Đang tải... (xem toàn văn)
Sinh viên hiểu được ưu điểm của việc ứng dụng chỉ thị ADN trong việc xác định gen mục tiêu và có thể đánh giá được khả năng ứng dụng trong thực tế.. Cơ sở khoa học.[r]
(1)0
MỤC LỤC
Bài 1: Ứng dụng thị ADN kiểm tra lai F1 (buổi 1+2)
Mục tiêu:
1 Cơ sở khoa học
2 Chuẩn bị
3 Tiến hành
3.1 Lấy mẫu
3.2 Tách chiết ADN
3.3 Kiểm tra điện gel agarose 1%
3.4 Tiến hành PCR xác định lai F1
3.5 Điện di kiểm tra kiểu gen
4 Quan sát, đánh giá kết
5 Chú ý
6 Câu hỏi
Bài 2: Ứng dụng thị ADN chọn lọc mang gen mục tiêu (buổi 3+4)
Mục tiêu:
1 Cơ sở khoa học
2 Chuẩn bị
3 Tiến hành PCR phát gen qRS6
3.1 Lấy mẫu tách chiết ADN
3.2 Kỹ thuật PCR 10
4 Quan sát, đánh giá kết 11
5 Chú ý 11
6 Câu hỏi 11
Bài 3: Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính kháng bệnh bạc (buổi 5+6) 12
Mục tiêu: 12
1 Cơ sở khoa học 12
2 Chuẩn bị 13
3 Tiến hành 14
3.1 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 14
3.2 Lây nhiễm nhân tạo 14
3.3 Đo chiều dài vết bệnh 15
3.4 Đánh giá mức độ kháng nhiễm 16
4 Quan sát, đánh giá kết 16
5 Chú ý 16
(2)1
Bài 1: Ứng dụng thị ADN kiểm tra lai F1 (buổi 1+2) Mục tiêu:
Sinh viên thực hành tách chiết ADN từ thực vật vận dụng phương pháp lấy mẫu loại quần thể lúa khác (buổi 1)
Sinh viên ứng dụng thị ADN kiểm tra conlai F1 (buổi 2) đánh giá ưu điểm so với phương pháp truyền thống
1 Cơ sở khoa học
Phương pháp truyền thống để đánh giá độ di truyền giống lai kiểm tra dựa việc xác định đặc điểm hình thái giai đoạn khác Cách tiếp cận chịu ảnh hưởng yếu tố môi trường tốn thời gian Các phương pháp sinh hóa phân tích isozyme điện di protein hạt giống phân biệt kiểu gen biến động bị hạnh chế ảnh hưởng môi trường lên sinh trưởng Hơn nữa, tính tốn xác khoảng cách di truyền giống
Sử dụng thị ADN cho thử nghiệm độ tinh khiết lai khắc phục nhược điểm thị hình thái sinh hóa, đánh giá dựa kiểu gen giống lai loại bỏ biến đổi môi trường cho phép xác định độ tinh khiết lai cấp hạt giống Trình tự đơn giản đoạn ADN lặp lại (SSR) sử dụng rộng rãi đồng trội, có nhiều thơng tin, tái sản xuất đáng tin cậy để đánh giá độ giống lai
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR điển hình sử dụng thị SSR kiểm tra kiểu gen F1 so với bố mẹ P1 P2
2 Chuẩn bị
Mẫu vật:
(3)2
10 F1 từ phép lai Chiêm Tây P6ĐB Hóa chất tách chiết ADN
Hóa chất điện di agarose :
Đệm chạy điện di TAE TBE (sử dụng axit boric) Đệm mẫu
Dung dịch Ethilium Bromide 0,01%
Hóa chất PCR, cặp mồi đa hình giống bố giống mẹ (R9D5) Thiết bị, dụng cụ:
Đồ nhựa: đầu tip 1-20 ul, 10-100 ul, ống 1,5 mL, ống PCR 0,2 mL Máy mini spin, máy PCR, hệ thống điện di, đèn soi UV
3 Tiến hành 3.1 Lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu dòng thuần: lấy mẫu cá thể/dòng ngẫu nhiên
Phương pháp lấy mẫu quần thể phân ly: lấy mẫu theo số lượng cá thể dựa theo tỉ lệ kiểu gen thu theo mục tiêu đề (quần thể F2, F3, BC1F1, NIL, RIL)
Tiến hành lấy mẫu (3-5 cm) non, cá thể mẫu cho vào túi giấy ghi đầy đủ thông tin
(4)3 3.2 Tách chiết ADN
Tiến hành tách chiết ADN theo quy trình Dellaporta et al., 1987 Chia nhóm sinh viên 4-5 SV/nhóm
Quy trình thực hiện:
1, Cắt mẫu thành đoạn dài khoảng 0.5-1.0 cm, cho vào cối sứ khử trùng
2, Cho 600µl dung dịch extraction buffer 3, Dùng chày sứ nghiền nát thành dịch lỏng 4, Ủ mẫu 65o c 10 phút trở lên
5, Thêm 200 µl dung dịch 5M potassium acetate, lắc thật 6, Ủ vào đá thời gian 10 phút
7, Ly tâm mẫu tốc độ 9000 vòng/phút, 4o c, 15 phút
8, Hút 100 µl dung dịch phần sang ống (Không hút phần dưới) 9, Cho lượng 2-propanol với lượng hút bước 8, lắc
10, Ly tâm mẫu tốc độc 9000 vòng/phút, 30 phút, 4o c
11, Đổ bỏ phần cách úp ngược ống, để lên giấy thấm
12, Cho 500µl ethanol 70% vào ống (Nhớ không lắc, bỏ vào, nhẹ nhàng) 13, Ly tâm tốc độ 9000 vòng/phút, 4o c, 10-15 phút
14, Đổ bỏ ethanol, để nhiệt độ phịng đến khơng cịn mùi ethanol 15, Cho 50µl dung dịch đệm TE nước cất khử trung, bảo quản tủ
mát
16, Kiểm tra nồng độ chất lượng ADN điện di gel Agarose 1%
3.3 Kiểm tra điện gel agarose 1%
(5)4 Đổ gel agarose
Cân gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt Đổ 100 ml dung dịch TAE, lắc
Cho vào lị vi sóng, đun cho agarose tan hồn tồn Chuẩn bị khn lược, đặt thăng
Để nguội từ từ đến 600C, đổ nhẹ nhàng liên tục vào khuôn, tránh tạo bọt Để cho agarose đông lại (15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào máy điện di Chạy điện di
Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di
Cắt mảnh parafin, hút 2-3l dung dịch đệm mẫu cho mẫu ADN Hút 5l dung dịch ADN trộn nhỏ vào lỗ giếng
Cắm điện cực cho dòng điện chạy từ (-) (+) tính từ giếng
Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện cường độ dòng điện Nhuộm ethilium bromide chụp ảnh
Sau chạy điện di xong (vệt màu di chuyển khoảng 2/3 chiều dài gel), lấy gel khỏi máy điện di
Nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp nhuộm chứa dung dịch Ethilium bromide nhuộm 10 phút
Lấy gel ra, rửa cách ngâm nước 2-3 phút
(có thể trộn sẵn Ethilium Bromide gel đệm mẫu Đem vào máy, quan sát đèn tử ngoại (UV) chụp ảnh
(6)5
Hình ảnh thao tác chuẩn bị gel agarose chạy điện di
Cấu trúc phân tử gel agarose 3.4 Tiến hành PCR xác định lai F1
Sinh viên sử dụng mẫu ADN tách chiết từ buổi trước bảo quản tủ lạnh cho thí nghiệm
Kỹ thuật PCR: Sinh viên đặt chu trình nhiệt máy PCR Agilent SureCycler 8800 theo hướng dẫn sử dụng theo chu trình sau đây:
Chu trình nhiệt phản ứng:
