi Chromobacterium Klebsiella (Benz et al., 1998; Weber et al., 2006) Các nghiên cứu giới đưa kết khảo sát nhóm vi khuẩn châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nước ta Trong nghiên cứu tiến hành tìm hiểu tính đa dạng vi khuẩn khử NO3 sử dụng Fe(II) nguồn điện tử số môi trường sinh thái đại diện Việt Nam luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phƣơng pháp thu mẫu Mẫu thu thập ba môi trường sinh thái đại diện khác nhau: mẫu bùn đáy ao nước chân ruộng ngập nước thu ngoại thành Hà Nội, mẫu trầm tích nước lợ thu ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh Mẫu thu thập ống thủy tinh nút xoáy với tồn thể tích bình để giảm thiểu ảnh hưởng oxy khơng khí tới quần thể vi sinh vật mẫu Mẫu bảo quản nhiệt độ 4C tiến hành thí nghiệm Xác định số lƣợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phƣơng pháp MPN Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 xác định theo phương pháp MPN (Most Propable Number, American Public Health Association, 1969) với thể tích 10% bùn đáy trầm tích mơi trường khoáng dịch thể chứa NaNO3 (5 mM), FeSO4 (10 mM) làm chất nhận chất cho điện tử Môi trường dịch thể kỵ khí hồn tồn có thành phần khống tương ứng với nước (dùng cho mẫu từ ao tù chân ruộng ngập nước) nước lợ (dùng cho mẫu lấy từ Vân Đồn - Quảng Ninh) chuẩn bị theo phương pháp Widdel Bak (1992) mơ tả Dãy pha lỗng thực đến độ pha loãng 10-8, mẫu ủ tủ ấm 28C tuần Phân lập vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phƣơng pháp ống thạch bán lỏng Ống MPN nồng độ pha lỗng cao có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phát triển sử dụng làm nguồn phân lập khuẩn lạc đơn Việc phân lập tiến hành theo phương pháp pha loãng dãy ống thạch bán lỏng (1%) (Widdel, Bak, 1992) với mơi trường có thành phần tương tự môi trường dùng phương pháp MPN Ống thạch bán lỏng sau bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) sục khí N2 ủ tư đảo ngược đầu 28C bóng tối Khuẩn lạc đơn phát triển ống pha loãng tách pippet Pasteur chuyển sang mơi trường dịch thể thích hợp (nước hay nước lợ) luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Xác định hàm lƣợng Fe(II) NO3 môi trƣờng nuôi cấy Mẫu vi sinh vật oxy hố Fe(II), khử NO3 ni cấy mơi trường kỵ khí dạng dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) NO3 (5 mM) bình serum đậy kín nút cao su Mẫu dịch nuôi cấy (1 ml) thu sau 24 h để xác định nồng độ Fe(II) NO3 Nồng độ Fe(II) xác định phương pháp so màu bước sóng 510 nm, sử dụng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406-E1-1, 1983) Nồng độ NO3 xác định phương pháp so màu bước sóng 410 nm, sử dụng thuốc thử axit desulfofemic (Lê Đức, 2004) Tách DNA tổng số DNA tổng số quần thể vi sinh vật từ ống MPN tách chiết theo phương pháp Zhou đồng tác giả (1996) mô tả với cải biến nồng độ đệm phosphate nồng độ proteinase K DNA genome chủng đơn tách theo phương pháp Marmur (1961) DNA sau tách chiết hoà tan nước bảo quản 20C cho thí nghiệm Phân tích đa dạng chủng đơn phƣơng pháp ARDRA ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) phương pháp thường sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền vi sinh vật dựa phân tích kết xử lý gen 16S rDNA enzyme giới hạn Gen 16S rDNA chủng đơn sau khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) xử lý hai enzyme giới hạn MspI HaeIII (Fermentas) Sản phẩm DNA sau xử lý enzyme phân tách điện di gel agarose 2% 100 V thời gian 30 phút Các chủng vi khuẩn xếp nhóm dựa tương đồng phổ băng điện di Phân tích cấu trúc quần thể phƣơng pháp điện di biến tính (DGGE) Đoạn gen 16S rDNA với độ dài 550 bp khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer et al., 1993) Để tạo tính ổn định cho việc phân tách trình tự luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 