Nghiên cứu quy trình giám định một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS trong nước tiểu bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Quang Hùng NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ NANO KIM LOẠI ĐẾN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM RHIZOBIUM TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Quang Hùng NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ NANO KIM LOẠI ĐẾN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM RHIZOBIUM TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên nghành : Khoa học môi trường Mã số : 60440301 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN THỊ HỒNG THẢO PGS.TS NGUYỄN KIỀU BĂNG TÂM Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm (Khoa Môi trường – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN), T.S Phan Thị Hồng Thảo (Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Viêt Nam), người cô mẫu mực tận tụy hướng dẫn truyền đạt kiến thức cho suốt trình thực đề tài ln quan tâm, động viên giúp đỡ sống Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án KHCN trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH CN Việt Nam mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18 “ Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ nano nơng nghiệp” PGS.TS Nguyễn Hồi Châu làm chủ nhiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội dành tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng tơi suốt khóa học Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể anh, chị, em Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình cộng tác giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln bên động viên, chia sẻ khó khăn giúp đỡ tơi trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên cao học Nguyễn Quang Hùng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Cây đậu tương ứng dụng sản xuất nông nghiệp Việt Nam 1.1.1 Giới thiệu chung đậu tương 1.1.2 Tình hình sản xuất vai trị đậu tương nông nghiệp 1.1.3 Những vấn đề sản xuất đậu tương Việt Nam .5 1.2 Q trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 1.2.1 Q trình khống hóa 1.2.2 Quá trình phản nitrat hóa 1.2.3 Quá trình cố định nitơ phân tử 1.3 Tổng quan vi khuẩn cố định nitơ 10 1.3.1 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium 11 1.3.2 Vi khuẩn cố định nitơ tự 12 1.4 Công nghệ nano ứng dụng công nghệ nano nơng nghiệp 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 1.5 Ảnh hưởng hạt nano sắt, đồng, coban đến sinh trưởng phát triển đậu tương 20 1.5.1 Ảnh hưởng coban .20 1.5.2 Ảnh hưởng sắt 21 1.5.3 Ảnh hưởng đồng .23 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 25 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu .25 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu .25 2.2.3 Thời gian nghiên cứu 26 2.2.4 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1 Phương pháp phân lập .26 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học 27 2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số nhân gen phản ứng PCR .29 2.3.4 Phương pháp định danh chủng Rhizobium 29 2.3.5 Đánh giá tác động nano Fe, Cu Co đến sinh trưởng chủng Rhizobium 30 2.3.6 Phương pháp xác định định lượng polysaccharide UV-VIS 30 2.3.7.Đánh giá ảnh tác động nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trưởng phát triển đậu tương phịng thí nghiệm nghiệm 31 2.3.8 Pháp xác định hoạt tính cố định nitơ vi khuẩn nốt sần họ đậu 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Nghiên cứu phân lập mô tả số chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh đậu tương Rhizobium sp Thanh Trì Thanh Hóa 33 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh đậu tương khu vực Thanh Trì Thanh Hóa 33 3.1.2 Mô tả số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập 35 3.1.3 Đặc điểm sinh học chủng TT14 phân tích trình tự gen 16S- rDNA 39 3.1.4 Phân tích trình tự gen 16S - rDNA chủng TT14 44 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng nồng nộ nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn cố định đạm Rhizobium đậu tương phịng thí nghiệm 46 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nano kim loại Fe đến khả sinh trưởng sinh polysaccharite chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 46 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nano kim loại Cu đến khả sinh trưởng sinh polysaccharite chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 49 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nano