Nghiên cứu sử dụng nấm lecanicillium kí sinh côn trùng đề kiểm soát rệp hại rau

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CƠN TRÙNG ĐỂ KIỂM SỐT RỆP HẠI RAU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CƠN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Tình hình rệp hại trồng giới 1.2 Thuốc diệt trùng hóa học 1.2.1 Tình hình sản xuất sử dụng 1.2.2 Ưu nhược điểm 1.3 Rệp hại trồng Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 11 1.3.1 Phân loại 11 1.3.2 Ưu nhược điểm 12 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng .13 1.3.4 Khả kiểm soát rệp hại trồng nấm Lecanicillium 17 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng 18 1.5 Ảnh hưởng môi trường lên sinh bào tử nấm Lecanicillium 19 1.5.1 Nguồn carbon 19 1.5.2 Nguồn nitơ .20 1.5.3 Nhiệt độ môi trường .21 1.5.4 Độ ẩm khơng khí độ ẩm chất 21 1.5.5 Một số yếu tố khác 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 23 2.1.1 Chủng giống plasmid 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Dung dịch đệm 24 2.1.4 Môi trường nuôi cấy .24 Trường Đại học KHTN ii Luận văn thạc sĩ Sinh học 2.1.5 2.2 Vũ Xuân Đạt Thiết bị 24 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao .25 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.3 Xác định ảnh hưởng điều kiện môi trường lên sinh bào tử chủng nấm 485 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao .32 3.2 Định tên chủng nấm 485 34 3.3 Ảnh hưởng điều kiện môi trường lên sinh bào tử L lecanii 485 36 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn chất 36 3.3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ thành phần chất .37 3.3.3 Ảnh hưởng độ dày chất 37 3.3.4 Ảnh hưởng độ ẩm chất 39 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 3.3.6 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 41 3.3.7 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 42 3.3.8 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 .43 3.3.9 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 .44 3.3.10 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 45 3.3.11 Ảnh hưởng thời gian lên men 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 60 Trường Đại học KHTN iii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thiệt hại số trồng rệp Vương quốc Anh Bảng 2.1 Các dung dịch đệm 24 Bảng 2.2 Các thiết bị 25 Trường Đại học KHTN iv Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xn Đạt DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu tạo rệp Hình 1.2 Rệp hại trồng Hình 1.3 Vịng đời rệp Hình 2.1 Lá cải có rệp sau phun dịch bào tử nấm 26 Hình 3.1 Kết phun bào tử nấm lên rệp cải 32 Hình 3.2 Độc lực diệt rệp chủng Lecanicillium spp 33 Hình 3.3 Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA 34 Hình 3.4 Trình tự gene 28S rRNA chủng 485 (A) phân loại (B) 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn chất 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô mơi trường 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ dày chất 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng độ ẩm chất 39 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 44 Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 45 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 46 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men 47 Trường Đại học KHTN v Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume w/v weight/volume w/w weight/weight Trường Đại học KHTN vi Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỞ ĐẦU Rệp (Aphidoidae) nhóm trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố rộng rãi vùng ôn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Chúng