Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ pico chrysanthemum sp

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CÚC LÁ NHỎ PICO (Chrysanthemum sp.) LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ SINH-Y SINH CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số cơng trình: …………………………… ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CÚC LÁ NHỎ PICO (Chrysanthemum sp.) LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ SINH-Y SINH CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số cơng trình: …………………………… TĨM TẮT Mẫu cúc Pico cắt thành đoạn 1-1,5cm khử trùng Javel 5% mức thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 14 ngày nuôi cấy đạt tỷ lệ cao 91,1% Sau cấy vào môi trường MS 3-4 tuần mọc lên chồi nách Các chồi cắt thành đoạn 1-1,5cm cấy vào môi trường MS bổ sung 1,5mg/l BA, 1,5mg/l BA cho kết nhân nhanh chồi tốt 16,5 17,35 chồi/cụm chồi, cấy vào môi trường MS bổ sung 10% nước dừa cho tỷ lệ nhân chồi kéo dài lóng thân tốt 2,12 chồi/cụm chiều cao đạt 6,45cm Sau chồi cấy vào môi trường MS bổ sung 2mg/l NAA 1mg/l NAA để tạo rễ (chiều dài rễ 5,18cm 4,72 cm sau tuần nuôi cấy số rễ đạt 9,6 rễ 10,7 rễ) Kết đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu giống cúc Pico nói riêng lồi cúc nói chung Ngồi ra, kết đề tài ứng dụng để nhân nhanh cúc, làm đa dạng hoa Thành phố Hồ Chí Minh MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam 1.1.4 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.4.1 Tính tồn tế bào 1.1.4.2 Tính phân hóa phản phân hóa tế bào 1.1.5 Các giai đoạn nuôi cấy mô 1.1.5.1 Chuẩn bị mẹ, lựa chọn mẫu cấy: 1.1.5.2 Khử trùng mẫu cấy 1.1.5.3 Tạo thể nhân giống in vitro tăng sinh mô 1.1.5.4 Ra rễ in vitro tái sinh hoàn chỉnh 1.1.5.5 Chuyển vườn ươm 1.1.5.6 Ra rễ ex vitro 1.1.6 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 1.1.6.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi bất định 1.1.6.2 Nuôi cấy tế bào đơn 1.1.6.3 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 10 1.1.8 Thành phần môi trường dinh dưỡng 11 1.1.9 Tổng quan ánh sáng 13 1.2 Tổng quan cúc 17 1.2.1 Phân loại khoa học 17 1.2.2 Nguồn gốc, lịch sử phân bố 17 1.2.3 Đặc điểm thực vật học 19 i 1.2.4 Tình hình nhân giống cúc giới Việt Nam 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đồ án 23 2.1.1 Địa điểm 23 2.1.2 Thời gian 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 23 2.2.2 Trang thiết bị 23 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 24 2.3 Phương pháp 25 2.3.1 Pha môi trường 25 2.3.2 Hấp khử trùng 25 2.4 Bố trí thí nghiệm 25 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 25 2.4.2 Pico Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến nhân chồi mẫu cúc 27 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả nhân chồi mẫu cúc 28 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng đến nhân nhanh chồi mẫu cúc 29 2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến rễ mẫu cúc 30 2.5 Thống kê xử lý số liệu 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 32 3.2 Ảnh hưởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 34 3.3 Ảnh hưởng nước dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 37 3.4 Ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico 40 3.5 Ảnh hưởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid BA Benzyl adenyl Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid GA3 Gibberellic acid IAA Indolylacetic acid IBA Indole -3-Butyric acid LED Light Emitting Diode MS Murashige and Skoog NAA Naphthul acetic acid RNA Ribonucleic acid TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Vitamin B1 Thiamin Vitamin B2 Riboflavin Vitamin B6 Pyridoxin iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 26 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân chồi mẫu cúc 27 Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ nước dừa thích hợp đến tái sinh chồi mẫu cúc 28 Bảng 2.4 Khảo sát loại đèn LED thích hợp đến tái sinh chồi mẫu cúc 29 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng NAA đến rễ mẫu cúc 30 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 35 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nước dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 38 Bảng 3.4 Ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico 40 Bảng 3.5: Ảnh hưởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 43 iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico .33 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico .35 