kim loại Co đến khả sinh trưởng sinh polysaccharite chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 52 3.3 Ảnh hưởng nano kim loại đến khả sinh trưởng đâu tượng điều kiện phịng thí nghiệm 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ APO: Asiaa Productivity Organization CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA: Acid Deoxyribonucleic Fe-NP: Fe Nanoparticles Kb : Kilobase NPAg: Nanoparticles Ag NPCu: Nanoparticles Cu NP: Nanoparticles PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris Acetate EDTA SEM: Scaning Lectron Microscope SPT: Hạt siêu phân tán hay hạt nano YEM-Fe-NP : Yeast Extract Mannitol Fe Nanoparticles YEM-Cu-NP : Yeast Extract Mannitol Cu Nanoparticles YEM-Co-NP : Yeast Extract Mannitol Co Nanoparticles YEMA-CR: Yeast Extract Mannitol Agar Congo Red DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2011-2016 Bảng Các chủng vi khuẩn phân lập mơi trường YEMA-CR Thanh Trì Thanh Hóa 33 Bảng Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nốt sần phân lập Thanh Trì 36 Bảng 3 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nốt sần phân lập Thanh Hóa 37 Bảng Định danh chủng phân lập 38 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng TT14 .40 Bảng Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng vi khuẩn TT14 41 Bảng Đặc điểm sinh học chủng TT14 42 Bảng Mức độ tương đồng di truyền chủng TT14 với lồi vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide gen 16S rDNA 45 Bảng 3.9 Kết đo hoạt tính cố định nito mẫu điều kiện phịng thí nghiệm 58 DANH MỤC HÌNH Hình Đồ thị đường chuẩn glucose 31 Hình Một số hình ảnh phân lập từ nốt sần đậu tương Thanh Trì 34 Hình Một số hình ảnh phân lập từ nốt sần đậu tương Thanh Hóa 35 Hình 3 Khả sinh trưởng nhanh tạo axit môi trường YEM-BTB MT Keto-lactose sau 48 vi khuẩn TT14 36 Hình Khuẩn lạc chủng TT14 môi trường YEMA-CR (a) tế bào chủng TT14 bắt mầu Gram (-) (b) sau 24 nuôi cấy .43 Hình Khả chuyển hóa nitrat thành nitrit (a) khơng chuyển hóa gelatin (b) vi khuẩn TT14 .43 Hình Tế bào TT14 (x 3000 lần) (trái) (x 10000) (phải) 44 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR (1) sản phẩm DNA tổng số (2) TT14 gel agarose 1% M: thang chuẩn DNA 1Kb (Norgen) .45 Hình Ảnh hưởng nano kim loại Fe nồng độ khác đến sinh trưởng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 .47 Hình 10 Ảnh hưởng nồng độ nano 100, 250 500 đến sinh trưởng chủng vi khuẩn TT14 47 Hình 11 Ảnh hưởng nồng độ nano Fe đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào TT14 sau 96 48 Hình 12 Ảnh hưởng nano Fe nồng độ 250 ppm đến hình thái tế bào vi khuẩn TT14 .48 Hình 13 Ảnh hưởng nano kim loại Cu nồng độ khác đến sinh trưởng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 .50 Hình 14 Ảnh hưởng nồng độ nano Cu đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào TT14 sau 96 51 Hình 15 Ảnh hưởng nano Cu nồng độ 50 ppm đến hình thái tế bào vi khuẩn TT14 .51 Hình 16 Ảnh hưởng nano kim loại Co nồng độ khác đến sinh trưởng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 .52 Hình 17 Ảnh hưởng nồng độ nano Co đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào TT14 sau 96 53 Hình 18 Ảnh hưởng nano kim loại đến sinh trưởng đậu tương phịng thí nghiệm .54 Hình 19 Ảnh hưởng nano kim loại vi khuẩn cố định đạm TT14 đến sinh trưởng số lượng nốt sần đậu tương 55 Hình 3.20 Đậu tương khơng xử lý nano: khơng bổ sung vi khuẩn (a), có bổ sung vi khuẩn T14 (b) 56 Hình 3.21 Đậu tương xử lý nano Fe ppm 250 ppm 56 Hình 3.22 Đậu tương xử lý nano Cu ppm 25 ppm 57 Hình 3.23 Đậu tương xử lý nano Co 2ppm 100 ppm 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Lê Quốc Hưng, (2007), “Phát triển đậu tương - Tiềm lớn”, Tạp chí NN & PTNT, 73-74 Ngơ Thế Dân công sự, (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Viết công sự, (2002), Kỹ thuật trồng số giống lạc đậu tương đất cạn miền núi, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Văn Thiều, (2006), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Trần Đình Long, (1994), Kết khu vực hoá giống đậu tương M103 vùng sinh thái khác nhau, NXB Nông Nghiệp Trần Văn Lài, (1991), Tiến kỹ thuật trồng lạc, đậu đỗ Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, (2009), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Ngô Thế Dân, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Kim Vũ, Phân vi khuẩn nốt sần cách sử dụng cho đậu đỗ, Nhà xuất Nơng nghiệp Phạm Bích Hiên Phạm Văn Toản (2003), Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức năng, Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 10 Nguyễn Xuân Trường, (2005), Phân bón vi lượng siêu vi lượng, tr 71-72  Tài liệu tiếng Anh 11 Abdel Wahap, A M., and P.F Wareing (1980), “Nitrogenase activity associated with the rhizosphere of inoculation of seedings with Azotobacter”, New Phytol, 84, p.711-721 12 Anton Hartmann and Jose Ivo Baldani, (2006), “The genus Azospirillum”, Prokaryote, P.115-140 61 13 Aurag, J and Sasson, A, (1992), “Tolerance of Rhizobium leguminosarum by Phaseoli to acidity and drought”, World J Microbiol Biotechnol, 8, p.532535 14 Berahmand A., Panahi A.G., Sahabi H., (2012), “Effect of sliver nanoparticles and magnetic field on growth of fodder maize”, Biol Trace Elem, Res 149, pp 419 - 424 15 Bernaerts MJ, Deley JA, (1963), “Biochemical test for crown gall bacteria Nature”, 197, pp.406-407 16 B-R Chandrasekar, G Ambrose and N Jayabalan, (2005), “Influence of biofertillizers and nitrogen soure level on the growth and yield of Echoniochloa frumentacea (roxb)”, Journal of Agricultural Technology, Vol 1, No.2, pp 223 – 234 17 Churilov, G I, (2010) “Nano-Crystal Metals Effect on Ecologic-Biological State of Soil and Biologically Active Compounds Accumulation in Plants”, Herald of Russian University of Nations Friendship Series Ecology and Life Safety, 1, p.18-23 18 D.J Burke, N Pietrasiak, S.F Situ, E.C Abenojar, M Porche, P Kraj, Y Lakliang and A.C.S Samia, (2015) “Iron Oxide and Titanium Dioxide Nanoparticle Effects on Plant Performance and Root Associated Microbes”, Int J Mol Sci, 16, pp.23630-23650 19 Dan H Jone, (1920), “Furth studies on the growth cycle of Azotobacter”, Journal of Bacteriology, Vol 5, No pp 325-341 20 Dhamangaonkar Sachin N, (2009), “Effect of Azobacter chroococcum (PGPR) on the growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and Maise (Zea mays) plants”, Biofrontier, Vol 1, Issue 1, pp 24-31 21 Dhoke, Shailesh K.; Mahajan, Pramod; Kamble, Rajashri; Khanna, Anand, (2013), “Effect of nanoparticles suspension on the growth of mung (Vigna radiata) seedlings by foliar spray method”, Nanotechnology Development, Vol 3, Issue 1, pp 1-5 62 22 El Sheikh EAE and Wood M., (1989), “Response with of Chickpea and specifc ion effects of salts”, Soil Biol Biochemistry, 21, pp 889-985 23 El-Temsah Y.S, Joner E.J., (2012), “Impact of Fe and Ag nanoparticles on seed germination and differences in bioavailability during exposure in aqueous suspension and soil”, Environ Toxicol, Volume 27, Issue 1, Pp 42-49 24 Evans H.J, Kliewer M, (1964), “Vitamin B12 compounds in relation to the requirement of cobalt for higher plants and nitrogen-fixing organisms”, Annal of New York Acad Sci, pp.735-755 25 G.V Mali and M.G Bodhankar, (2009), “Antifungal and phytohormone production potential of Azotobacter chroococcum isolates from Groundnut (Arachis hypogeal L.)”, Asian J.exp Sci, Vol.23, No 1, pp.293-297 26 Gonzales-Melendi et al., (2008), “Nanoparticles as smart treatment-delivery systems in plan”, Annal of Botany, 101, pp.187-195 27 Hashem F D., Swelim D M., Kuykendell L D., Mohamed A I., AbdelWahab S M.And Hegazi N I, (1998), “Identifcation and characterization of salt tolerant Leuceana- nodulation Rhizobium strains”, Biol Fertilizers Soil, 27, pp 353-341 28 Hofer AW, (1935), “Method for distinguishing between legume bacteria and their most common contaminant”, J Amer Soc Agron, 27, pp 228-230 29 Kaliyamoorthy Jayakumara, Packirisamy Vijayarengana, Zhao Changxing, M Gomathinayagama, Cheruth Abdul Jaleel, (2008), “Soil applied cobalt alters the nodulation, leg-haemoglobin content and antioxidant status of Glycine max (L.) Merr”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Volume 67, Issue 2, pp 272-275 30 King EO, Ward MK, Raney DE, (1954), “Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin”, J Lab Clin Med 44: PP 301-307 31 Kleczkowska J, Nutman PS, (1968), “The identification and classification of rhizobia”, Identification methods for microbiologists Part B ed Gibbs BM and Shapton DA, Academic press, 51 63 32 Kovalenko, L.V and Folmanis, G.E., (2006), “Biologicheski aktivnye nanoporoshki zheleza”, Biologically Active Iron Nanopowders Nauka Moscow 33 Lee et al, (2008), “Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolus radiatus) and wheat (Triticum aestivum) plant agar test for water-insoluble nanoparticles”, Environ Toxicol Chem, 27, pp 1915-1921 34 LiU Xiu-mei, ZHANG Fu-dao, FENG Zhao-bin, ZHANG