Khảo sát quá trình lên men bởi corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng lên men thu nhận l lysine

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN THỊ MINH TÂM Khảo sát trình lên men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng lên men thu nhận L-lysine Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2009 TÓM TẮT Đề tài: “Khảo sát trình lên men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine” Đề tài thu kết sau: Điều kiện tối ưu thu nhận L-lysine là: môi trường lên men: dịch bắp 20%, glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%, thiamine 4mg/L; điều kiện lên men: giống bổ sung 3% (chất lượng giống 2.108 tế bào/mL), pH 7.0, nhiệt độ 300C, lắc 200 vòng/phút; sản lượng L-lysine đạt là: 28 g/L tăng 5,5 lần so với khảo sát ban đầu thời gian lên men (72 giờ) Cũng với điều kiện trên, lên men fermentor tự động (khuấy đảo 300 vịng/phút, dO2 = 100%) sản lượng L-lysine đạt là: 32,6 g/L tăng gấp 1,25 lần so với điều kiện lên men theo mẻ tăng gấp 6,4 lần so với khảo sát ban đầu thời gian lên men Trong loại chất mang khảo sát (Alginate, Bacterial Cellulose phức Alginate – Bacterial Cellulose), phức chất mang Alginate – Bacterial Cellulose (A-BC) có ưu Điều kiện cố định chất mang A-BC là: dịch alginate 3% tế bào C.glutamicum đồng với mật độ 1010 tế bào/mL; BC hấp phụ dịch giống máy lắc 200 vòng/phút 30 phút; bổ sung chất hỗ trợ gel CaCl2 2%; thời gian ủ ngày, nhiệt độ ủ 300C; lượng vi khuẩn cố định phức chất mang đạt là: mật độ trung bình: 8,7.109 tế bào/g; mật độ vi khuẩn bề mặt chất mang: 4,8.104 tế bào/cm2; mật độ vi khuẩn bên chất mang: 4,2.104 tế bào/cm2 Ứng dụng chế phẩm cố định chất mang A-BC lên men thu nhận Llysine theo mẻ: số lần tái sử dụng: 12 lần, sản lượng lysine 12 lần tái sử dụng đạt 27,77 g/L không khác biệt lớn so với lên men tế bào tự (kết so sánh với phương pháp định lượng lysine đo mật độ quang, sản lượng mẫu đối chứng 28 g/L) Một phần kết công bố qua báo: Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp cố định lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật, Số 70, trang 96 -100 SUMMARY My thesis: “The survey of fermentation process by free and immobilized Corynebacterium glutamicum to uptaking L-lysine” The results are given as follows: Optimal conditions for producing L-lysine in batch: medium: maize juice 20%, glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%, thiamine 4mg/L; cultural conditions: cultural rate 3% (cultural quality 2.108 CFU/mL), pH 7.0, 300C, round - shake 200 rpm; the yield is 28 g/L raise 5,5 folds than the first survey in the same fermenting time However, the L-lysine yield, when we fermented it in automatic fermentor (agitate 300 rpm, dO2 = 100%), is 32,6 g/L raise 1,25 folds than the batch fermentation in the same fermenting time In carriers (A, BC, A-BC), the A-BC is the most advanteged carrier The optimal conditions of immobilized C glutamicum in A-BC carrier are: Alginate solution 3% and C.glutamicum cells with colony density 1010CFU/mL; BC absorbs C.glutamicum cells by round – shake 200 rpm in 30 minutes; adding CaCl2 2%; expand conditions:3 days in 300C With these conditions, the immobilized cell in the A-BC carrier is given: Medium cells density: 8,7.109 CFU/g Cells density in the surface of the carrier: 4,8.104 CFU/cm2 Cells density in the internal carrier: 4,2.104 CFU/cm2 The effect of using C.glutamicum immobilized in A-BC for producing L-lysine was high; it could be reused about 12 times and lysine yield is 27,77 g/L, the quality of L-lyine remained rather good against control experiments Some results are presented in the