Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II Hà Nội - 2015 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA PHỤ GIA THựC PHẨM: AMARANTH, TARTRAZINE VÀ MONOSODIUM GLUTAMATE TRÊN DỊNG TẾ BÀO HEK293 Pham ThiH ịe \ Hoàng Thị Mỹ Hạnh \ Bùi Thị Vân Khánh ỉ Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Lai Thành ỉ ' Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội TÓM TẮT Phụ gia thực phẩm nhóm chất thơng dụng ngày sử dụng phổ biến, dễ dàng tiếp xúc với người Mơ hình in vìíro sử dụng dịng tế bào để xác định độc tính hóa chất mơ hình hiệu áp dụng rộng rãi Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá độc tính chất phụ gia cho phép sử dụng amaranth (E123), tartrazine (E102) monosodium glutamate (E621) lên dịng tế bào thận phơi người HEK293, đồng thời tiến hành so sánh độc tính chất với íormaldehyde (E240) chất bảo quản bị cấm sử dụng Chúng xây dựng đường cong đáp ứng liều xác định giá trị IC50 E123, E102, E621, E240 0,38 mg/ml; 3,58 mg/ml; 0,78 mg/ml; 0,63.10'^ mg/ml Các giá trị IC50 cho thấy chất phụ gia độc nhiều so với formaldehyde có ảnh hưởng định đến tế bào HEK293 độc tính E 123 cao Từ khóa; phụ gia thực phẩm, độc tính, HEK293, tế bào EVALUATION OF TOXICITY OF FOOD ADDITIVES: AMARANTH, TARTRAZINE, MONOSODIUM GLUTAMATE ON HEK293 CELL LINE SUMMARY Food additives are widely used in day life and easily penetrate into body In this study, we applied the cell-based toxicity test, the common essay used in in vitro toxicology, to evaluate the toxicity of three food additives that consist of amaranth (E123), tartrazine (E102), monosodium glutamate (E621), on human embryonic kidney cell line - HEK293 and compare with Pormaldehyde (E240) - a banned preservative IC50 values of E123, E102, E62I, E240 are 0.38, 3.58, 0.78, 0.63x10'^ mg/ml, respectively Although there are significant gaps between the toxicity of formaldehyde and three tested substances that clearly showed in the IC50 values; these food additives, however, still have some certain iníluences on HEK293 cell line and E123 is the strongest one 45 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi ẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Keyword: food additives, toxicity, HEK293, cells ĐẶT VÁN ĐÈ Cùng vód phát triển cơng nghiệp hóa chất công nghiệp thực phẩm gia tăng nhanh chóng số lượng chủng loại chất phụ gia thực phẩm, ủ y ban phụ gia thực phẩm JECFA (Joint PAOAVHO Expert Committee on Food Additives) ước tính có 1500 loại phụ gia thực phẩm Bên cạnh nhíĩng lợi ích, phụ gia thực phẩm tiềm ẩn nguy gây hại cho sức khỏe người Sử dụng liều gây ngộ độc cấp tính ngộ độc mãn tính sử dụng với lượng nhỏ thưòmg xuyên liên tục lâu dài Một số phụ gia thực phẩm tích lũy thể gây tổn thương vĩnh viễn Cũng có nguy hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, gây quái thai [5, 6] Một mơ hình sử dụng rộng rãi để đánh giá độc tính chất mơ hình thử độc in vitro Mơ hình phù hợp cho thí nghiệm kiểm tra số lượng lớn hóa chất thời gian ngắn Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu dựa mơ hình nhằm đánh giá độc tính chất phụ gia thực phẩm amaranth (E123), tartrazine (E102), monosodium glutamate (E621) dòng tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney 293-HEK293); đồng thời so sánh độc tính nhóm chất với formaldehyde (E240) chất bảo quản bị cấm sử dụng ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Dòng tế bào thận phôi người HEK293 HEK293 sử dụng mô hình nghiên cứu hiệu