DNA gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp gắn vào đầu 5’ mồi GM5F Điện di tiến hành gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60% Quá trình điện di thực điện di DcodeTM System (BioRad) nhiệt độ 60C 200 V 3,5 h Sau điện di, gel polyacrylamide nhuộm dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) 30 phút, sau rửa nước chụp ảnh tia UV máy GelDoc (BioRad) Băng điện di cắt DNA nước qua đêm 4C, sau dùng làm khn để thực phản ứng PCR với cặp mồi GM5F, 907R Sản phẩm PCR tinh giải trình tự Giải trình tự gen 16S rDNA Gen 16S rDNA chủng đơn sản phẩm PCR từ băng điện di biến tính tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit đọc trình tự máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems Trình tự gen sau phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA lồi có liên quan cơng bố Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), định dạng tiến hành dựa 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định số lƣợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 mơi trƣờng nghiên cứu Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 mẫu bùn đáy thu thập môi trường sinh thái khác xác định thông qua phương pháp MPN sử dụng môi trường dịch thể chứa FeSO4 làm chất cho điện tử NaNO3 làm chất nhận điện tử cuối Thành phần khống mơi trường tương ứng với điều kiện nước (đối với mẫu bùn đáy ao chân ruộng ngập nước) nước lợ (đối với mẫu bùn ven biển) Sự phát triển vi sinh vật sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(II) ống MPN nhận biết thông qua biến đổi màu sắc môi trường từ trắng xanh (màu Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu Fe(III)) (hình 1a) luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Kết thí nghiệm MPN (hình 1b) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 cao mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 x 103 tế bào/g bùn), cao hẳn so với mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 x 103 tế bào/g trầm tích) mẫu bùn đáy ao nước (1,5 x 103 tế bào/g bùn) Mật độ mối tương quan số lượng vi khuẩn oxy hố Fe(II), khử NO3 với điều kiện mơi trường vùng sinh thái tìm thấy số nghiên cứu trước Ratering (1999) nghiên cứu chu trình chuyển hố sắt đất trồng lúa Ý phát nồng độ ion sắt môi trường cao lồi tham gia chu trình chuyển hố sắt đóng vai trò quan trọng chu trình chuyển hố vật chất Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 nhiều vùng khác giới dao động khoảng từ  103 đến  108 tế bào/g mẫu khô (Weber et al., 2006; Ratering, Schnell, 2000; Hauck et al., 2001; Straub et al., 1996) -1 Số lượng tế bào (×10 · g ) 10.5 7.5 4.5 1.5 (a) (b) Mẫu bùn đáy ao Mẫu bùn đáy Mẫu trầm tích nước chân ruộng ngập nước lợ ven biển nước Hình Xác định số lƣợng vi khuẩn oxy hố Fe(II), khử NO3 mơi trƣờng sinh thái khác (a) - Nhận biết có mặt vi khuẩn ống MPN thông qua biến đổi màu sắc môi trường từ trắng xanh (FeII) sang vàng nâu (FeIII) (b) - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 xác định thơng qua phương pháp MPN luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Phân tích cấu trúc quần thể điện di biến tính DGGE Để xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 chiếm ưu môi trường nghiên cứu, tiến hành phân tích cấu trúc quần thể ống MPN độ pha loãng 103 (là nồng độ gần tới hạn dãy MPN mẫu) phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 2) Các băng điện di cắt từ gel sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp sau để xác định trình tự so sánh với trình tự gen 16S rDNA công bố ngân hàng liệu GeneBank A R B Pseudomonas sp Anaeromyxobacter sp Hình Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn gen 16S rDNA quần thể vi sinh vật ống MPN mẫu nghiên cứu A – Bùn ao nước ngọt; R – Bùn chân ruộng