Journal: Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Immobilizing Corynebacterium sp cell and application for producing L-lysine”, Journal of Science & Technology, No 70, pages 96 -100 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2009 Đầu tiên, xin gởi lời cảm ơn đến Trường Đại học Bách khoa, Khoa Cơng nghệ Hóa học Bộ môn Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Con xin gởi lời tri ân đến Ba, Má nuôi dưỡng, dạy bảo từ điều nhỏ ba, má luôn chỗ dựa vững cho suốt đời Con xin chân thành cảm ơn dì Út ln ln động viên, chia sẵn sàng giúp đỡ vượt qua khó khăn sống Hai cảm ơn em (Bé ba, bốn, năm, Ý, Linh) tạo động lực giúp Hai hoàn thành tốt nhiệm vụ to lớn Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy TS Trần Viết Mỹ, người động viên, khuyến khích em theo đuổi ước mơ ln ln bảo em em gặp khó khăn học tập sống Xin gởi lời cảm ơn đến Thầy TS Nguyễn Quốc Bình Thầy khác dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu suốt trình học tập nghiên cứu trường Đại học Bách khoa Xin cảm ơn Thầy cô môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn bạn Lê Thị Chi ln ln bên cạnh tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Đại học bách khoa Bạn Chi giúp đỡ nhiều học tập, lẫn tinh thần Xin cảm ơn người bạn học tập, trao đổi, động viên sẵn sàng giúp đỡ cần thiết Cuối cùng, tơi xin cảm ơn anh “Rịm” ln đặt niềm tin tôi, động viên, giúp đỡ điểm tựa cho suốt thời gian qua Trần Thị Minh Tâm Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2009 Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thúy Hương Người giúp đỡ nhiều từ ngày bước chân vào trường Cô giúp tự tin để bắt đầu bước vào lĩnh vực mới, chuyên ngành dấu ngoặc chuyên môn thay đổi từ ngày gặp Trong suốt q trình học tập trường, cô tạo cho nhiều hội để phát huy khả mình, khắc phục điểm yếu thân Cô giúp xây dựng phương hướng, mục tiêu hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho tơi suốt q trình nghiên cứu trường Từ khái niệm sơ khai có được, cô giúp nắm bắt kịp bạn bè Cô giành nhiều thời gian cho tôi, giúp tơi viết báo, đăng báo giúp tơi hồn thành luận văn Khơng chun mơn, cịn người mẹ, người bạn Cô động viên, chia sẽ, giúp tơi vượt qua hồn thành nhiệm vụ tốt Tôi phải viết để bày tỏ lòng biết ơn xứng đáng cho dành cho tơi Tất tơi khắc ghi trái tim bé nhỏ Khắc ghi mãi Tôi xin hứa chăm lo học tập xây dựng cho riêng hướng mong ước Tơi cố gắng hồn thiện mình, hồn thiện cách học tập, cách sống cách để chia Một lần nữa, xin chân thành biết ơn cô – TS Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Minh Tâm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ HÓA HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRẦN THỊ MINH TÂM Giới tính : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : Nơi sinh : Quảng nam 30/ 08/ 1983 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV: 0310.7771 Khoá (Năm trúng tuyển) : 2007 1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát trình lên men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực theo mục tiêu nghiên cứu, thiết lập thí nghiệm tối ưu để thu sản lượng lysine cao nhất, ứng dụng lên men fermentor tế bào tự chế phẩm cố định Nội dung nghiên cứu bao gồm: Khảo sát điều kiện tối ưu lên men thu nhận lysine Ứng dụng điều kiện tối ưu lên men fermentor Khảo sát điều kiện cố định tế bào số chất mang Ứng dụng chế phẩm cố định lên men điều kiện tối ưu theo mẻ 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 6/2008 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 8/2009 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CB HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUN NGÀNH (Họ tên chữ ký) CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Cán hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG - Cán chấm nhận xét 1: - Cán chấm nhận xét 2: - Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …… tháng …… năm …… Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN THỊ MINH TÂM Khảo sát trình lên men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng lên men thu nhận L-lysine Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 1.1.1 Lịch sử phân loại 1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn C glutamicum 1.1.3 Đặc điểm di truyền vi khuẩn C glutamicum 1.1.4 Sự chuyển hóa vật chất C glutamicum 1.2 AMINO ACID LYSINE .6 1.2.1 Giới thiệu 1.2.2 Đặc điểm 1.2.3 Sinh tổng hợp L-lysine 1.2.3.1 Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine 1.2.3.2 Quá trình tổng hợp điều hòa sinh amino acid lysine .8 1.2.4 Lên men thu nhận L-lysine 10 1.2.4.1 Ảnh hưởng chủng sản xuất 10 1.2.4.2 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng 12 1.2.4.3 Ảnh hưởng số điều kiện ngoại cảnh 12 1.2.4.4 Kỹ thuật lên men thu nhận amino acid lysine 13 1.3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT 14 1.3.1 Định nghĩa cố định tế bào vi sinh vật 14 1.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 14 1.3.2.1 Phân loại phương pháp cố định tế bào 14 1.3.2.2 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật 15 1.3.3 Những chất mang sử dụng liên quan đến đề tài 16 1.3.3.1 Chất mang Alginate 16 1.3.3.2 Chất mang Bacterial Cellulose (BC) 17 1.4 BẢO QUẢN VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 18 1.4.1 Khái niệm phương pháp 18 1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng tới khả sống sót vi sinh vật q trình sấy khơ 20 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 21 1.5.1 Những nghiên cứu nước 21 1.5.2 Những nghiên cứu nước 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HĨA CHẤT, MƠI TRƯỜNG 27 2.1.1 Giống vi sinh vật 27 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 27 2.1.3 Vật liệu, hóa chất 28 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 28 2.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 28 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30 2.3.1 Kiểm tra chọn giống 30 2.3.2 Tối ưu điều kiện lên men 31 2.3.2.1 Khảo sát điều kiện lên men 31 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon 32 2.3.2.3 Tối ưu thành phần môi trường phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33 2.3.3 Khảo sát điều kiện lên men fermentor 35 2.3.4 Tăng hiệu suất lên men phương pháp cố định tế bào 36 2.3.4.1 Cố định tế bào chất mang Alginate : phương pháp nhốt 36 2.3.4.2 Cố định tế bào chất mang Bacterial Cellulose (BC): phương pháp bẫy – bẫy hấp phụ 37 2.3.4.3 Cố định phức chất mang A - BC 38 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp cố định lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật, Số 7, trang 96 – 100 Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng việt Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, Di truyền phân tử, NXB Nơng nghiệp, Hồ Chí Minh, 2004: 414-425 Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004 Nguyễn Thùy Châu: Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm acid amin enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp hải sản quy mô bán công nghiệp, Đề tài KHCN cấp nhà nước, Hà nội, (2006): 154 -165 Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2001: 239-267 Nguyễn Thuý Hương, Một số ứng dụng cellulose vi khuẩn lĩnh vực thực phẩm, Tạp chí sinh học, 30 (1) (2008): 62 -69 Nguyễn Duy Lâm Trần Thị Mai, Phát triển công nghệ sản xuất ứng dụng số chể phẩm sinh học bảo