Khảo sát khả năng phân hủy cellulose và sinh enzyme cellulase của nấm trichoderma sp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN LÊ MINH GIÀU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE VÀ SINH ENZYME CELLULASE CỦA NẤM Trichoderma sp ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Long xuyên, tháng 11 năm 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN LÊ MINH GIÀU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE VÀ SINH ENZYME CELLULASE CỦA NẤM Trichoderma sp ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC An giang, ngày tháng năm 2012 BAN GIÁM HIỆU An giang, ngày tháng năm 2012 BAN LÃNH ĐẠO KHOA An giang, ngày tháng năm 2012 CHỦ NHIỆM ĐỂ TÀI An giang, ngày tháng năm 2012 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Lê Minh Giàu Long xuyên, tháng 11 năm 2011 i Lời Cảm Tạ Để đề tài hồn thành tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý thầy cô, anh chị bạn bè vật chất tinh thần Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tất người Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Chương hết lịng tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn anh chị phịng thí nghiệm Khoa Nơng Nghiệp Tài Ngun Thiên Nhiên anh chị khối nghành Công nghệ Sinh Học tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian em tiến hành nghiên cứu viết báo cáo đề tài Cảm ơn bạn Lê Quốc Bảo tập thể bạn lớp DH9SH ủng hộ giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học Xin cảm ơn tất người lòng ! An Giang, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Lê Minh Giàu i TÓM LƯỢC Nấm Trichoderma sp có khả phân hủy cellulose sinh enzyme cellulase tốt Vì việc sử dụng nấm Trichoderma sp phân bón lựa chọn tốt vừa bảo vệ trồng, tăng thêm thu nhập, giảm chi phí đầu tư bảo vệ mơi trường Đề tài tiến hành nghiên cứu khảo sát khả phân giải cellulose sinh enzyme cellulase số dòng nấm Trichoderma sp thí nghiệm: - Khảo sát khả sinh phân hủy cellulose phương pháp xác định hàm lượng % cacbon, nitơ tỷ lệ C/N (cacbon/nitơ) theo thời gian mẫu có chủng dịng nấm Trichoderma sp - Khảo sát khả sinh enzyme cellulase phương pháp đo gián tiếp hàm lượng % cacbon theo thời gian mẫu có chủng dịng nấm Trichoderma sp vừa chọn Đề tài thực đánh giá tổng qt tất dịng Trichoderma sp có khả phân giải cellulose sinh enzyme cellulase tốt Qua khảo sát chọn dịng nấm có khả phân giải cellulose sinh enzyme cellulase tốt dòng chọn để khảo sát dịng Trichoderma sp mật số 106 (T1-1) dòng Trichoderma sp mật số 108 (T3-3) Vì cần khảo sát thêm nhiều dòng nấm Trichoderma sp khác nhân lên với số lượng lớn để sản xuất phân sinh học bón cho trồng, tăng thêm thu nhập, bảo vệ môi trường ii MỤC LỤC Nội dung Trang Lời Cảm Tạ i Tóm Lược ii Mục Lục iii Danh sách hình vi Danh sách bảng: vii Các từ viết tắt viii Chương 1:Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài Chương 2: Lược Khảo Tài Liệu 2.1 Khái quát chung nấm Trichoderma sp 2.1.1 Sơ lược nấm Trichoderma sp 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm sinh học 2.1.4 Đặc điểm hình thái phân bố 2.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm Trichoderma sp 2.1.5.