kí sinh 11000 lồi thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng bông, cải, cải dầu, loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39] Rệp khơng phá hoại trực tiếp cách chích hút nhựa mà truyền virus gây bệnh cho Hàng năm, rệp với côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng trồng toàn giới [22] Do tính chất nguy hại rệp, việc sử dụng biện pháp phòng trừ rệp cần thiết Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng hiệu tác dụng nhanh, thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm nhanh bị kháng côn trùng sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Với ưu điểm vượt trội độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người, thuốc diệt côn trùng sinh học coi lựa chọn có tiềm lớn xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium chi nấm có khả kí sinh tự nhiên rệp nhiều lồi trùng khác Từ năm 1960, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm sản xuất thương mại hóa Tuy nhiên, kết đạt nghiên cứu sử dụng thuốc diệt trùng sinh học cịn hạn chế Năm 2000, giá trị thương mại thuốc diệt côn trùng sinh học sử dụng toàn giới chiếm 1,8% tổng giá trị loại thuốc diệt côn trùng Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium cần thiết Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, viện Cơng nghệ Sinh học, viện KH CN Việt Nam năm 2010-2013 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn làm chủ quản, thực đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh trùng để kiểm sốt rệp hại rau" Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học Rệp (Aphidoidae) họ lớn thuộc lớp côn trùng, động vật không xương sống, thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép cặp râu, thể bao bọc khung kitin, chiều dài từ đến 10 mm (hình 1.1) Khoảng 3700 loài rệp biết đến giới [39] Râu Đầu Ống tiết Đuôi Ngực Bụng Mắt Mắt kép chân chân Vịi chích hút chân Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp Rệp nhóm trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố tập trung vùng ôn đới [51], rệp phân bố phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt với độ đa dạng thấp Khoảng 250 lồi rệp trùng phá hoại nguy hiểm nông, lâm nghiệp cần kiểm soát Tuy nhiên, đứng quan điểm động vật học, rệp nhóm động vật thích nghi tốt với mơi trường nhờ khả sinh sản vơ tính [67] Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng khơng màu (hình 1.2) Phương thức dinh dưỡng rệp chích hút nhựa miệng có cấu tạo kiểu chích hút Khi chất dinh dưỡng trở nên nghèo nàn mật độ rệp q đơng, số lồi rệp sinh có cánh để phát tán nơi khác Nhiều loài rệp kí sinh lồi nhất, số khác chẳng hạn Myzus Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt persicae (rệp đào) kí sinh hàng trăm lồi thuộc nhiều họ khác Khi chích hút, chúng truyền virus từ bệnh sang khỏe mạnh số trồng như: khoai tây, ngũ cốc, củ cải đường, cam, quýt [36] Những vết chích hút rệp trở thành nơi bị tổn thương dễ dàng bị nấm xâm nhập gây bệnh cho A B C D Hình 1.2 Rệp hại trồng Myzus persicae (A B), Aphis gossypii (C) Aphis illinoisensis (D) Ở rệp có hai kiểu sinh sản đơn tính hữu tính Nhiều lồi có thay đổi kiểu sinh sản đơn tính hữu tính phức tạp Sự thay đổi hai kiểu sinh sản để sinh trứng ấu trùng, thay đổi chủ thân gỗ chủ thân thảo Khoảng 10% lồi rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với thay đổi chủ [51] Mặc dù số lồi rệp có đực cái, có quần thể Vào mùa đông, nhiệt độ thấp trứng sinh ra, mùa xuân trứng nở thành rệp Dạng sinh sản phổ biến rệp đơn tính sinh con, rệp sinh có đặc điểm giống hệt rệp mẹ ngoại trừ kích thước Q trình sinh lặp lặp lại suốt mùa