quản chế biến kiểm tra chất lượng sản phẩm, Hội thảo ứng dụng phát triển công nghệ, Bộ khoa học công nghệ, 2008 Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp tập 1, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2006 Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2006 Nguyễn Đức Lượng, Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 1, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2003 10 Nguyễn Đức Lượng cs., Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2006 11 Hồng Thuỷ Long, Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, NXB Văn hoá, Hà nội, 1991 12 Lê Thanh Mai cs., Các phương pháp phân tích nghành cơng nghệ lên men, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, 2004 Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 13 Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng, Vi sinh tổng hợp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, 1980 14 Vũ Kim Thoa cs., Phân lập tuyển chọn số chủng Corynebacterium sp có khả sản xuất L-lysine, Hội nghị Cơng nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội (2003): 381 - 383 15 Nguyễn Thị Thu Vân, Phân tích định lượng, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004 16 Nguyễn Thị Thu Vân cs., Thí nghiệm phân tích định lượng, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2006 Tài liệu tham khảo tiếng nước 17 Andreas Burkovski, Corynebacteria: Genomics and Molecular Biology, Caiseter Academic Press, Germany, 2008 18 Andreas Burkovski Kramer, Lysine excretion by Corynebacterium glutamicum, Eur.J.Biochem., 202 (1) (1991): 137-143 19 Costa –Riu, Burkovski, Kramer Benz, PorA represents the major cell wall channel of the Gram – positive bacterium Corynebacterium glutamicum, J Bacteriol., 185 (2003): 4779 – 4786 20 Cheetham cs., Physical studies on cell immobilization using Calcium alginate gels, Biotechol Bioeng., 21 (12) (2004): 2155 – 2168 21 De Graaf Aa, Eggeling L, Sahm H (2001), Metabolic engineering for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum, Adv Biochem Eng Biotechnol., 73 (2001): – 29 22 Dieter J Reinscheid, Bernhard J Eikmanns, and Hermann Sahm, Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase, J Bacteriol., 173 (10) (1991): 3228-3230 23 Ehab Taqieddin, Carolyn Lee and Mansoor Amij, Perm-selective chitosanalginate hybrid microcapsules for enzyme immobilization technology, Official J ISPE, 22 (6) (2002) Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 24 Georgi T, Rittmann D, Wendisch VF, Lysine and glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and sucrose: roles of malic enzyme and fructose-1,6-bisphosphatase, Metab Eng., (4) (2005): 291 – 301 25 Georg Sindelar Volker F Wendisch, Improving lysine production by Corynebacterium glutamicum through DNA microarray-based identification of novel target genes, Appl Microbiol Biotechnol., 76 (2007):677–689 26 Gordon F Bickertaff, Immobilization of enzymes and cells, Humana Press Inc, New Jersey, (1997) 27 Gunji Y, Yasueda H , Enhancement of L-lysine production in methylotroph Methylophilus methylotrophus by introducing a mutant lysE exporter, J Biotechnol., (2006): 126 – 132 28 Hayashi M cs., A leuC mutation leading to icreased L-lysine production and rel-independent global epressing changes in Corynebacterium glutamicum, Appl Microbiol Biotechnol., 37 (2006): 566 – 571 29 Hiroaki Motoyama cs., Overproduction of L-lysine from methanol by Methylobacillus glycogenes derivatives carrying a plasmid with a mutated dapA gene, Appl Environ Microbiol., 67 (7) (2001): 3064–3070 30 Imaizumi A, Takikawa R, Koseki C, Usuda Y, Yasueda H, Kojima H, Matsui