ngập nước; B – Bùn trầm tích ven biển Có thể thấy lồi Anaeromyxobacter có mặt dạng mơi trường nghiên cứu Đây nhóm vi khuẩn nằm phân lớp -Proteobacteria, có lồi cơng bố A dehalogenans với số đại diện chưa định danh đến loài Các chủng Anaeromyxobacter công bố sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III), chưa có chủng nghiên cứu khả sinh trưởng khử NO3, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude et al., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996) Trong môi trường nuôi cấy sử dụng (cũng điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn với Fe(II) kết chuyển hoá Fe(II) đường hoá học (phản ứng với lượng nhỏ oxy môi trường) đường sinh học (do vi sinh vật oxy hố Fe(II), khử NO3) Do vậy, có mặt lồi sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Anaeromyxobacter điều kiện môi trường nghiên cứu (cũng tự nhiên) mắt xích khép kín chu trình chuyển hố sắt Nhóm vi khuẩn Pseudomonas chiếm ưu mẫu bùn chân ruộng ngập nước Đây chi thuộc phân lớp -proteobacteria, có nhiều đại diện sinh trưởng kỵ khí khử NO3, bao gồm lồi có khả sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Weber et al., 2006; Ratering, Schnell, 2000; Schlafleigh, 2000) Đối với mẫu bùn ao trầm tích ven biển, phương pháp PCR-DGGE thực chúng tơi chưa xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử NO3 chiếm ưu Tuy nhiên thông tin vấn đề bổ sung tiến hành nghiên cứu đa dạng chủng đơn phân lập từ môi trường kể Mức độ oxy hoá Fe(II) khử NO3 vi sinh vật mẫu nghiên cứu Nồng độ Fe(II) NO3 môi trường nuôi cấy xác định theo thời gian để đánh giá khả sinh trưởng vi sinh vật mẫu làm giàu (hình 3) 3.5 (B) (A) Nitrate (mM) Fe (II) (mM) 2.5 1.5 1 Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình Hoạt tính oxy hố Fe(II) (A) khử NO3 (B) quần thể vi sinh vật ba môi trƣờng nghiên cứu sau làm giàu phƣơng pháp MPN Ký hiệu:  đối chứng khơng có VSV;  mẫu bùn đáy ao nước ngọt; mẫu bùn chân ruộng ngập nước;  mẫu trầm tích nước lợ ven biển luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page of 120 Như quần thể vi sinh vật làm giàu qua dãy MPN thể khả sinh trưởng với Fe(II) NO3 cao Ở mẫu, lượng nitrate mơi trường bị khử gần hồn tồn sau ngày (hình 3B), nhiên lượng Fe(II) khơng giảm tương ứng (hình 3A) Hiện tượng lý giải có mặt nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter mẫu phân tích, làm chuyển hoá Fe(III) thành Fe(II) Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 từ mẫu nghiên cứu đánh giá tính đa dạng chủng phân lập Bảng Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phân lập đƣợc từ môi trƣờng nghiên cứu Nguồn phân lập Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Chủng vi khuẩn IN1 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 1-2 mm IN2 Hình tròn, bề mặt khơng nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm IN3 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,25-0,5 mm IN4 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 1-2 mm IN5 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,25 mm Trầm tích nước lợ IN6 Hình bầu dục, bề mặt nhẵn, kích thước 0,25-0,5 mm biển (Vân Đồn, IN7 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,8 mm Chân ruộng lúa ngập nước (ngoại thành Hà Nội) Quảng Ninh) IN8 Đáy ao nước Hình tròn tia, mật độ tế bào ngồi phía trong, kích thước 1-1,5 mm IN9 Hình tròn, bề mặt xù xì, kích thước 0,5-1 mm IN10 Hình tròn khơng đều, kích thước 0,5-1 mm IN11 Hình tròn, bề mặt nhẵn, kích thước 0,2-0,3 mm IN12 Hình đĩa lồi hai mặt, kích thước 2-2,5 mm (ngoại thành Hà Nội) Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phân lập theo phương pháp pha loãng dãy ống thạch bán lỏng (1%) (Widdel, Bak, 1992) (hình 4a) Các khuẩn lạc đơn phân lập dựa khác hình dạng, kích thước