hè, sinh nhiều hệ, thời gian sống hệ từ 20 đến 40 ngày, từ rệp nở vào mùa xn sinh hàng nghìn rệp Chẳng hạn, rệp bắp cải (Brevicoryne brassicae) sinh 41 lứa rệp mùa sinh sản Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt pesticide use, and cancer incidence in the agricultural health study cohort”, Cancer Causes Control, 21(11), pp 1759-1775 Angelo I C., Fernandes E K., Bahiense T C., Perinotto W M., Moraes A P., Terra A L., Bittencourt V R (2010), “Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick Rhipicephalus microplus”, Vet Parasitol, 172(3-4), pp 317-322 10 Arevalo J., Hidalgo-Díaz L., Martins I., Souza J F., Castro J M C., Carneiro R M D G., Tigano M S (2009), “Cultural and morphological characterization of Pochonia chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil”, Trop Plant Pathol, 34(3), pp 158-163 11 Aspelin A L., Grube A H (1999), Pesticides industry sales and usage 1996 and 1997 market estimates, United States EPA 12 Barson G (1976), “Laboratory studies on the fungus Verticillium lecanii, a larval pathogen of the large elm bark beetle (Scolytus scolytus)”, Ann Appl Biol, 83, pp 207-214 13 Baysal Z., Uyar F., Aytekin C (2003), “Solid state fermentation for production of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot-spring water”, Process Biochem, 38, pp 1665-1668 14 Blair A., Freeman L B (2009), “Epidemiologic studies of cancer in agricultural populations: observations and future directions”, J Agromed, 14, pp 125-131 15 Brar N S., Bakhetia D R C., Sekhon B S (1987), “Estimation of losses in yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)”, J Oilseeds Res, 4(2), pp 261-264 16 Bukhari T., Takken W., Koenraadt C J M (2011), “Development of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana formulations for control of malaria mosquito larvae”, Parasit Vectors, 4(23), pp 1-14 Trường Đại học KHTN 51 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 17 Carrasco-Tauber C (1989), Pesticide Productivity Revisited, MA, University of Massachusetts 18 Catangui M A., Beckendorf E A., Riedell W E (2009), “Soybean aphid population dynamics, soybean yield loss, and development of stage-specific economic injury levels”, Agron J, 101(5), pp 1080-1092 19 CEQ (1980), The Global 2000 Report to the President of the US Entering the 21st Century, Pergamon Press, New York 20 Colborn T., Myers J P., Dumanoski D (1996), Our Stolen Future: How We Are Threatening Our Fertility, Intelligence, and Survival: A Scientific Detective Story, Dutton, New York 21 Cuthbertson A G S., Blackburn L F., Northing P., Luo W., Cannon R J C., Walters K F A (2010), “Chemical compatibility testing of the entomopathogenic fungus Lecanicillium muscarium to control Bemisia tabaci in glasshouse environment”, Int J Environ Sci Tech, 7(2), pp 405-409 22 Damalas C A (2009), “Understanding benefits and risks of pesticide use”, Sci Res Essay, 4(10), pp 945-949 23 De Faria M R., Wraight S P (2007), “Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types”, Biol Control, 43, pp 237-256 24 Diaz B M., Oggerin M., Lopez Lastra C C., Rubio V., Fereres A (2009), “Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different aphid species”, Bio Control, 54, pp 825–835 25 El-Defrawi G M., El-Harty E H (2009), Injury levels and yield loss model for the cowpea aphid (Aphis craccivora Koch) on Vicia faba L., 6th International Symposium of Mediterranean Group on Pesticide Research, Cairo, Egypt 26 Feng K C., Liu B L., Tzeng Y M (2000), “Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations”, Bioprocess Biosyst Eng, 23, pp 25-29 Trường