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến nấm Trichoderma sp 2.1.5.1.1 Ẩm độ 2.1.5.1.2 Nhiệt độ 2.1.5.1.3 Áp suất thẩm thấu 2.1.5.1.4 Các tia xạ 2.1.5.1.5 Độ pH 2.1.5.1.6 Ảnh hưởng hóa chất bảo vệ thực vật lên nấm Trichoderma sp 2.2 Giới thiệu vài nét sơ lược bắp 2.2.1 Yêu cầu dinh dưỡng khoáng bắp 2.2.1.1 Nhu cầu sinh thái 2.2.1.2 Đặc điểm dinh dưỡng khoáng bắp iii 2.3 Cellulose 10 2.3.1 Cấu tạo Cellulose 10 2.3.2 Tính chất vật lý 12 2.3.3 Tính chất hóa học 12 2.3.4 Một số trạng thái 13 2.4 Tổng quan enzyme cellulase 13 2.4.1.Khái niệm 13 2.4.2 Nguồn gốc 14 2.4.3 Phân loại theo chế xúc tác 15 Chương 3: Phương Tiện Phương Pháp Nghiên Cứu 17 3.1 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 17 3.1.1 Vật liệu 17 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 17 3.1.3 Hóa chất 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.2 Nội dung bố trí thí nghiệm 18 3.2.2.1 Chọn lọc dòng Trichoderma sp có khả phân huỷ Cellulose vượt trội 18 3.2.2.2 Khảo sát khả sinh enzyme cellulase dòng Trichoderma sp vừa phân lập 20 Chương 4: Kết Quả Thảo Luận 23 4.1 Kết khảo sát khả phân hủy cellulose 23 4.1.1 Kết khảo sát hàm lượng cacbon sau chủng nấm Trichoderma sp 23 4.1.2 Kết khảo sát hàm lượng nitơ sau chủng nấm Trichoderma sp 24 4.1.3 Kết khảo sát tỉ lệ C/N sau chủng nấm Trichoderma sp 25 4.2 Kết khảo sát khả sinh enzyme cellulse 26 Chương 5: Kết Luận Kiến Nghị 28 5.1 Kết luận 28 5.2 Kiến nghị 28 Tài Liệu Tham Khảo 29 Phụ chương A Phương pháp phân tích 31 iv Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 31 Xác định chất hữu phương pháp Walkley-Black 31 Phụ chương B Kết Quả Chạy Thống Kê 32 Tuần 32 Tuần 35 Tuần 38 Tuần 41 v DANH SÁCH HÌNH Nội dung Trang Hình 1: Mơi trường ni cấy Trichoderma harzianum Hình (A): Mycoparasitism chủng Trichoderma sp mầm bệnh thực vật (Pythium) bề mặt hạt giống hạt đậu Hình (B): Hiển vi điện tử quét bề mặt hyphae Rhizoctonia solani gây bệnh sau hyphae Trichoderma mycoparasitic tháo bỏ Hình 3: Cơng thức hóa học cellulose 10 Hình 4: Mơ hình Fringed fibrillar mơ hình chuỗi gập 11 Hình 5: enzyme Cellulase 14 Hình : Tác dụng enzyme cellulose 16 Hình 7: Hàm lượng cacbon (%) theo thời gian (theo tuần) 23 Hình 8: Tỷ lệ C/N theo thời gian (theo tuần) 25 Hình 9: Đồ thị biểu diễn hàm lượng % cacbon theo thời gian 26 Hình 10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng % cacbon theo thời gian 27 vi DANH SÁCH BẢNG Nội dung Trang Bảng 1: Nhu cầu độ ẩm bắp qua giai đoạn Bảng 2: Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng dòng Trichoderma sp với mật số nấm theo thời gian ủ phân hủy chất thải bắp 19 Bảng 3: Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng dòng Trichoderma sp tối ưu từ thí nghiệm đến khả sinh enzyme cellulase 21 Bảng 4: Hàm lượng (%) nitơ theo thời gian (theo tuần) 24 Bảng 5: Hàm lượng C/N theo thời gian (theo tuần) 25 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextrose Agar ĐBSCL: Đồng Sông Cửu Long VSV: vi sinh vật T1-1: Trichoderma sp mật số 106 T1-2: Trichoderma sp mật số 107 T1-3: Trichoderma sp mật số 108 T2-1: Trichoderma sp mật số 106 T2-2: Trichoderma sp mật số 107 T2-3: Trichoderma sp mật số 108 T3-1: Trichoderma sp mật số 106 T3-2: Trichoderma sp mật số 107 T3-3: Trichoderma sp mật số 108 DC: đối chứng viii TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tiếng Anh Altomare, C., Norvell, W A., Björkman, T., and Harman, G E 1999 Solubilization of phosphates and micronutrients by the plant-growth promoting and biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai 1295-22 Appl Env Microbiol 65:2926-2933 Bolar, J., Norelli, J L., Wong, K.