khuẩn lạc Mỗi khuẩn lạc tách luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page of 120 Header Page 10 of 120 riêng ni cấy kỵ khí mơi trường dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) NO3 (5 mM) bình serum có nút cao su kẹp nhơm (hình 4b) 12 khuẩn lạc đơn phân lập từ ống MPN độ pha lỗng cao có vi sinh vật phát triển (bảng 1) đại diện cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 chiếm đa số ba mơi trường nghiên cứu (a) (b) Hình Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 đại diện môi trƣờg nghiên cứu (a) Phân lập chủng đơn thông qua phương pháp ống thạch kỵ khí bán lỏng; (b) Ni cấy chủng đơn vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 mơi trường dịch thể điều kiện kỵ khí hồn tồn Tính đa dạng 12 chủng vi khuẩn phân lập phân tích phương pháp ARDRA sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII MspI (hình 5) IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 M IN1 IN2 IN3 IN4 IN5 IN6 IN7 IN8 IN9 IN10 IN11 IN12 HaeIII MspI Hình Phổ điện di gen 16S rDNA 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 sau xử lý enzyme giới hạn HaeIII MspI IN1 – IN12: Ký hiệu 12 chủng đơn phân lập từ mẫu nghiên cứu; M: Marker kb (Enzynomics, Hàn quốc) Kết thu cho thấy chủng xếp vào nhóm di truyền khác (bảng 2) Từ kết phân nhóm bảng kết hợp với nguồn gốc phân lập 12 chủng (bảng 1), nhận thấy tính đa dạng di truyền 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 10 of 120 10 Header Page 11 of 120 khử NO3 phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu ban đầu Mẫu trầm tích nước lợ ven biến thể mức độ đa dạng di truyền cao với chủng phân lập từ mẫu (IN5, IN6, IN7, IN8) thuộc vào nhóm khác (nhóm 2, nhóm 3, nhóm nhóm 5) Tiếp đến mẫu bùn đáy ao nước với chủng (IN9, IN10, IN11, IN12) thuộc vào nhóm khác (nhóm 1, nhóm nhóm 4) Thể tính đa dạng di truyền thấp mẫu bùn chân ruộng ngập nước với chủng (IN1, IN2, IN3, IN4) thuộc vào nhóm khác (nhóm nhóm 2) Bảng Tính đa dạng di truyền 12 chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phân lập (IN1 – IN12) dựa phân tích ARDRA Nhóm ARDRA Các đoạn DNA tạo sau xử lý gen 16S rDNA enzyme giới hạn (bp) Chủng vi khuẩn HaeIII MspI IN1, IN2, IN4, IN11 200, 300 300, 500 IN3, IN8 200, 300 500 IN5, IN9 200, 300 500, 800 IN6, IN10, IN12 200, 300, 500 IN7 200, 300, 500 900 500 Ba chủng IN2, IN7 IN12 đại diện cho nguồn phân lập đại diện cho nhóm ARDRA (bảng 2, tên chủng in đậm) lựa chọn để tiến hành phân tích trình tự đầy đủ gen 16S rDNA định danh khoa học Chủng IN2 đại diện cho nhóm ARDRA-1 gồm chủng từ hai dạng môi trường nước ngọt, chiếm 30% tổng số chủng phân lập Tương tự, chủng IN12 đại diện cho nhóm ARDRA-4 gồm chủng từ môi trường nước lợ ao nước ngọt, chiếm 25% tổng số chủng phân lập Chủng IN7 làm thành nhóm riêng biệt (ARDRA-5), tìm thấy mơi trường nước lợ ven biển Kết so sánh trình tự 16S rDNA chủng với ngân hàng liệu GenBank cho thấy chủng IN2 có độ tương đồng cao với Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), chủng IN7 với Pseudomonas stutzeri (98%) chủng IN12 với Paracoccus ferooxydant (97%) (hình 6) luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 11 of 120 11 Header Page 12 of 120 Như nhóm ARDRA-4 với chủng IN12 làm đại diện lồi Paracoccus tìm thấy hai dạng môi trường nước lợ ven biển ao nước Paracoccus chi vi khuẩn nằm phân lớp -proteobacteria, gồm lồi sinh trưởng kỵ khí tuỳ tiện, hô hấp nitrate oxy (Schapleigh, 2000) Kết hợp với kết phân tích PCRDGGE thấy Paracoccus Pseudomonas hai nhóm oxy hoá Fe(II) khử NO3 chiếm ưu ba dạng mơi trường nghiên cứu, Paracoccus có vai trò quan trọng ao nước Pseudomonas ruộng ngập nước Đại diện hai nhóm tìm thấy mơi trường nước lợ ven biển, ảnh hưởng nguồn nước từ đất liền Hình Cây phân loại thể mối liên