Shu-qing, HE Xusheng, WANG Ru-fang, WANG Yu-jun, (2005), “Effects of Nano-ferric oxide on the growth and nutrients absorption of peanut”, Institute of Soil and Fertilizer, Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing, China 35 Lu, C.M., Zhang, C.Y., Wen, J.Q and Wu, G.R, (2002), “Effects of Nano Material on Germination and Growth of Soybean”, Soybean Science, 21, pp.168-171 36 M H Siddiqui, M H Al-Whaibi, F Mohammad, (2015), “Nanotechnology and Plant Sciences: Nanoparticles and Their Impact on Plants”, Springer International Publishing Switzerland 37 M R Ghalamboran, J J Ramsden, (2010), “Viability of Bradyrhizobium japanicum on Soybean Seeds Enhanced by Magnetite Nanoparticles during Desiccation”, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering (3), pp.173-178 38 Ma X., Geiser-Lee J., Deng Y., Kolmakov A., (2010), “Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and plants: Phytotoxicity, uptake and accumulation”, Science of The Total Environment, Volume 408, Issue 16, Pp 3053-3061 39 Nadia Gad, Abd El-Moez, Lyazzat K Bekbayeva, Asel A Karabayeva and Misni Surif, (2013), “Effect of Cobalt Supplement on the Growth and 64 Productivity of Soybean (Glycine max L Merril)”, World Applied Sciences Journal 26 (7), pp 926-933 40 Nair R, Varghese SH, Nair BG, Maekawa T, Yoshida Y, Kumar DS, (2010), “Nanoparticulate material delivery to plants”, Plant Sci,179, pp.154–163 41 Omid Salarpour, Soheil Parsa, Mohammad Hassan Sayyari, Majid Jami Alahmadi, (2013), “Effect of Nano-iron Chelates on Growth, Peroxidase Enzymee Activity and Oil Essence of Cress (Lepidium sativum L.)”, International Journal of Agronomy and Plant Production, Vol., (S), pp 3583-3589 42 P Kumar, U Burman, P Santra, (2015), “Effect of nano-zinc oxide on nitrogenase activity in legumes: an interplay of concentration and exposure time”, Int Nano Lett pp.191–198 43 P Mahajan, S K Dhoke, and A S Khanna, (2011), “Effect of Nano-ZnO Particle Suspension on Growth of Mung (Vigna radiata) and Gram (Cicer arietinum) Seedlings Using Plant Agar Method”, Journal of Nanotechnology, Article ID 696535, pp 1-7 44 Pavlov G V and Folmanis G E, (1999), “The Uses of Ultra Disperse Powders in Agriculture”, Monography ed L K Ernst and A M Artiushin (Moskva: Research Center for Problems of the Quality of Specialists), pp.78 45 Prasad, P Sudhakar and A P Alivisatos, (2002), “Synthesis of colloidal cobalt nanoparticles with controlled size and shape”, Topicộng in Catalysis, 19 (2), pp 145-148 46 Riley, I.T and M.J Dilworth, (1986), “Cobalt in soil and plant”, Micronutrients News and Information 47 Sah and I Belozerova, (2009), “Influence off metal nanoparticles on the soil microbial community and germination of lettuce seed”, Water, Air and Soil Pollution, 97, pp 143-148 65 48 Savithramma, S Ankanna and G Bhumi, (2012), “Effect of NPs on seed germination and seedling growth of Boswellia ovalifoliolata”, Nano Vision, Vol.2 (1,2,3), pp 61-68 49 Shraddha Bhatt, Dr.R.V Vyas, H N Shelat and Sneha J Mistry, (2013) “Isolation and Identification of Root Nodule Bacteria of Mung Bean (Vigna radiata L.) for Biofertilizer Production” International Journal of Research in Pure and Applied Microbiology 50 Singh B., Kaurand R and Singh K, (2008), “Characterization of Rhizobium strain isolated from the roots of Trigonella foenumgraecum (fenugreek)” 51 Stampoulis D, Sinha S.K, White J.C, (2009), “Assay-dependent phytotoxicity of nanoparticles to plants”, Environ Sci Technol, 43, pp 9473-9479 52 Y Ge, J P Schimel, P A Holden, (2012), “Identification of Soil Bacteria Susceptible to TiO2 and ZnO Nanoparticles”, Applied and Environmental Microbiology, 78 (18): pp 6749–6758 53 Zhu, J Han, Q Ciao, (2008), “Uptake, translocation and accumulation of manufactured iron oxide nanoparticles by pumkin plan”, J Envir Monitoring 10, pp 713-717 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 ... Thời gian nghiên cứu 26 2.2.4 Thiết bị hóa chất nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1 Phương pháp phân lập .26 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm... DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 25 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu .25 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ... 2.3.6 Phương pháp xác định định lượng polysaccharide UV-VIS Nguyên tắc: phương pháp quang phổ UV-VIS phương pháp phân tích dựa việc đo độ hấp thụ xạ đơn sắc dung dịch nghiên cứu bước sóng xác định