Đại học KHTN 52 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 27 Gao L., Liu X Z (2009), “A novel two stage cultivation method to optimize carbon concentration and carbon to nitrogen ratio for sporulation of biocontrol fungi”, Folia Microbiol, 54(2), pp 142-146 28 Gary C J., Liberty P A., Jocelyn B P (2005), “Effect of nitrogen fertilizer on the intrinsic rate of increase of the rusty plum aphid, Hysteroneura setariae (Thomas) (Homoptera: Aphididae) on rice (Oryza sativa L.)”, Environ Entomol, 34(4), pp 938-943 29 Gindin G., Levski S., Glazer I., Soroker V (2006), “Evaluation of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against the Red Palm Weevil Rhynchophorus ferrugineus”, Phytoparasitica, 34(4), pp 370-379 30 Gopalakrishnan C (1989), “Susceptibility of cabbage diamondback moth Plutella xylostella L to the entomofungal pathogen Verticillium lecanii (Zimmerman)”, Viegas Current Science, 58(22), pp 1256-1257 31 Grube A., Donaldson D., Kiely T., Wu L (2011), Pesticides industry sales and usage, 2006 and 2007 market estimates, United States EPA 32 Guclu S., Ak K., Eken C., Akyol H., Sekban R., Beytut B., Yildirim R (2010), “Pathogenicity of Lecanicillium muscarium against Ricania simulans”, Bull Insectol, 63(2), pp 243-246 33 Hall R A (1981), “A new insecticide against greenhouse aphids and whitefly: the fungus Verticillium lecanii”, Ohio Florists’ Assoc Bull, 626, pp 3-4 34 Hart K., Pimentel D (2002), “Public health and costs of pesticides”, Encyclopedia of Pest Management, Marcel Dekker, New York, pp 677-679 35 Heathcote G D (1962), “The suitability of some plant hosts for the development of the peach-potato aphid, Myzus persicae (Sulzer)”, Entomol Exp Appl, 5(2), pp 114-118 36 Henry G S (1997), “Aphid”, McGraw-Hill Encyclopedia of Science and Technology, McGraw-Hill, New York Trường Đại học KHTN 53 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 37 Ho Q T., Tran T P., Nguyen T., Tran V H., Trinh T X., Bui X H., Dang T C., Tran T B (2010), Rearing Metarhizium anisopliae fungi at the household level for management of brown planthoppers in rice fields, 28th International Rice Research Conference, Hanoi, Vietnam 38 Hohenadel K., Harris S A., Mclaughlin J R., Spinelli J J., Pahwa P., Dosman J A., Demers P A., Blair A (2011), “Exposure to multiple pesticides and risk of non-Hodgkin lymphoma in men from six Canadian provinces”, Int J Environ Res Public Health, 8, pp 2320-2330 39 Holman J (2009), Host Plant Catalog of Aphids: Palaearctic Region, Springer Verlag, Berlin, Germany 40 Hossain A., Ferdous J., Salim M M R (2006), “Relative abundance and yield loss assessment of Lentil aphid, Aphis craccivora Koch in relation to different sowing dates”, J Agric Rural Dev, 4, pp 101-106 41 Howard T D., Hsu F C., Grzywacz J G., Chen H., Quandt S A., Vallejos Q M., Whalley L E., Cui W., Padilla S., Arcury T A (2010), “Evaluation of candidate genes for cholinesterase activity in farmworkers exposed to organophosphorus polymorphisms pesticides: in BCHE”, Association Environ of Health single Perspect, nucleotide 118(10), pp 1395-1399 42 Jenkins N E., Heviefo G., Langewald J., Cherry A J., Lomer C J (1998), “Development of mass production technology for aerial conidia for use mycopesticides”, Biocontrol News Inf, 19(1), pp 21-31 43 Johnson D L., Huang H C., Harper A M (1988), “Mortality of grasshoppers (Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus Verticillium lecanii”, J Invertebr Pathol, 52, pp 335-342 44 Kaiser W J., Danesh D (1971), “Biology of four viruses affecting Cicer arietinzrm in Iran”, Phytopathology, 61, pp 