quan chủng IN2, IN7, IN12 lồi gần gũi dựa trình tự gen 16S rDNA Cây dựng theo phương pháp neighbor-joining, đơn vị = 0,02 Knuc trình tự nucleotide Các số hiển thị vị trí phân nhánh kết phân tích bootstrap 1000 phép so sánh (chỉ có giá trị 50% trình bày hình) B subtilis lồi vi khuẩn chọn làm outgroup Dựa kết so sánh trình tự gen 16S rDNA trên, chủng IN2, IN7 IN12 định danh Anaeromyxobacter sp IN2, Pseudomonas sp IN7 Paracoccus sp IN12 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 12 of 120 12 Header Page 13 of 120 KẾT LUẬN Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 mẫu bùn thu thập thủy vực nước ngọt, chân ruộng ngập nước vùng nước lợ ven biển xác định nằm khoảng 103 – 104 TB/g, mẫu bùn chân ruộng ngập nước có số lượng tế bào vi khuẩn cao (9,3  103 TB/g) Vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử NO3 mơi trường nghiên cứu có tính đa dạng cao Mười hai chủng đơn phân lập từ mẫu MPN xếp vào nhóm ARDRA khác phân tích sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII MspI Phân tích thành phân lồi phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA cho thấy Anaeromyxobacter nhóm chiếm ưu có mặt ba dạng mơi trường sinh thái trên, đóng vai trò khép kín chu trình chuyển hố sắt môi trường nghiên cứu thông qua khả sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) Kết hợp với kết nghiên cứu chủng đơn phân lập từ dạng môi trường nghiên cứu cho thấy Paracoccus Pseudomonas hai nhóm vi khuẩn thực q trình oxy hố Fe(II), khử NO3, tương ứng đóng vai trò quan trọng mơi trường ao nước chân ruộng ngập nước Ba chủng đại diện IN2, IN7 IN12 có trình tự gen 16S rDNA có độ tương đồng cao với loài vi khuẩn Anaeromyxobacter dehalogenans (99%), Pseudomonas stutzeri (97%) Paracoccus ferrooxydant (98%), đặt tên Anaeromyxobacter sp IN2, Pseudomonas sp IN7 Paracoccus sp IN12 Hai chủng IN2 IN7 chủng vi khuẩn có tiềm ứng dụng việc xử lý nguồn nước ngầm nhiễm sắt nitrate LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thực nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài QG.07.26 Tác giả xin trân trọng cảm ơn Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQGHN tạo điều kiện trình thực đề tài luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 13 of 120 13 Header Page 14 of 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO American public health association (1969) Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge 604-609 Benz M, Brune A, Schink B (1998) Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria Arch Microbiol 169: 159-165 DIN 38406-E1-1 (1983) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge; cation (group E); determination of iron (E1) Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap Evolution 39, 783–791 Hauck S, Benz M, Brune A, Schink B (2001) Ferrous iron oxidation by denitrifying bacteria in profundal sediments of a deep lake (Lake Constance) FEMS Microbiol Ecol 37: 127-134 Lê Đức (2004) Một số phương pháp phân tích mơi trường NXB ĐHQGHN Marmur J (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms J Mol Biol 3: 208-218 Muyzer G, De Waal EC, Utterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rARN Appl Environ Microbiol 59: 695-700 Ratering S (1999) Iron cycle in italian rice field soil: localization of the redox processes and charactarization of the involved microorganisms PhD Dissertation Department of Microbiology, University of Marburg (Germany) Ratering S, Schnell S (2000) Nitrate-dependent iron(II) oxidation in paddy soil Environ Microbiol 3: 100-109 Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4: 406-425 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 14 of 120 14 Header Page 15 of 120 Shapleigh JP (2000) The Denitrifying Prokaryotes In Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackerbrandt E, eds The prokaryotes: an evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York Straub KL, Benz M, Schink B, Widdel F (1996) Anaerobic, nitrate-dependent microbial oxidation of ferrous iron Appl Environ Microbiol 62: 1458-1460 Straub KL, Buchholz-Cleven BEE (1998) Enumeration and detection of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria from diverse European sediments Appl Environ Microbiol 64: 4846-4856 Treude N, Rosencrantz D, Liesack W, Schnell S (2003) Strain FAc12, a dissimilatory ironreducing member of the Anaeromyxobacter subgroup of Myxococcales FEMS Microbiol Ecol 44: 261-269 Weber KA, Urrutia MM, Churchill PF, Kukkadapu RK, Roden EE (2006) Anaerobic redox cycling of iron by freshwater sediment microorganisms Environ Microbiol 8: 100-113 Widdel F, Bak F (1992) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria In Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH eds The Prokaryotes, 2nd ed Springer, Berlin Heidelberg New York: 3352-3378 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition Appl Environ Microbiol, 62: 316-322 DIVERSITY OF ANAEROBIC Fe(II) -OXIDIZING, NO3-REDUCING BACTERIA IN SOME ECOLOGICAL ENVIRONMENTS IN VIETNAM Nguyen Thi Tuyen1, Dinh Thuy Hang2* University of Natural Sciences, VNUH Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH * Corresponding author: Tel +84 37547694 luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 15 of 120 E-mail: dthang@vnu.edu.vn 15 Header Page 16 of 120 SUMMARY Fe(II)-oxydizing, NO3-reducing bacteria in sediment samples collected from freshwater aquifer, flooded paddy soil and estuarine area were quantified and analysed on species composition The MPN results showed that among the three studied environments, flooded paddy soil had the highest number of these bacteria (9.3  103g1), five and two times higher than that of freshwater aquifer and estuarine sediment, respectively Based on distinguish colony characteristics, 12 strains of Fe(II)-oxidizing, NO3-reduing bacteria were isolated from MPN series and were set into five genetically different groups as proposed by ARDRA analyses with two restricition enzymes HaeIII and MspI, showing relatively high diversity of this bacterial group in the studied environments Analysing species composition in the communities developed in MPN tubes at the highest dilution via PCR-DGGE of 16S rDNA revealed that Anaeromyxobacter species presented in all three above environments In combination with the culture-dependent studies, it was revealed that Paracoccus and Pseudomonas were dominant groups playing important roles in freshwater aquifer and flooded paddy soil, respectively Sequencing of 16S rDNA from three representative strains IN2, IN7 and IN12 suggested that they are respectively belonged to Anaeromyxobacter, Pseudomonas and Paracoccus genera Keywords: Fe(II)-oxidizing, NO3-reducing bacteria, MPN, DGGE, ARDRA, Anaeromyxobacter, Paracoccus, Pseudomonas luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 16 of 120 16 ... hưởng oxy khơng khí tới quần thể vi sinh vật mẫu Mẫu bảo quản nhiệt độ 4C tiến hành thí nghiệm Xác định số lƣợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 phƣơng pháp MPN Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), ... nhóm vi khuẩn châu Âu với điều kiện sinh thái hoàn toàn khác biệt với nước ta Trong nghiên cứu tiến hành tìm hiểu tính đa dạng vi khuẩn khử NO3 sử dụng Fe(II) nguồn điện tử số môi trường sinh thái. .. định dạng tiến hành dựa 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định số lƣợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3 mơi trƣờng nghiên cứu Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II),