K, Sugimoto S, Improved production of L-Lysine by disruption of stationary phasespecific rmf gene in Escherichia coli, J Biotechnol., 117 (1) (2005): 111 – 118 31 I A Ekwealor1 and J A N Obeta2, Studies on Lysine production by Bacillus megaterium, African J Biotechnol., (7) (2005): 633-638 32 Jetten MS, Follettie MT, Sinskey AJ, Effect of different levels of aspartokinase on the Lysine production by Corynebacterium lactofermentum, Appl Microbiol Biotechnol., 43 (1) (1995): 76 – 82 33 Jose Luis Barredo, Microbial Processes and Products, R&D Biology Antibioticos S A Press, Leon Spain, 2005: 179 – 190 34 Josef Cremer, Lothar Eggeling, Hermann Sahm, Control of the Lysine biosynthesis sequence in Corynebacterium Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 glutamicum as analyzed by overexpression of the individual corresponding genes, Appl Environ Microbiol., 57 (6) (1991): 746-1752 35 Judith Becker, Christoph Wittmann cs., Metabolic flux engineering of Llysine production in Corynebacterium glutamicum over expression and modification of G6P dehydrogenase, J Biotechnol., 132(2) (2007): 99-109 36 Kalinowski cs., The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins, Elsevier J Biotech., 104 (22) (2003):5–25 37 Kiefer, Elmar Heinzle, Oskar Zelder, and Christoph Wittmann, Comparative metabolic flux analysis of Lysine producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose, Appl Environ Microbiol., (2004): 229 – 239 38 Kutzner H, Sonnen H, Thierbach G, Kautz S, Kalinowski J, Schneider J, Puhler A, Characterization of pGA1, a new plasmid from Corynebacterium glutamicum LP-6, J Bacteriol., 107(1) (1991): 69 – 74 39 Ko YT, Chipley JR, Role of biotin in the production of Lysine by Brevibacterium lactofermentum, Microbiol., 40 (161 -162) (1984): 161 -171 40 Krystynowicz A, Craja W, Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose, Industrial Microbiol Biotechnol., 29 (2002): 189 – 195 41 Lothar Eggeling and Hermann Sahm,The cell wall barrier of C.glutamicum amino acid efflux, J.Biosci Bioeng 92 (3) (2001): 201 – 213 42 Lothar Eggeling and Hermann Sahm, New ubiquitous translocators: acid amino export from Coryebacterium glutamicum and E.Coli, Arch Microbiol 180 (3) (2003): 155 – 160 43 Lothar Eggeling and Michael Bott, Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, the United States of America, 2005 44 Lee KY, Survivalof Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution, Appl Environ Microbiol., 66 (2000); 869 -873 Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 45 Masato Ikeda, Amino Acid Production Processes, Adv Biochem Eng Biotech., 79 (2003): 2- 31 46 Moss ML, Frey PA, Activation of Lysine 2,3- aminomutase by Sadenosylmethionine, J Biol Chem., 265 (30) (1990): 18112 -18115 47 Miroslav Patek, cs., Leucine Synthesis in Corynebacterium glutamicum: Enzyme Activities Structure of leuA, and Effect of leuA Inactivation on Lysine Synthesis, Appl And Environ Microbiol., 60 (1) (1994) :133-140 48 Ohnishi J, Hayashi M, Mitsuhashi S, Ikeda M, Efficient 40 degrees C fermentation of L-Lysine by a new Corynebacterium glutamicum mutant developed by genome breeding, Appl Microbiol Biotechnol., 62 (1) (2003): 69 -75 49 Ohnishi J, Ikeda M, Comparisons of potentials for L-Lysine production among different Corynebacterium glutamicum strains, Biosci Biotechnol Biochem., 70 (4) (2006): 1017 -1020 50 Ohnishi J, Katahira R, Mitsuhashi S, Kakita S, Ikeda M, A novel gnd mutation leading to increased L-Lysine production in Corynebacterium glutamicum, FEMS Microbiol., 242 (2) (2005): 265 -274 51 Pelechová J, Smékal F, Koura V, Pkachý, Krumphanzl