Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ lá ngải cứu artemisia vulgaris l xác định thành phần hóa học khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu tạo cao xoa

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ LÁ NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.), XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU TẠO CAO XOA LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU : Cơng nghệ Hóa - Dược CHUN NGÀNH : Dược liệu Mã số cơng trình: …………………………… (Phần BTC Giải thưởng ghi) i MỤC LỤC MỤC LỤC i TÓM TẮT v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ngải cứu 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Giới thiệu họ Cúc (Asteraceae) chi ngải (Artemisia) 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.4 Công dụng dược lý Ngải cứu 11 1.2 Giới thiệu tinh dầu 12 1.2.1 Khái niệm tinh dầu 12 1.2.2 Phân bố tinh dầu thiên nhiên 13 1.2.3 Q trình tích luỹ tinh dầu 13 1.2.4 Tính chất vật lý tinh dầu 14 1.2.5 Tính chất hoá học tinh dầu Ngải cứu 15 1.2.6 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu Ngải cứu 17 1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu ngành công nghiệp 19 1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu 19 1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu 19 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu 20 1.3 Giới thiệu phương pháp chưng cất lôi nước 25 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước 26 1.3.2 Giới thiệu ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu 27 1.4 Khả kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 28 ii 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 28 1.4.2 Các chế kháng khuẩn 28 1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid thực vật 30 1.4.4 Một số nhóm hợp chất glycoside thực vật 32 1.4.5 Nhóm tinh dầu .34 1.5 Giới thiệu chủng vi khuẩn gây bệnh 35 1.5.1 Staphyllococcus aureus 36 1.5.2 Escherichia coli (E.coli) 38 1.5.3 Shigella 39 1.5.4 Salmonella 41 1.6 Giới thiệu tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu loại tinh dầu khác từ thực vật 43 1.6.1 Khả kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu 43 1.6.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật tinh dầu tần dày 43 1.7 Sắc ký khí ghép khối phổ số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) 44 1.8 Giới thiệu cao xoa 49 1.8.1 Cao xoa 49 1.8.2 Thành phần 50 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 52 2.1 Vật liệu 52 2.1.1 Nguyên liệu 52 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 52 2.1.3 Hóa chất 54 2.2 Phương pháp nghiên cứu 55 2.2.1 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng 56 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 57 2.2.3 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 62 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 66 iii 2.3 Quy trình sản xuất cao xoa tinh dầu Ngải cứu quy mơ phịng thí nghiệm 68 2.4 Thống kê xử lý số liệu 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 76 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 78 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 79 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 82 3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 3.2 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 85 3.2.1 Đánh giá cảm quan 85 3.2.2 Định lượng tinh dầu Ngải cứu 85 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 86 3.2.4 Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu 87 3.2.5 Độ hòa tan ethanol 87 3.3 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu 88 iv 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 91 3.4.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 91 3.4.2 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 93 3.4.3 Kết hoạt tính kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 95 3.4.4 Hoạt tính kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 97 3.5 Kết sản xuất cao xoa quy mơ phịng thí nghiệm 99 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101 4.1 Kết luận 101 4.2 Kiến nghị 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC v TĨM TẮT Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành hướng sau đây: Đầu tiên nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ( kích thước nguyên liệu, tuổi nguyên liệu, nồng độ dung dịch NaCl, thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl, thời gian chưng cất, độ héo nguyên liệu, lượng