(7)6
Bước 94oC phút Bước 55oC phút Bước 72oC phút Bước Lặp lại từ bước (35 chu kỳ) Bước 72oC phút Bước 40oC
Bước END
Chuẩn bị phản ứng PCR: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm thành phần nồng độ sau:
Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
H2O
PCR Master mix 2X 10
Primer R9D5 Forward 10pmol
Primer R9D5 Reverse 10pmol
Tổng thể tích Cocktail 19
ADN khn mẫu 50ng
Tổng số 20 l
***) cặp mồi R9D5 sử dụng theo kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Hạnh cs., 2018
Thơng thường người ta chạy phản ứng PCR mà chạy nhiều phản ứng thành phần trộn với lượng lớn vào ống sau chia nhỏ ống PCR (Chi tiết hướng dẫn cụ thể buổi thực tập)
3.5 Điện di kiểm tra kiểu gen
Các nhóm thực tập sử dụng mẫu nhóm, nhóm kiểm tra kết gel agarose 1% lần chạy
Sử dụng mẫu chuẩn ADN giống Chiêm Tây làm đối chứng (+) giếng số P6Đb làm đối chứng (-) giếng số
Tiến hành chuẩn bị đổ gel, chạy điện di hướng dẫn mục 3.3
(8)7
Trước đổ gel vào khuôn cần để nguội khoảng 60oC, đổ cịn nóng làm hỏng khn
Ethilium bromide chất độc, gây ung thư thao tác cần phải đeo găng tay Hộp đựng chất cần phải bảo quản riêng tránh ánh sáng
Có thể cho Ethilium bromide trực tiếp vào gel trước chạy điện di Nếu làm theo cách dụng cụ, máy điện di phải sử dụng riêng phải đeo găng tay thao tác
5 Chú ý
- Sinh viên hiểu rõ mục đích thực hành nắm cách sử dụng dụng cụ, thiết bị liên quan
- Sinh viên thực quy trình lấy mẫu tách chiết ADN, nhận xét kết thu
6 Câu hỏi
1 Cần chọn loại mơ thời điểm thích hợp để lấy mẫu lúa tách ADN? Ảnh hưởng nồng độ agarose đến kết chạy điện di?
Tài liệu tham khảo
Stephen L Dellaporta,Jonathan Wood , James B Hicks A plant DNA minipreparation: Version II Plant Molecular Biology Reporter, 1983, Volume 1, Issue 4, pp 19-21
(9)8
Bài 2: Ứng dụng thị ADN chọn lọc mang gen mục tiêu (buổi 3+4)
Mục tiêu:
Sinh viên hiểu ưu điểm việc ứng dụng thị ADN việc xác định gen mục tiêu đánh giá khả ứng dụng thực tế
1 Cơ sở khoa học
Chọn giống theo phương pháp truyền thống dựa khác biết kiểu hình cá thể quần thể phân ly, phương pháp thường gặp phải khó khăn đo đếm kiểu hình biến động kiểu hình tương tác kiểu gen môi trường Phương pháp chọn giống sử dụng thị ADN (MAS – marker assisted selection) phương pháp khắc phục nhược điểm trên: thời gian nhanh, độ xác cao, số lượng mẫu phân tích lớn, không bị ảnh hưởng môi trường
Chỉ thị ADN đoạn phân tử ADN với vị trí vật lý biết nhiễm sắc thể, nằm gần nằm gen mục tiêu, di truyền nhóm liên kết với gen mục tiêu Vì thị ADN liên kết với gen sử dụng để phát sớm, xác gen mục tiêu chọn lọc cá thể trồng mang kiểu gen mong muốn
(10)9
Bản đồ thị liên kết chặt với gen qRS6 quy định tinh bột khó tiêu gạo ở lúa (Phan Thị Hiền, 2019)