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng nước dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico .38 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico .41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 45 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Phổ hấp thụ ánh sáng thực vật 14 Hình 1.2 Chrysanthemum sp .17 Hình 1.3 Một số hình ảnh cúc Pico 20 Hình 2.1 Chrysanthemum sp…………………………………………………….23 Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng 5% Javel đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 33 Hình 3.2 Ảnh hưởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 36 Hình 3.3 Ảnh hưởng nước dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 39 Hình 3.4 Ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico .41 Hình 3.5 Ảnh hưởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 45 vi LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đời sống người ngày cải thiện kéo theo không gian sống ngày chất lượng, người ta hướng tới sống đầy đủ tiện nghi phong cách Đặc biệt thành phố lớn, nơi đời sống người dân cao lại thiếu vẻ đẹp hoang sơ thiên nhiên Chính thế, hoa sử dụng quà tinh thần bù đắp lại thiếu sót Việc trưng bày hoa nơi công sở để bàn làm việc thêm sắc màu hay dùng hoa để thay lời nói ngày lễ tết thu hút đam mê nhiều người Trong đó, hoa cúc chiếm vị trí lớn, theo (Đặng, 2006) cho biết, với màu sắc phong phú, kích cỡ hình dáng đa dạng, dễ điều khiển cho hoa tạo nguồn giống quanh năm khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa tiêu thụ đứng thứ hai giới sau hoa hồng Ngày cúc sử dụng rộng rãi sống, ngồi trang trí, cúc cịn dùng để làm cảnh, thờ cúng, dược liệu, trà,…Ở nhiều nơi, người ta tin cúc biểu tượng sống, niềm tin, bắt đầu Cúc đưa vào đời sống người dân q tinh thần khơng thể thiếu ngày đặc biệt Nhắc đến cúc ta kể đến cúc nhỏ hay gọi cúc Pico, tên khoa học Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae, nguồn gốc Châu Á, Châu Âu Cúc Pico thân thảo, có bế, mọc bóng râm, chiều cao trung bình 20-50cm Hiện nay, cúc Pico chưa nghiên cứu nhân giống in vitro chưa có cơng trình nghiên cứu loài cúc này, ra, cúc Pico Dalat hasfarm nhập hạt giống trồng, Dalat hasfarm độc quyền với loại hoa này, Dalat hasfarm cịn có số sở nhỏ lẻ trồng vài biện pháp thủ công giâm cành, gieo hạt Việc làm cho mức độ nhân giống không cao, hạt gieo dễ bị nhiễm bệnh, cành giâm bị thối chết, giâm thành cơng dễ nhiễm bệnh từ mẹ, khơng có kỹ thuật tốt làm ảnh hưởng đến mẹ, dễ gây thối hóa 36 The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.1489 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NAA A A A 10.6933 9.6233 C C C 9.0533 1.5 8.3667 2.5 7.6567 0.5 B B B D D D 37 The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Number of Means Critical Range 1.149 1.201 1.231 1.250 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NAA A A A 10.6933 9.6233 C C C 9.0533 1.5 8.3667 2.5 7.6567 0.5 B B B D D D 38 - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU DÀI RỄ THÍ NGHIỆM The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Class Level Information Class NAA CHIEUDAIRE Levels 14 Values 0.5 1.5 2.5 3.34 3.7 3.85 3.91 4.15 4.16 4.4 4.44 4.68 4.71 4.76 4.85 5.42 5.67 Number of observations 15 39 The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAIRE Source DF Squares Sum of Mean Square F Value Pr > F Model 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 Source NAA Error 10 2.02820000 Corrected Total 14 5.48164000 0.20282000 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAIRE Mean 0.630001 10.12490 0.450355 4.448000 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 40 The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 10 0.20282 2.22814 0.8193 Means with the same letter are not significantly different t Grouping B B B B B A A A A A C C C C C Mean N NAA 5.1767 4.7167 4.4700 0.5 4.0567 1.5 3.8200 2.5 41 The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 8193 0.05 10 0.20282 8562 8779 8918 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping B B B B B A A A A A C C C C C Mean N NAA 5.1767 4.7167 4.4700 0.5 4.0567 1.5 3.8200 2.5 42 - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Class Level Information Class NAA SOCHOI Levels 13 Values 0.5 1.5 2.5 2.1 2.27 2.37 2.5 2.83 3.53 4.13 4.3 4.47 5.07 5.13 5.47 Number of observations 15 43 The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Source DF Squares Sum of Mean Square F Value Pr > F Model 18.67180000 4.66795000 65.45 F 18.67180000 4.66795000 65.45