372-375 45 Kiely T., Donaldson D., Grube A (2004), Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates, United States EPA Trường Đại học KHTN 54 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 46 Kim H Y., Lee H B., Kim U C., Kim I S (2008), “Laboratory and field evaluations of entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for control of green peach aphid (Myzus persicae)”, J Microbiol Biotechnol, 18(12), pp 1915-1918 47 Kim J J., Lee M H., Yoon C S., Kim H S., Yoo J K., Kim K C (2001), “Control of cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen”, Biological Control of Greenhouse Pests, Food & Fertilizer Technology Center, Taipei, Taiwan, pp 8-15 48 Kleespies R G., Zimmermann G (1992), “Production of blastospores by three strains of Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok In submerged culture”, Biocontrol Sci Technol, 2, pp 127-135 49 Kope H H., Alfaro R I., Lavallée R (2008), “Effects of temperature and water activity on Lecanicillium spp conidia germination and growth, and mycosis of Pissodes strobi”, BioControl, 53, pp 489-500 50 Le V V., Nguyen D D., Le K A., Pham K S., Tetsu A (2011), “Sex pheromone components and control of the citrus pock caterpillar, Prays endocarpa, found in the Mekong Delta of Vietnam”, J Chem Ecol, 37(1), pp 134-140 51 Mcgavin G C., Preston-Mafham K (1993), Bugs of the World, Of the World Series, Facts on File, New York 52 Miller G T (2002), Living in the Environment: Principles, Connections, and Solutions (12th Ed.), Wadsworth/Thomson Learning, Belmont, Califorlia 53 Milner R J (1997), “Prospects for biopesticides for aphid control”, Biocontrol, 42(1-2), pp 227-239 54 Moazami N (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological physiological and Health Sciences, Encyclopedia Of Life Support Systems, pp 1-52 55 Moo Y., Moreira M A R., Tengerdy R P (1983), “Principles of solid substrate fermentation”, Fungal Technology, Edward Arnold, London, pp 117-144 Trường Đại học KHTN 55 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 56 Mussen E (1990), “California crop pollination”, Gleanings in Bee Culture, 118, pp 646-647 57 Nault L R (1997), “Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis”, Ann Entomol Soc Amer, 90, pp 521-541 58 Nene Y L., Reddy M V (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”, Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp 31-32 59 Nevo E., Coll M ( 2001), “Effect of nitrogen fertilization on Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae): variation in size, color, and reproduction”, J Econ Entomol, 94(1), pp 27-32 60 Ofuya T T (1997), “Control of cowpea aphid, Aphis craccivora Koch (Homoptera: Aphididae), in cowpea, Vigna unguiculata (L.) Walp.” Integr Pest Manag Rev, 2(4), pp 199-207 61 Patel S R., Awasthi A K., Tomar R K S (2004), “Assessment of yield losses in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl Eco Environ Res, 2(1), pp 1-15 62 Pham T A., Kim J J., Kim K (2010), “Optimization of solid-state fermentation for improved conidia production of Beauveria bassiana as a mycoinsecticide”, Mycobiology, 38(2), pp 137-143 63 Pimentel D (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing Pesticide Use: Environmental and Economic Benefits, John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp 1-11 64 Pimentel D (2005), “Enviromental and economic costs of the application of pesticides primarily in the United States”, Environ Dev Sustain, 7, pp 229252 65 Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V., Giordana S., Horowitz A., D’amore M (1993), “Assessment of environmental