V, Biosynthesis of LLysine in Corynebacterium glutamicum on sucrose, ethanol and acetic acid, Folia Microbiol (Paraha), 25 (4) (1980): 341 -346 52 Peter F Stanbury, Allan Whitaker, Stephen J Hall, Principles of fermentation Technology, Butterworth Heinemann Press, Great Britain, 2003 53 Savas Anastassiadis, L-lysine fermentor, Biotechnol., (2007): 11 -24 54 Sen SK, Chatterjee M, Chatterjee SP, Lysine production from hydrocarbon by Micrococcus varians 2Fa, Acta Microbiol Pol., 32 (2) (1983): 139 -145 55 Sindelar G, Wendisch VF, Improving Lysine production by Corynebacterium glutamicum through DNA microarray-based identification of novel target genes, Appl Microbiol Biotechnol., 76 (3) (2007): 677 -689 56 She TY, Microentrapment of Lactobacilus in calcium alginate gel, Food science, 54 (1999): 557 – 561 Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 57 Su YC, Hwang SM, Huang JH, Lysine production by Brevibacterium divaricatum NTU-2 and its recovery from the fermentation broth, Article in Chinese., 23 (3) (1990): 201 -210 58 Tateno T, Fukuda H, Kondo A, Production of L-Lysine from starch by Corynebacterium glutamicum displaying alpha-amylase on its cell surface, Appl Microbiol Biotechnol., 74(6) (2007): 1213 -1220 59 Tsujimoto N, Gunji Y, Ogawa-Miyata Y, Shimaoka M, Yasueda H, L-Lysine biosynthetic pathway of Methylophilus methylotrophus and construction of an LLysine producer, J Biotechnol., 124 (2) (2006): 327 – 337 60 Udo Mueller, Susanna Huebner, Economic Aspects of Amino Acids Production, Adv Biochem Eng Biotech.,Germany, (79) (2003): 139 -168 61 Vogel I, A text book of quantitative inorganic analysis, Longmans, Green and Co Ltd, London, 1968 62 Walter Pfefferle, Bettine Mockel, Brigitte Bathe, Achim Marx, Biotechnological Manufacture of Lysine, Adv Biochem Eng Biotech.,Germany, (79) (2003): 60 107 63 Yoshiya Gunji, Hisao Ito, Haruhiko Masaki, Hisashi Yasueda, (2006), Characterization of a Unique Mutant lysE Gene, Originating from Corynebacterium glutamicum, encoding a Product that Induces L-Lysine Production in Methylophilus methylotrophus, Biosc Biotech Biochem., 70 (12) (2006): 2927 – 2934 Tài liệu tham khảo trang web 64 http://wishart.biology.ualberta.ca/BacMap/cgview_linked_maps/NC_003450/pn g/1_1.png, truy cập ngày 16/07/2009 http://www.3dchem.com/molecules.asp?ID=55#, truy cập ngày 16/07/2009 Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL PHỤ LỤC MỘT SỐ ĐƯỜNG CHUẨN DÙNG TRONG ĐỀ TÀI Phụ lục 1.1 Đường chuẩn tương quan OD sinh khối khô Tiến hành nuôi cấy C.glutamicum môi trường nhân giống, lắc 200 vòng/phút, pH = 7.0, nhiệt độ nuôi cấy 280C thu sinh khối sau 24 Ly tâm sinh khối 5000 vịng/phút 15 phút Sấy khơ sinh khối đến khối lượng không đổi, cân trọng lượng sinh khối khơ Tiến hành pha lỗng sinh khối khơ, so màu bước sóng 660 nm cho giá trị OD 660nm nhận nằm giới hạn 0,005 đến 0,85 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm số y = f(x), với y OD 660 nm, x sinh khối khô (g/L) g/L Đồ thị phụ lục 1.1 Đường chuẩn sinh khối khô OD 660nm Trang PL2 Phụ lục 1.2 Đường chuẩn tương quan OD Lysine Tiến hành pha loãng lysine tinh khiết nồng độ pha loãng khác nhau, thực phản ứng màu với Ninhydrin đo độ hấp thu bước sóng 560 nm Vẽ đồ thị xác định hàm mục tiêu y = f(x), đó, y giá trị OD 560 nm; x lượng lysine dịch (g/L) y = 0.0092x + 0.1151 OD 560nm R = 0.9849 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 g/L Đồ thị phụ lục 1.2 Đường chuẩn lysine OD 560 nm Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL3 PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH BƯỚC SÓNG SO MÀU ĐỊNH LƯỢNG LYSINE TRONG MẪU Chuẩn bị mẫu lysine