2 Chuẩn bị
Mẫu vật:
Mẫu tách chiết ADN từ giống Chiêm Tây (giống mang gen qRS6), P6 Đột biến (giống không mang gen qRS6) 10 mẫu F2 chuẩn bị sẵn
Hóa chất:
Hóa chất điện di ADN gel agarose
Hóa chất PCR, cặp mồi xác định gen mục tiêu (qRS6) Dụng cụ, thiết bị:
Micropipet, khay đựng ống PCR
Đồ nhựa: đầu tip 1-20 ul, 10-100 ul, ống 1,5 mL, ống PCR 0,2 mL Máy mini spin, máy PCR, hệ thống điện di, đèn soi UV
3 Tiến hành PCR phát gen qRS6 3.1 Lấy mẫu tách chiết ADN
(11)10 3.2 Kỹ thuật PCR
Sinh viên đặt chu trình nhiệt máy PCR Agilent SureCycler 8800 theo bước mô tả dưới:
Chu trình nhiệt phản ứng:
Bước 94oC phút Bước 94oC phút Bước 55oC phút Bước 72oC phút Bước Lặp lại từ bước (35 chu kỳ) Bước 72oC phút Bước 40oC
Bước END
Chuẩn bị phản ứng PCR: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm thành phần nồng độ sau:
Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
H2O
PCR Master mix 2X 10
Primer R7F10 Forward 10pmol
Primer R7F10 Reverse 10pmol
Tổng thể tích Cocktail 19
ADN khn mẫu 50ng
Tổng số 20 l
Thông thường người ta chạy phản ứng PCR mà chạy nhiều phản ứng thành phần trộn với lượng lớn vào ống sau chia nhỏ ống PCR (Chi tiết hướng dẫn cụ thể buổi thực tập)
Chạy điện di agarose 1% kiểm tra sản phẩm nhân gen PCR
(12)11 4 Quan sát, đánh giá kết
5 Chú ý
- Sinh viên hiểu rõ mục đích thực hành nắm cách sử dụng dụng cụ, thiết bị liên quan
- Sinh viên thực PCR điện di; hiểu nhận xét kết xác định gen qRS6
6 Câu hỏi
1 Phân tích ưu nhược điểm phương pháp xác định gen mục tiêu thị ADN?
2 So sánh khả ứng dụng thị ADN trội đồng trội?
Tài liệu tham khảo
Hanh NTT., Trung NQ., Linh DMT., Cuong PV., 2018 Nitrogen-Use Efficiency Evaluation and Genome Survey of Vietnamese Rice Landraces (Oryza sativa L.) Vietnam Journal of Agricultural Sciences, 1(3), 142-155 https://doi.org/10.31817/vjas.2018.1.2.04
(13)12
Bài 3: Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính kháng bệnh bạc (buổi 5+6)
Mục tiêu:
Sinh viên thực chuẩn bị dung dịch vi khuẩn sử dụng máy đo quang phổ phương pháp lây nhiễm nhân tạo (buổi 1) đánh giá tính kháng giống lúa với vi khuẩn bạc (buổi 2)
1 Cơ sở khoa học
Bệnh bạc lúa - hay cịn gọi bệnh cháy bìa lúa (Bacterial leaf blight) vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh hại phổ biến nước trồng lúa
Con đường lây nhiễm
Vi khuẩn Xoo xâm nhập qua vết thương giới rễ lúa, vết thương nặng tổn thương nhiều vi khuẩn phát triển lan rông Chúng nhân đôi di chuyển mạch dẫn, đặc biệt phát triển lây lan thời gian lúa làm đòng đến lúc lúa chín sữa
Hình ảnh Xoo bên mạch xylem (MV) (Kaku et al., 2000) Triệu chứng bệnh