sinh học tế bào nói chung thử độc in vitro nói riêng [1, 7] Bởi vì, dịng tế bào người thương mại hóa với ưu điểm: có thời gian tăng sinh ngắn, tốc độ tăng sinh nhanh dễ ni cấy Bên cạnh đó, HEK293 cịn dùng sản xuất vector virus, vắc - xin protein tái tổ hợp [3] Tế bào HEK293 cung cấp Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm - Bộ môn Sinh học Tế bào - Khoa Sinh học - Trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội 2.1.2 Các chất phụ gia thực phẩm: Amaranth (£123), Tartrazine (E102), Monosodium Glutamate (E621) E123, E102, E621 nhóm chất phụ gia sử dụng phổ biến E 123 E 102 chất tạo màu, E621 chất điều vị 46 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Pormaldehyde (E240) - chất bảo quản bị cấm sử dụng dùng làm chất so sánh độc tính với nhóm chất Các hóa chất thử nghiệm cung cấp hãng Sigma 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy tế bào HEK293 Tế bào HEK293 nuôi frong mơi trường Opti-MEM® (Gibco) có bổ sung 5% (v/v) FBS (Gibco), lOOU/ml Penicillin (Gibco), lOO^g/ml Streptomycin (Gibco) điều kiện độ ẩm 90%, 5% C ,3T C Hình thái tế bào kiểm tra kính hiển vi soi ngược 2.2.2 Phutrag pháp đánh giá độc tính Tế bào phơi nhiễm với hóa chất thử nghiệm có dải nồng độ bảng Mỗi nồng độ lặp lại ba lần, formaldehyde sử dụng làm chất so sánh Sau 48 phơi nhiễm, đáp ứng tế bào với chất thử đánh giá thông qua phương pháp ATP Bioluminescence Phương pháp dựa ữên phản ứng biến đổi luciferin thành oxyluciferin xúc tác bời enzyme luciferase với có mặt ion ATP cho tín hiệu huỳnh quang [4] Cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với số tế bào có khả thực chức [2] Mật độ quang học dung dịch ừong giếng đo bàng thiết bị đo tín hiệu huỳnh quang đa bước sóng 500 nm Bảng 2.1 Dải nồng độ hóa chất thử nghiệm Tên hóa Đơn chất vị E123 mg/ml 0,05 0,1 0,5 2,5 10 15 20 E102 mg/ml I 10 15 20 25 50 75 E621 mg/ml 0,1 0,25 0,5 2,5 7,5 15 E240 ppm 0,04 0,4 40 Dải nồng độ 0,004 4C10 2.2.3 Phân tích thống kê Dữ liệu phân tích xử lý phần mềm GraphPad Prism 5, từ tính giá trị nồng độ hóa chất gây ức chế 50% tổng số tế bào (IC50) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Sau 48 phơi nhiễm với hóa chất, hình thái tế bào HEK293 kiểm tra kính hiển vi soi ngược Các chất thừ làm tế bào co lại, thay đổi hình dạng đặc trưng, làm giảm khả bám dính dẫn đến suy giảm khả sống tể bào (Hình 3.1) 47 Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội-2015 Te bào HEK bình thường có hình dạng đặc trưng hình thoi dài dẹt Hình thái bảo tồn phơi nhiễm tế bào với hóa chất nồng độ thấp E123 0,05 mg/ml; E102 Img/ml; E621 0,1 mg/ml xế bào bắt đầu hình dạng đặc trưng, có tượng bị co lại tượng gia tăng nồng độ hóa chất tăng dần Thậm chí, tế bào bị phơi nhiễm với hóa chất nồng độ cao (E123 20mg/ml, E102 75 mg/ml, E621 15 mg/ral) quan sát mành xác tế bào giếng Hình 3.1 Hình thái tế bào sau 48 phơi nhiễm với E621 Hình thái tế bào cỏ thay đổi rõ ràng theo chiều tăng nồng độ (mg/ml): (A), 0,1 (B) 0,25 (C) 0,5 (D), (E), 2,5 (F) ,5(G), 7,5(H) 15(1) (—> Tế bào bị co lại Mảnh xác tế bào) Để đánh giá sức sống khả tăng sinh tế bào, sử dụng phương pháp ATP Bioluminescence Giá trị mật độ quang học thu bước sóng 500 mu xử lý phần mềm GraphPad Prism Từ đó, chúng tơi xây dựng đường cong đáp ứng liều 48 Hội nghị Khoa học công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội-2015 tế bào HEK293 sau 48 phơi nhiễm (Hình 3.2) tính tốn số IC50 tìmg loại hố chất (Bảng 3.1) m A(H) E 102 Hình Đường cong