chuẩn pha loãng nồng độ g/L Tiến hành màu với thuốc thử Ninhydrin Sử dung máy UV-Vis dị tìm bước sóng hấp thu lysine Xây dựng đồ thị thiết lập hàm mục tiêu y  f ( ) với y giá trị OD,  (nm) bước sóng hấp thu OD 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 500 530 560 590 620 650 680 Bước sóng (nm) Đồ thị phụ lục Đường cong tương quan bước sóng với giá trị OD mẫu lysine chuẩn nồng độ g/L Dựa vào đường cong, xác định bước sóng 560 nm lysine hấp thu cao Các thí nghiệm kiểm tra định lượng lysine phương pháp mật độ quang đo độ hấp thu bước sóng Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL4 PHỤ LỤC GIỚI THIỆU BỘ KIT GC EZ FASST (Đính kèm trang bên) Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL5 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG LYSINE TRONG MẪU LÊN MEN FERMENTOR (dO2 100%, khuấy 300 vịng/phút, thời điểm 72 lên men) (Đính kèm trang bên) Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL6 PHỤ LỤC SẢN LƯỢNG LYSINE SAU MỖI LẦN TÁI SỬ DỤNG LÊN MEN CỦA CÁC CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH Mẫu đối chứng lên men tế bào tự sản lượng lysine (định lượng phương pháp đo mật độ quang phịng thí nghiệm): 28 g/L Số lần tái sử dụng Sản lượng lysine (g/L) Chất mang Alginate Chất mang BC Chất mang A - BC 28 28 28 27,8 28,2 28,3 27,5 28,1 28,2 22 28 28,1 17,8 27,8 28,1 x 27,7 28 x 26,7 27,9 x 26,3 27,8 x 22,1 27,9 10 x 16,8 27,5 11 x x 27 12 x x 26,4 13 x x 23,6 14 x x 21 Ghi chú: x không tiếp tục tái sử dụng Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 Trang PL7 PHỤ LỤC BẢNG TỶ LỆ RỬA TRÔI TẾ BÀO SAU TÁI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM CỐ ĐỊNH TRÊN CÁC CHẤT MANG LÊN MEN THU NHẬN LYSINE Chất mang Alginate Chất mang BC Chất mang BC Số lần tái Tế bào rửa trôi Tế bào rửa trôi Tế bào rửa trôi sử dụng (x 108CFU/mL) Tỷ lệ rửa trôi (%) Tỷ lệ rửa trôi (%) Tỷ lệ rửa trôi (%) (x 10 CFU/g) (x 108 CFU/g) Nước rửa lần Nước rửa lần 2,7 1,1 3,8 4,2 4,9 3,4 3,9 5,5 2,3 7,8 9,5 11,0 7,8 9,0 12,2 6,1 18,3 11 12,8 9,3 10,7 24 11 35 12,9 15,0 10 11,5 35 15 50 14,5 16,9 12,1 13,9 X X X 16,3 19,0 14,7 16,9 X X X 19 22,1 15,6 17,9 X X X 21,5 25,0 16,5 19,0 X X X 24 27,9 17,4 20,0 10 X X X 27,3 31,7 18,2 20,9 11 X X X X X 19,2 22,1 12 X X X X X 20 23,0 13 X X X X X 24,3 27,9 14 X X X X X 30,5 35,1 Ghi chú: X không tiếp tục tái sử dụng Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: TRẦN THỊ MINH TÂM Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 30 – - 1983 Nơi sinh: Quảng nam Tạm trú: Số nhà 33B, đường Vinh Sơn Liêm, P 12, Q Tân Bình, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: +84 66 560 941 Email: mita_bio308@yahoo.com +84 510 219 685 +84 933 400 049 Quá trình rèn luyện, lao động học tập từ năm 2006 đến nay: Tháng 11/ 2006: tốt nghiệp trường Đại học Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh, chun ngành Cảnh quan kỹ thuật Hoa viên Tháng 9/ 2007: trúng tuyển cao học trường Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh, chuyên ngành Công nghệ Sinh học ... Đề tài: ? ?Khảo sát q trình l? ?n men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L- lysine? ?? Đề tài thu kết sau: Điều kiện tối ưu thu nhận L- lysine l? ?: môi trường l? ?n men: dịch... bơm vào bình l? ?n men từ 0,12 – 0,2/phút /l? ?t mơi trường l? ?n men [53] 1.2.4.4 Kỹ thu? ??t l? ?n men thu nhận amino acid lysine Quá trình l? ?n men thu nhận thu nhận sản phẩm bậc hai từ vi khuẩn l? ?n men. .. q trình sản xuất lysine quy mô l? ??n, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Khảo sát trình l? ?n men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L- lysine? ?? Nội dung đề tài: Khảo sát