Vi khuẩn Xoo gây triệu chứng điển hình bệnh bạc là: bạc lá, vàng nhợt béo xanh (còn gọi Kresek) Bệnh gây hại từ thời kỳ mạ đến thời kỳ lúa chín, biểu rõ lúc lúa trỗ, chín
(14)13
hình gợn sóng Vào lúc trời ấm buổi sáng sớm, đầu mép có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách
Kỹ thuật phân lập nuôi cấy vi khuẩn bạc theo Wakimoto, 1995
Sơ đồ thu mẫu bị bệnh phân phận vi khuẩn Xoo
2 Chuẩn bị
Mẫu vật:
Giống lúa IR24 (chuẩn nhiễm), IRBB7, IRBB21, BT7
Chủng vi khuẩn bạc X14.7 lưu giữ mơn SHPT&CNSH ứng dụng Hóa chất:
Nước cất khử trùng Dụng cụ, thiết bị:
Micropipet, chai thủy tinh 250 mL, ống Falcon 50 mL Đồ nhựa: đầu tip 1-20 ul, 10-100 ul, ống 1,5 mL Máy đo quang phổ UVVis
(15)14 3 Tiến hành
3.1 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae X14.7 (Vũ Huy Minh cs., 2014) nuôi môi trường Wakimono (Mew et al., 1993) ống nghiệm có khuẩn lạc đặc trưng
Tiến hành lấy khuẩn lạc qua cấy hòa tan 10 mL nước cất ống falcon
Lắc nhẹ đo nồng độ vi khuẩn máy đo quang phổ bước sóng 600 nm Bổ sung nước cất để chuẩn nồng độ đến 108 tế bào/mL
Tránh ánh sáng trực tiếp tới dung dịch (để hộp bọc giấy kín)
3.2 Lây nhiễm nhân tạo
Trồng lúa chậu đất nhà lưới lúa bước vào giai đoạn đẻ nhánh bắt đầu tiến hành lây nhiễm.và lây nhiễm lúa trồng cách lấy kéo inox nhúng vào dịch vi khuẩn cắt ngang đầu lúa
Lưu ý: Mỗi dòng vi khuẩn phải dùng riêng kéo Mỗi dịng vi khuẩn bố trí độc lập khác nhau, tuyệt đối khơng bố trí dòng vi khuẩn khác
(16)15
Sơ đồ phân lập đánh giá tính kháng vi khuẩn bạc lá (Kauffman et al., 1973)
3.3 Đo chiều dài vết bệnh
Xác định lây nhiễm nhân tạo vào buổi trước kiểm tra thẻ tên
Sử dụng thước đo chiều dài vết bệnh, tính từ đầu vị trí cắt đến điểm cuối vết bệnh gân
(17)16
Cách đo vết bệnh 1-2 tuần sau lây nhiễm 3.4 Đánh giá mức độ kháng nhiễm
Sử dụng thang đánh giá mức độ kháng nhiễm IRRI để đánh giá giống lây nhiễm:
Highly Resistant (HR) < 1.0 cm, Resistant (R) 1.0-5.0 cm,
Moderately Resistant (MR) >5.0-10.0 cm Moderately Susceptible (MS) >10.0 – 15.0 cm Susceptible (S) > 15.0 cm
Xây dựng bảng phổ kháng nhiễm giống mang gen kháng với chủng Xoo X14.7
4 Quan sát, đánh giá kết 5 Chú ý
(18)17
- Sinh viên hiểu chế lẫy nhiễm bệnh bạc lá, nguyên lý xác định nồng độ vi khuẩn máy đo quang phổ
6 Câu hỏi
1 Cơ chế xâm nhập lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh bạc lá? Nêu gen kháng bệnh bạc giống lúa mang gen công bố?
Tài liệu tham khảo
Mew, T W., Alvarez, M A., Leach, E J., & Swings, J (1993) Focus on bacterial blight of rice Plant Disease, 77,5–12
Kauffman, H.E., Reddy, A.P.K., Hsieh, S.P.Y., Merca, S.D 1973 Improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas-oryzae Plant Disease Reporter ;57:537–541
(19) https://doi.org/10.31817/vjas.2018.1.2.04