đáp ứng liều tế bào với hóa chất sau 48 phơi nhiễnt Đồ thị đường cong đáp ứng liều biểu diễn mối tương quan phần trăm tăng sinh tế bào so với đối chứng (A%) nồng độ hóa chất thử Kết cho thấy sức sóng hay khả tăng sinh tế bào HEK293 giảm dần nồng độ hóa chất tăng dần Từ kết phương trình đường cong đáp ứng liều, xác định giá trị IC50 giá trị mà nồng độ hóa chất gây ức chế 50% tổng số tế bào Kết thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Giá trị IC50 hóa chất thử nghiệm dịng tế bào HEK293 Hóa chất E123 E102 E621 IC50 (^Ig/ml) 0,38 3,58 0,78 49 E240 0,63 X 10-3 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 So sánh giá trị IC50 tính tốn nhận thấy giá trị IC50 E123 thấp nên chất có độc tính cao nhóm chất phụ gia thực phẩm Tuy nhiên, giá trị IC50 E240 lại thấp hàng nghìn lần chứng tỏ độc tính E240 cao gấp hàng nghìn lần so vớiE123,E102 E621 KÉT LUẬN Bằng việc sử dụng mơ hình in vitro đối tượng cụ thể dòng tế bào HEK293 chúng tơi đánh giá độc tính nhóm chất phụ gia thực phẩm E123, E102 E621 Những chất độc E240 nhimg gây ảnh hưởng định lên tế bào E 123 mạnh Kết nghiên cứu bước đầu chứng minh nguy tiềm ẩn chất phụ gia sức khỏe người LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thực kinh phí tìr ĐHQGHN đề tài mã số QG13.11 Xin chân thành cảm cm nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm - Bộ môn Sinh học Tế bào - Khoa Sinh học, trường ĐH KHTN, ĐHQGHN Phịng thí ngiệm ừọng điểm Enzyme - Protein, ĐH KHTN, ĐHQGHN hỗ trợ trình thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Lưu Hàn Ly, Đỗ Thị Vui, Nguyễn Lai Thành (2014), “Đánh giá độc tính số dung mơi phụ gia thực phẩm dịng tế bào HEK293”, Tạp Chí Khoa học, ĐHQGHN Crouch, s., Kozlowski R., Slater K., and Pletcher J (1993), “The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity”, dournal o f immmological methods, 160 (1), pp 81-88 Cui, D., Tian F., Ozkan C.S., Wang M., and Gao H (2005), “Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells”, Toxicology letters, 155 (1), pp 73-85 Hannah, R., Beck M., Moravec R., and Riss T (2001), “CellTiter-Glo™ Luminescent cell viability assay: a sensitive and rapid method for determining cell viability”, Promega Cell Notes, 2, pp 11-13 Tilson, H.A., laspers R., Komet L., and Van Ree J (1998), Introduction to neurobehavioral toxỉcology: Food and environment, CRC Press Tuormaa, T.E (1994), “The adverse effects of food additives on health: a review o f the literature with a special emphasis on childhood hyperactivity”, Journal o f Orthomolecular Medicine, 9, pp 225-225 50 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Wirkner, K., Schweigel J., et al (2004), “Adenine nucleotides inhibit recombinant N-type calcium channels via G protein-coupled mechanisms in HEK 293 cells; involvement o f the P2Y13 receptor-type”, British jo u m a l ofpharmacology, 141 (1), pp 141-151 51 ... vitro đối tượng cụ thể dịng tế bào HEK293 chúng tơi đánh giá độc tính nhóm chất phụ gia thực phẩm E123, E102 E621 Những chất độc E240 nhimg gây ảnh hưởng định lên tế bào E 123 mạnh Kết nghiên cứu... Additives) ước tính có 1500 loại phụ gia thực phẩm Bên cạnh nhíĩng lợi ích, phụ gia thực phẩm tiềm ẩn nguy gây hại cho sức khỏe người Sử dụng liều gây ngộ độc cấp tính ngộ độc mãn tính sử dụng... So sánh giá trị IC50 tính toán nhận thấy giá trị IC50 E123 thấp nên chất có độc tính cao nhóm chất phụ gia thực phẩm Tuy nhiên, giá trị IC50 E240 lại thấp hàng nghìn lần chứng tỏ độc tính E240