-W., Hayes, C K., Harman, G E., and Aldwinckle, H S 2000 Increased resistance to scab of endochitinase transgenic McIntosh apple lines Phytopathology 90: 72-77 Elad, Y., and Kapat, A 1999 The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea Eur J Plant Pathol 105:177-189 Harman, G E and Kubicek, C P 1998 Trichoderma and Gliocladium, Vol 2, Enzymes, Biological Control and Commercial Applications Taylor & Francis, London 393 pg Harman, G E 2000 The myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum strain T-22 Plant Disease 84 (in press, will be published in the April issue) Kubicek, C P and Harman, G E 1998 Trichoderma and Gliocladium Vol Basic Biology, Taxonomy and Genetics, Taylor & Francis, London 278 pg Paravizas, 1985 Trichoderma and Gliocladium: Biology, ecology, and potential for biocontrol Ann Rev Phytopath 23: 23-54 Tiếng việt Hồ Thiên Hoàng, Đàm Sao Mai, Võ Thị Thu Trâm, Phạm Thị Hồng Ánh (2004), Khảo sát hoạt tính enzyme cellulose tách chiết từ hệ sợi nấm bào ngư (Pleurotus Sp) nuôi cấy nấm mơi trường bã khoai mì, hội nghị cơng nghệ đào tạo lần 3, Trang 309 Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Tường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công Nghệ Enzyme, Nxb Đại Học Quốc Gia 29 Nguyễn Thị Khả Tú 2007 Định danh phân nhóm nấm Trichoderma spp phân lập Việt Nam”, Luận văn nghành Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông học, trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến.2004.Vi Sinh Vât Học Nông Nghiệp NXB Đại Học Sư Phạm Trần Thạnh Phòng ctv (2006), Thu nhận enzyme cellulose Trichoderma reesei mơi trường bán rán, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, tr 17-31, số 07/2007 Internet1:http://www.docsachonline.vn/index.php?option=com_w365_document&vi ew=alert&kind=cashdown&Itemid=28 Internet2:http://www.baovecaytrong.com/kythuatsanphambvtvchitiet.php?Id=1 Internet3:http://www.ctu.edu.vn/colleges/agri/ppd/Thanhtuu.html Internet4:http://thuvienluanvan.com/decuong/TP0218.pdf Internet5 :http://vi.wikipedia.org Internet6 :http://tailieu.vn Internet6 :http://en.wikipedia.org Internet7 :http://sinhhocvietnam.com Internet8 :http://baigiang.violet.vn 30 Phụ chương A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl Cân 10g đất vào bình định mức 100ml Thêm muỗng hỗn hợp CuSO4 : K4SO4 (1: 4), 50g CuSO4 với 200g K4SO4 nghiền trộn cối sứ cho vào lọ dùng dần Thêm 10ml H2SO4 , để yên cho xúc tác khoảng 15 phút Thơng thường dung dịch nóng có màu xanh (nếu nguội dung dịch chuyển sang khơng màu) Sau đem đun hỗn hợp chuyển sang màu đen (khoảng 30 phút) , tiếp tục để nguội tự nhiên khoảng 15 phút Chuyển toàn hỗn hợp vào bình chứa máy xác định N2 (Kjendhal) Rửa nhiều lần H2O cất Đưa bình vào hệ thống máy định lượng N2 Chuẩn dung dịch từ xanh mực sang màu xanh trở lại với dung dịch NaOH 0,1N Ghi lại thể tích NaOH 0,1N dùng Áp dụng cơng thức tính suy % Nitơ tổng (Đất vùng nhiệt đới thường có % N