nước chưng cất ) đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước: Kết cho thấy nguyên liệu già, cắt nhỏ cm, nồng độ dung dịch NaCl 10%, thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl 30 phút, thời gian chưng cất 180 phút, thời gian để héo nguyên liệu ngày, lượng nước chưng cất 450 mL ( tương đương tỷ lệ Ngải cứu : nước : 3) thích hợp cho thu nhận tinh dầu từ Ngải cứu Kết xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu cho thấy cảm quan tinh dầu Ngải cứu thu có màu vàng sáng, nhẹ nước, mùi nồng đặc trưng, vị cay the… Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 0,446%; tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 0,881 Thứ hai phân tích thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp GC-MS Kết cho thấy tinh dầu Ngải cứu thu huyện Củ Chi, Tp.HCM có thành phần D-camphor (31,78%) cineole (15,80%), ngồi cịn có chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%) Thứ ba đánh giá khả kháng chủng vi khuẩn (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Shigella boydii), kết cho thấy tinh dầu Ngải cứu có khả kháng loại vi khuẩn gram (+), gram (-) Tinh dầu nguyên chất có khả kháng vi sinh vật mạnh vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic Acid E.Coli : Escherichia coli GC : Gas chromatography MS : Mass spectrometry NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth PABA : 4-Aminobenzoic acid RNA : Ribonucleic Acid SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) Hình 1.2 Một số thuộc chi Ngải Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) 10 Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 15 Hình 1.5 Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol 16 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol 16 Hình 1.7 Cấu trúc 3D phân tử α-pinene 17 Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 17 Hình 1.9 Máy ép tinh dầu 20 Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi nước 21 Hình 1.11 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng 24 Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lơi nước nguyên lý hoạt động 26 Hình 1.13 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 28 Hình 1.14 Cấu trúc Morphine 30 Hình 1.15 Cấu trúc Quinine 31 Hình 1.16 Sơ đồ phân loại saponin 33 Hình 1.17 Staphyllococcus aureus 36 Hình 1.18 Vi khuẩn E.coli 38 Hình 1.19 Vi khuẩn Shigella 41 Hình 1.20 Vi khuẩn Salmonella 39 Hình 1.21 Sắc đồ sắc ký khí 46 Hình 1.22 Mơ hình khối phổ 47 Hình 1.23 Mass-spectrum 48 Hình 1.24 Một số loại cao xoa phổ biến Việt Nam 50 Hình 2.1 Vườn Ngải cứu nhánh Ngải cứu khô 52 Hình 2.2 Bộ chưng cất lơi nước Clevenger 54 Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước 55 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương viii pháp chưng cất lôi nước 56 Hình 2.5 Quy trình sản xuất cao xoa 69 Hình 3.1 Đồ thị thể ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 74 Hình 3.2 Đồ thị thể ảnh hưởng tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 Hình 3.3 Đồ thị thể ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 77 Hình 3.4 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lơi nước 79 Hình 3.5 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 81 Hình 3.6 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lơi nước 84 Hình 3.8 Tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 85 Hình 3.9 Kết kháng Staphylococcus aureus 93 Hình 3.10 Kết kháng E.coli 95 Hình 3.11 Kết kháng Salmonella 97 Hình 3.12 Kết kháng Shigella boydii 99 Hình 3.13 Cao xoa thành phẩm 100 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 73 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 75 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 76 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 78 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 80 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 82 Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 84 Bảng 3.8 Kết định lượng tinh dầu Ngải cứu 86 Bảng 3.9 Kết xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 86 Bảng 3.10 Kết xác định số hóa học tinh dầu Ngải cứu 87 Bảng 3.11 Kết xác định độ hòa tan tinh dầu Ngải cứu ethanol 88 Bảng 3.12 Kết xác định thành phần hóa học hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu Ngải cứu phương pháp GC – MS 88 Bảng 3.13 Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu 91 Bảng 3.14 Kết kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu 93 Bảng 3.15 Kết kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu 96 Bảng 3.16 Kết kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu 98 102 [24] Chiou LC, Ling JY, Chang CC beta-Eudesmol as an antidote for intoxication from organophosphorus anticholinesterase agents Eur J Pharmacol 1995 Jan 13;292(2):151-6 [25] Mugwort (Artemisia vulgaris) Oils Chapter | 65 579 Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, First Edition, 2016, 573-579 [26] Alizade M., Aghaei M., Saadatian M., Sharifian I Chemical composition of essential oil of Artemisia vulgaris from West Azerbaijan, Iran Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 2012 [27] Asta, J., Juste, B., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from North Lithuania Chemistry 1, 12– 15 [28] Bamoniri, A., Mirjalili, B.B.F., Mazoochi, A., Batooli, H., 2010 Chemical composition of Artemisia vulgaris L from Kashan area isolated by nano scale injection Iran J Org Chem (4), 533–536 [29] Barney, J.N., Hay, A.G., Weston, L.A., 2005 Isolation and characterization of allelopathic volatiles from Mugwort (Artemisia vulgaris) J Chem Ecol 31 (2), 247–265 [30] Bhatt, L.R., Lee, J.S., Baek, S.H., 2007 Evalution of antioxidant activity of essential oil from Artemisia vulgaris Korean J Orient Physiol Pathol 21 (2), 528–531 [31] Blagojevic, P., Radulovic, N., Palic, R., Stojanovic, G.J., 2006 Chemical composition of the essential oil of Serbian wild-growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris J Agric Food Chem 54, 470–478 [32] Erel, S.B., Reznicek, G., Senol, S.G., Yavasogulu, N.U.K., Konyalioglu, S., Zeybek, A.U., 2012 Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L species from western Anatolia Turk J Biol 36, 75–84 [33] Gilani, A.H., Yaeesh, S., Jamal, Q., Ghayur, M.N., 2005 Hepatoprotective activity of aqueous-methanol extract of Artemisia vulgaris Phytother Res 19, 170–172 103 [34] Govindaraj, S.P., Kumari, B.D.R., 2013 Composition and larvicidal activity of Artemisia vulgaris L stem essential oil against Aedesaegypti Jordan J Biol Sci (1), 11–16 [35] Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2008 PDR of Herbal Medicine, fourth ed Medical Economics Company [36] Haider, F., Dwivedi, P.D., Naqvi, A.A., Bagchi, G.D., 2003 Essential oil composition of Artemisia vulgaris harvested at different growth periods under Indo-Gangetic plain conditions J Essent Oil Res 15, 376–378 [37] Harimath, S.K., Kolume, D.G., Muddapur, U.M., 2011 Antimicrobial activity of Artemisia vulgaris Linn (Damanaka) Int J Res Ayurveda Pharm (6), 1674–1675 [38] Hussain, A.I., Anwar, F., Sherazi, S.T.H., Przybylski, R., 2008 Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depend on seasonal variations Food Chem 108, 986–995 [39] Jerkovic, I., Mastelic, J., Milos, M., Juteau, F., Masotti, V., Viano, J., 2003 Chemical variability of Artemisia vulgaris L essential oils originated from the Mediterranean area of France and Croatia Flavour Fragr J 18, 436–440 [40] Judzentiene, A., Buzelyte, J., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from plants grown in North Lithuania Chemistry 17 (1), 12–15 [41] Mucciarelli, M., Caramiello, R., Maffei, M., 1995 Essential oils from some Artemisia species growing spontaneously in North-West Italy Flavour Frag J 10, 25–32 [42] Pino, J.A., Rohlado, A., Fuentcs, V., 1999 Composition of the essential oil of Artemisia vulgaris L herb from Cuba J Essent Res 11, 477–478 [43] Sharifian, I., Hashemi, S.M., Darvishzadeh, A., 2013 Fumigant toxicity of essential oil of Mugwort (Artemisia vulgaris L.) against three major stored product beetles Arch Phytopathol PFL 46 (4), 445–450 104 [44] Silva, T.D.J.A., 2004 Mining the essential oils of the Anthemideae Afr J Biotechnol (12), 706–720 [45] Sun, W.C., Han, J.X., Yang, W.Y., Deng, D.A., Yue, X.F., 1992 Antitumor activities of derivatives of artemisic acid and artemisinin B in vitro Acta Pharm Sin 13, 541–543 [46] Surburg, H., Panten, J., 2006 Common Fragrance and Flavor Materials Preparation, Properties and Uses, fifth ed Wiley-VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-31315-0 [47] Tang, W., Eisenbrand, G., 2011 Handbook of Chinese Medicinal Plants: Chemistry, Pharmacology, Toxicology, vol Wiley VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-32226-8 [48] Thao, N.T.P., Thuy, N.T., Hoi, T.M., Muselli, T.H.T.A., Bighelli, A., Castola, V., Casanova, J., 