and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide Trường Đại học KHTN 56 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Question: Environment, Economics and Ethics, Chapman & Hall, New York, pp 47-84 66 Pimentel D., Stachow U., Takacs D A., Brubaker H W., Dumas A R., Meaney J J., O’neil J A S., Onsi D E., Corzilius D B (1992), “Conserving biological diversity in agricultural/forestry systems”, Bioscience, 42, pp 354-362 67 Piper R., Shanahan M (2007), Extraordinary Animals: An Encyclopedia of Curious and Unusual Animals, Greenwood Press, United States 68 Raimbault M (1998), “General and microbiological aspects of solid substrate fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp 1-15 69 Razaq M., Mehmood A., Aslam M., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S (2011), “Losses in yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica juncea L and Brassica carrinata A at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp 319-324 70 Richter E D (2002), “Acute human pesticide poisonings”, Encyclopedia of Pest Management, Dekker, New York, pp 3-6 71 Ridgway R L., Tinney J C., Macgregor J T., Starlert N J (1978), “Pesticide use in agriculture”, Environ Health Perspect, 27, pp 103-112 72 Riedell W E., Catangui M A., Beckendorf E A (2009), “Nitrogen, fixation, ureide, and nitrate accumulation responses to soybean aphid injury in Glycine max”, J Plant Nutr, 32(10), pp 1674-1686 73 Rombach M C (1989), “Production of Beauveria bassiana [Deuteromycotina: Hyphomycetes] sympoduloconidia in submerged culture”, Entomophaga, 34, pp 45-52 74 Shi Y., Xu X., Zhu Y (2009), “Optimization of Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation on sugarcane bagasse”, App Microbiol Biotechnol, 82, pp 921-927 Trường Đại học KHTN 57 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 75 Shingleton A W., Sisk G C., Stern D L (2003), “Diapause in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) is a slowing but not a cessation of development”, BMC Dev Biol, 3(7), pp 1-12 76 Singh C P., Sachan G C (1994), “Assessment of yield losses in yellow sarson due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt)”, J Oilseeds Res, 11(2), pp 179-184 77 Sylvester E S (1980), “Circulative and propagative virus transmission by aphids”, Ann Rev Entomol, 25, pp 257-286 78 Tatchell G M (1989), “An estimate of the potential economic losses to some crops due to aphids in Britain”, Crop Prot, 8, pp 25-29 79 Thackray D J., Diggle A J., Berlandier F A., Jones R A (2004), “Forecasting aphid outbreaks and epidemics of Cucumber mosaic virus in lupin crops in a Mediterranean-type environment”, Virus Res, 100(1), pp 67-82 80 Vu V H., Hong S I., Kim K (2007), “Selection of entomopathogenic fungi for aphid control”, J Biosci Bioeng, 104(6), pp 498-505 81 Vu V H., Hong S I., Kim K (2008), “Production of aerial conidia of Lecanicillium lecanii 41185 by solid-state fermentation for use as mycoinsecticide”, Mycobiology, 36(3), pp 183-189 82 Weiner B P., Worth R M (1972), “Insecticides: household use and respiratory impairment”, Adverse Effects of Common Environmental Pollutants, MSS Information Corporation, New York, pp 149-151 83 Xia J (1997), Biological control of cotton aphid (Aphis gossypii Glover) in cotton (inter) cropping systems in China: a simulation study, S.L Xia, Florida 84 Xu X., Yu Y., Shi Y (2011), “Evaluation of inert and organic carriers for Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation”, Biotechnol Lett, 33, pp 763-768 85 Zare R., Gams W (2001), “A revision of Verticillium sect Prostrata III Generic classification”, Nova Hedwigia, 72, pp 329-337 Trường Đại học KHTN 58 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 86 Zhang M., Tang Q., Chen Z., Liu J., Cui H., Q S., Xia Y., Altosaar I (2009), “Genetic transformation of Bt gene into sorghum (Sorghum bicolor L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 25(3), pp 418-423 87 Zhou P., Zhao Y., Li J., Wu G., Zhang L., Liu Q., Fan S., Yang X., Li X., Wu Y (2011), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study”, Environ Int, Epub ahead of print, available at http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412011001632 Trường Đại học KHTN 59 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt PHỤ LỤC Bảng 4.1 Độc lực diệt rệp cải chủng nấm Lecanicillium spp Tỉ lệ rệp chết (%) Thời gian sau phun (ngày) Đối chứng 0 0 0 0 L18 2,3 ± 4,0 1,1 ± 2,0 2,9 ± 5,1 5,1 ± 8,9 10,3 ± 17,8 17,9 ± 31,1 17,3 ± 30,0 L43 2,6 ± 5,2 16,7 ± 19,0 29,2 ± 18,7 35,9 ± 19,4 41,0 ± 18,1 47,6 ± 19,3 46,2 ± 20,9 L85 1,7 ±3,4 2,6 ± 1,7 11,3 ± 10,3 11,0 ± 7,4 17,1 ± 14,4 24,7 ± 30,5 24,8 ± 32,3 85k 12,9 ±11,4 29,7 ± 28,8 47,4 ± 17,8 47,2 ± 20,1 50,5 ± 18,5 52,8 ± 22,3 56,6 ± 15,5 485 9,2 ± 13,1 21,5 ± 8,6 31,3 ± 21,3 51,3 ± 18,6 61,7 ± 14,6 60,8 ± 16,3 67,4 ± 7,4 8514 5,2 ± 6,6 6,3 ± 6,1 17,8 ± 21,5 20,7 ± 24,7 32,2 ± 29,7 39,0 ± 31,8 37,5 ± 31,4 L1185 3,4 ± 4,9 7,0 ± 7,5 25,7 ± 11,2 27,3 ± 13,1 39,3 ± 10,9 49,4 ± 15,4 47,2 ± 14,3 Ghi chú: nhiệt độ 21-25°C, độ ẩm khơng khí 75-80% Bảng 4.2 Ảnh hưởng nguồn chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nguồn chất Gạo Bột gạo Cám gạo Bột ngô Bột lõi ngô + bột gạo (1:1, w/w) Bột lõi ngô + bột ngơ (1:1, w/w) Bột bã mía + bột gạo (1:1, w/w) Bột bã mía + bột ngơ (1:1, w/w) Kí hiệu G BG CG BN LG LN MG MN Ghi chú: F = 18,57; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 60 Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 0,19 0,28 1,19 0,55 ± 0,55 0,84 0,32 1,30 0,82 ± 0,49 2,67 1,37 1,13 1,72 ± 0,83 2,25 2,75 3,73 2,96 ± 0,76 4,90 4,87 3,57 4,44 ± 0,76 4,83 5,33 4,93 5,03 ± 0,26 2,08 1,82 3,07 2,32 ± 0,66 4,10 4,53 2,97 3,87 ± 0,81 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô môi trường lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TT Bột lõi ngô: bột ngô (w/w) 8:2 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 7:3 0,36 0,39 0,49 0,41 ± 0,07 6:4 3,10 3,90 6,13 4,38 ± 1,57 5:5 4,40 5,40 6,30 5,37 ± 0,95 4:6 4,60 4,20 3,97 4,26 ± 0,32 3:7 3,50 3,90 3,83 3,74 ± 0,21 2:8 3,33 3,67 3,77 3,59 ± 0,23 Lần Lần Lần Trung bình Ghi chú: F = 25,06; P < 0,001 Bảng 4.4 Ảnh hưởng độ dày chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Độ dày chất (mm) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần 6,90 6,37 5,43 6,23 ± 0,74 11 6,20 5,67 5,77 5,88 ± 0,28 13 5,40 6,27 7,17 6,28 ± 0,88 15 4,93 5,37 8,23 6,18 ± 1,79 17.5 7,30 8,03 7,07 7,47 ± 0,50 20 8,37 7,73 7,57 6,93 8,33 22,5 7,87 8,00 9,20 10,53 9,60 25 8,33 11,07 9,57 10,63 27,5 10,67 10,07 10,17 10,32 ± 0,32 10 30 9,20 10,40 9,77 9,79 ± 0,60 Ghi chú: F = 11,50; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 61 Lần Lần Lần 8,57 Trung bình 7,92 ± 0,62 9,04 ± 1,12 9,90 ± 1,22 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.5 Ảnh hưởng độ ẩm lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TT Lượng nước bổ sung (% so với chất) 40 2,00 2,37 1,97 2,11 ± 0,22 50 3,57 2,40 2,83 2,93 ± 0,59 60 4,20 4,83 5,07 4,70 ± 0,45 70 4,37 6,53 5,40 5,43 ± 1,08 80 5,03 5,50 4,57 5,04 ± 0,47 90 5,20 4,60 5,40 5,07 ± 0,42 100 4,30 3,73 4,07 4,03 ± 0,28 110 3,27 3,37 3,43 3,36 ± 0,08 Lần Lần Lần Trung bình Ghi chú: F = 14,96; P < 0,001 