2004 Artemisia vulgaris L from Vietnam: chemical variability and composition of the oil along the vegetative life of the plant J Essent Oil Res 16, 358–361 [49] Tigno, X.T., Guzman, F.D., Flora, A.M.T.V., 2000 Phytochemical analysis and hemodynamic actions of Artemisia vulgaris L Clin Hemorheol Micro-circ 23, 167–175 [50] Tobyn, G., Denham, A., Whitelegg, M., 2011 The Western Herbal Tradition: 2000 Years of Medicinal Plant Knowledge Elsevier Churchil Livingstone ISBN: 978-0-443-10344-5 pp 123 [51] Walter, H.L., Memory, P.F.E.L., 2003 Medical Botany: Plants Affecting Human Health, second ed John Wiley and Sons, New York ISBN: 978-0-471-62882-8 pp 345 [52] Wang, J., Zhu, F., Zhou, X.M., Niu, C.Y., Lei, C.L., 2005 Repellent and fumigant activity of essential oil from Artemisia vulgaris to Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) J Stored Prod Res 42, 339–347 [53] Willcox, M., 2009 Artemisia species: from traditional medicines to modern antimalarial and back again J Altern Complem Med 15, 101– 109 105 [54] Wright, C.W., 2002 Artemisia: Medicinal and Aromatic Plantsindustrial Profiles Taylor and Francis, New York ISBN: 978-0-41527212-4 [55] Yoshikawa, M., Shimada, H., Matsuda, H., Yamahara, J., Murakami, N., 1996 Bioactive constituents of Chinese natural medicines Chem Pharm Bull 44 (9), 1656–1662 [56] Govindaraj S, Kumari BD, Cioni PL, Flamini G Mass propagation and essential oil analysis of Artemisia vulgaris J Biosci Bioeng, 2008 Mar; 105 (3): 176-83 Tài liệu Internet [57] Chi cục thú y TP Hồ Chí Minh, Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E coli, 6/2012, http://chicucthuyhcm.org.vn/new/2005/09/23/Ngo-doc-thuc-pham-do-vikhuan-Ecoli.aspx [58] Đại Học Y Thái Bình, Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, 5/2012, http://thuvien.yhvn.vn/node/1030 http://thuvien.yhvn.vn/node/1029 http://thuvien.yhvn.vn/node/1012 [59] https://vi.wikipedia.org/wiki/Ngải_cứu PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần chất môi trường cách pha số dung dịch thử Dung dịch chuẩn độ KOH 0,1 N Cân khoảng 0,56 g KOH rắn, hòa tan 100 mL ethanol 96o, ta dung dịch KOH cồn nồng độ khoảng 0,1 N Môi trường tăng sinh NB Cân xác g mơi trường Peptone, g mơi trường Beef extract (có thể thay g mơi trường Meat extract), 15 g muối NaCl Hịa 23 g môi trường Nutrient Broth 1000 mL nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Mơi trường cấy kháng khuẩn NA Cân xác g môi trường Peptone, g môi trường Beef extract (có thể thay g mơi trường Meat extract), 15 g muối NaCl 15 g Agar Hịa 38 g mơi trường Nutrient Agar 1000 mL nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Phụ lục 2: Xử lý thống kê yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu trình chưng cất phương pháp lơi nước Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích cỡ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square F Value Pr > F 0.09460133 124.49 F F 30.24 0.0053 0.04420417 0.00146167 0.05005083 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.883185 10.62485 0.038232 0.359833 Source DF NT Anova SS 0.04420417 Mean Square 0.04420417 F Value 30.24 Pr > F 0.0053 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.001462 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.0867 t Grouping Mean N NT A 0.44567 B1 B 0.27400 B2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Model Error Corrected Total Squares Mean Square 0.13765667 0.00388400 11 Mean 0.972559 7.935437 0.022034 0.277667 F 0.04588556 R-Square Source F Value Anova SS 0.13765667 Mean Square F Value 0.04588556 94.51 Pr > F F 0.07631878 112.29 F F 15.75 F F 0.07119222 131.23 F F 45.32 0.0002 0.03688411 0.00081378 0.07865089 R-Square Source Mean Square Anova SS 0.07376822 Mean 0.318889 Mean Square F Value 0.03688411 45.32 Pr > F 0.0002 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.000814 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference t Grouping Mean 0.057 N NT A 0.44567 G2 B 0.27100 G3 G1 B B 0.24000 Phụ lục 3: Xử lý thống kê kết mức độ kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu nhóm vi sinh vật thị Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu Sum of Source DF Model Error Squares 308.4000000 10 Corrected Total Mean Square 7.3333333 14 F Value 77.1000000 Pr > F 105.14 F F 177.08 F F 119.17 97.33333333 R-Square Source F Value Anova SS 95.33333333 Mean Square F Value 23.83333333 119.17 Alpha Pr > F