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TT Nhiệt độ (°C) 25 4,30 3,20 3,13 3,54 ± 0,66 28 4,00 4,70 4,93 4,54 ± 0,49 30 8,60 7,63 7,40 7,88 ± 0,64 37 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 Lần Lần Lần Trung bình Ghi chú: F = 117,78; P < 0,001 Bảng 4.7 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nguồn nitơ Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình Khơng bổ sung 4,37 6,53 5,40 5,43 ± 1,08 NaNO3 2,90 3,47 3,77 3,38 ± 0,44 KNO3 5,63 5,00 5,13 5,26 ± 0,33 NH4NO3 6,90 7,93 6,50 7,11 ± 0,74 (NH4)2SO4 11,73 11,03 12,00 11,59 ± 0,50 (NH4)2HPO4 10,80 11,83 10,33 10,99 ± 0,77 Ghi chú: F = 69,36; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 62 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nồng độ (NH4)2SO4 (mol N/1000g chất) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 7,03 6,90 7,07 7,00 ± 0,09 0,02 7,00 9,50 8,73 8,41 ± 1,28 0,05 8,17 9,57 9,67 9,13 ± 0,84 0,1 10,57 11,03 10,53 10,71 ± 0,28 0,2 1,60 1,53 1,43 1,52 ± 0,08 0,5 0,03 0,01 0,02 0,02 ± 0,01 Ghi chú: F = 139,79; P < 0,001 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nồng độ MgSO4 (% so với khối lượng chất) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 0,000 11,23 10,80 9,93 10,66 ± 0,66 0,020 9,13 9,83 9,57 9,51 ± 0,35 0,030 11,53 10,70 10,17 10,80 ± 0,69 0,035 12,87 13,23 13,03 13,04 ± 0,18 0,040 11,63 11,33 11,43 11,47 ± 0,15 0,050 10,50 11,73 11,03 11,09 ± 0,62 Ghi chú: F = 16,40; P < 0,001 Bảng 4.10 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TT Nồng độ KH2PO4 (% so với khối lượng chất) 0,00 11,23 10,80 9,93 10,66 ± 0,66 0,10 12,03 11,20 11,43 11,56 ± 0,43 0,15 11,30 11,50 11,47 11,42 ± 0,11 0,20 11,20 11,27 11,37 11,28 ± 0,08 0,25 11,63 11,63 11,50 11,59 ± 0,08 0,30 11,87 10,57 11,27 11,23 ± 0,65 Lần Ghi chú: F = 1,96; P > 0,1 Trường Đại học KHTN 63 Lần Lần Trung bình Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.11 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Giờ/ngày Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 12,97 13,23 12,67 12,96 ± 0,28 12 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50 24 11,83 11,77 12,13 11,91 ± 0,20 Ghi chú: F = 12,12; P < 0,01 Bảng 4.12 Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Thời gian lên men (ngày) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 12,90 12,23 12,57 12,57 ± 0,33 13,70 13,33 13,57 13,53 ± 0,19 10 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50 12 13,43 13,60 12,87 13,30 ± 0,38 14 13,23 13,17 13,40 13,27 ± 0,12 Ghi chú: F = 3,54; P < 0,05 Trường Đại học KHTN 64 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Vu Van Hanh, Le Thi Thuy Duong, Nguyen Huu Quan, Vu Xuan Dat, Quyen Dinh Thi, Kim Keun (2011), Improvement of Virulence of Entomopathogenic fungus Lecanicillium sp L43 towords Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi, Vu Xuan Dat, Nguyen Huu Quan, Kim Keun (2011), Virulence of Entomopathogenic Fungus Lecanicillium sp Le85 towards Cotton Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Trường Đại học KHTN 65 ... hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng .13 1.3.4 Khả kiểm soát rệp hại trồng nấm Lecanicillium 17 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng 18 1.5 Ảnh hưởng môi trường lên sinh bào tử nấm Lecanicillium. .. ngày phun [32] Nấm kí sinh khơng nghiên cứu để diệt trùng gây hại trồng, mà cịn nghiên cứu để diệt trùng kí sinh truyền bệnh cho người vật nuôi Angelo cộng (2010) nghiên cứu khả kiểm soát rận Rhipicephalus... cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium cần thiết 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh trùng