Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong vaucheria spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH THỦY PHÂN TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE TỪ RONG VAUCHERIA SPP Ngành : MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH : PHAN CẨM BÌNH MSSV : 0851110016 - LỚP: 08DSH3 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km vùng đặc quyền kinh tế rộng triệu km2 với nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú Trong đó, nguồn kinh tế khai khác từ rong, tảo mang lại lơi nhuận lớn ngành kinh tế biển Tảo ứng dụng rộng rãi nhiều giới quy mô công nghiệp với nhiều sản phẩm chiết xuất từ tảo phục vụ nhiều lĩnh vực : y học, công nghệ mỹ phẩm, công nghiệp thực phẩm, lượng xanh Hiện nước ta có khoảng 700 loài rong tảo thuộc ngành Chlorophyta, Heterkontophyta, Rhodophyta Nhiều lồi mang lại giá trị kinh tế cao, có khoảng 121 loài khai thác phục vụ nhu cầu người Với lợi khí hậu nóng ẩm, diện tích nước mặt nhiều nên rong tảo Việt Nam phát triển cao Trong năm gần đây, nguồn lợi từ rong tảo mang lại cho nước ta lớn Nên cầu khai thác tìm tịi, nghiên cứu lồi có ý nghĩa quan trọng Tảo lục (Chlorphyta) ngành lớn đa dạng, phân biệt với ngành tảo khác chỗ ln có màu lục giống thực vật Đến toàn giới biết khoảng 500 chi 8000 loài Phần lớn chúng sống nước gần 90%, lại biển đại dương 10% Trong biển đại dương giới biết 984 loài thuộc 112 chi , 18 họ Hiện có số loại rong thuộc ngành rong lục Chlorophyta Vaucheria Spp lồi q trình nghiên cứu nhiều nhà khoa học, thuộc ngành tảo vàng lục có phân bố nhiều vùng nước nghèo chất dinh dưỡng phát triển tự nhiên nhiều vùng Đồng sông Cửu Long khai thác nuôi trồng rộng rãi Một số loại rong nghiên cứu nuôi trồng kết hợp với thủy sản nhằm cải thiện môi trường nước tăng suất tôm ni Lợi ích mà mang lại lớn, khơng phục vụ cầu sản xuất thực phẩm, y học, ngành cơng nghệ mỹ phẩm, chăn ni…mà cịn nguồn nhiên liệu ngành công nghệ lượng, sản xuất xăng sinh học Tuy nhiên, khả sử dụng tất lồi rong nói hay số chúng làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất Trang Đồ án tốt nghiệp nhiên liệu sinh học lại phụ thuộc nhiều vào thành phần hóa sinh khả đường hóa Hiện nay, nhà khoa học nghiên cứu tiềm việc sản xuất sinh nhiên liệu sinh học từ tảo thu nhiều kết khả quan từ nguồn nguyên liệu Và việc xác định thành phần hóa sinh rong tảo tối ưu hóa q trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp đóng vai trị quan trọng bước khởi đầu việc tìm nguồn nguyên liệu phù hợp sản xuất xăng sinh học từ tảo Đề tài “Tối ưu hóa q trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.” nhu cầu cấp thiết giải vấn đề Tình hình nghiên cứu: Tình hình nghiên cứu rong biển giới: Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu thực theo nhiều khiá cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi, chế biến, nuôi trồng tạo giống rong biển Rong biển nghiên cứu sử dụng thực phẩm, công nghiệp dược phẩm nhiều nước giới Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học βcaroten, chất chống oxy hóa nhiều nhà khoa học quan tâm Rong biển giàu protein khống chất, tận dụng sử dựng thực phẩm thức ăn gia súc ( Akiko Isa et al., 2009) Một số nghiên cứu đề cập tới ảnh hưởng điều kiện nuôi tới thành phần hóa sinh rong Hàm lượng protein rong biển cao chịu ảnh hưởng điều kiện nuôi ánh sáng dưỡng chất ( Evan &Langdon 2000; Rosen et al 2000) Một số tác giả tìm hiểu cấu tạo thành phần polysaccharide tế bào rong Ulva spp, Enteromorpha sp (Kausik Chattopadhyay, 2006; Bimalendu Ray, 2006) Kết cho thấy thành phần carbonhydrat chiếm tới 29% tổng lượng chất khô rong Polysacchride thành tế bào rong thường chứa thành phần cellulose hemicellulose có cấu trúc phân nhánh phức tạp với đường monosaccharide rhamnose, xylose, glucose, galactose, Trang Đồ án tốt nghiệp chiếm tỉ lệ lượng nhỏ protein sulphate Khác với tảo đỏ hay tảo nâu, lồi tảo lục thường khơng chứa thành phần polysaccharide có tính nhầy nhưa agar alginic acid (Akiki Asa at el., 2009) Hàm lượng lignin thấp tế bào Những đặc tính hóa lý, tính chất lưu biến sinh học đặc biệt thành phần carbonhydrat thành tế bào rong biển mở nhiều hội sử dụng chúng tương lai Tình hình nghiên cứu rong biển nước: Ở Việt Nam nghiên cứu nuôi trồng rong thực nhiều chủ yếu giống rong câu Gracilariace rong sụn Kappaphycus.Một số loài rong G Bailinae nuôi trồng thử nghiệm miền Trung Việt Nam suất đạt 8-10 khô/ha thời gian nuôi tháng (Huỳnh Quang Năng & Nguyễn Hữu Dinh, 1999) Một số nghiên cứu ni trồng kết hợp rong với lồi thủy sảnh khác thực Nguyễn Hữu Khánh cộng (2005) thử nghiệm nuôi trồng kết hợp tôm hùm với bào ngư , rong sụn vẹm xanh Huỳnh Quang Năng (2005) Đã xây dựng mơ hình trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii ln canh ao đìa ni tơm ven biển Kết thu khả thi việc khai thác tiềm nước mặt Một số tác giả nghiên cứu tác động môi trường, khả xử lý ô nhiễm sinh trưởng rong điều kiện khác Ngô Quốc Bưu cộng (2000) nghiên cứu sử dụng rong biển để xử lý nhiễm bẩn hữu nước thải ao nuôi tôm Kết cho thấy loài nghiên cứu Gracilacia hecteroclada rong sụn Kappaphycus alvarezii thể khả hấp thụ nitơ phosphor nước thải Đối với rong bún (Enteromorpha or Ulva) rong Tóc Đốt Chaetomorpha nghiên cứu sinh hóa tiềm ứng dựng chúng thực nhóm nghiên cứu Viện Sinh học nhiêt đới khuôn khổ dự án FSPSII/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ) Các loài rong lọc tự nhiên ao nuôi tôm Đồng sông Cửu Long Kết khảo sát sơ cho Trang Đồ án tốt nghiệp thấy, người ni tơm thích diện loại rong so với loại rong khác cho xuất chúng cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm cải thiên suất tôm Mặc dù rong có tiềm lớn để ni kết hợp tôm vùng nước lợ, nhiên, nay, chưa có cơng trình nghiên cứu sâu để đánh giá hết vai trò rong môi trường ao nuôi, sức khỏe tăng trưởng tôm Tình hình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển: Rong biển coi ứng viên tốt cho người việc tận dụng tài nguyên mặt nước đối tượng phù hợp để chuyển đổi cấu nông nghiệp – thủy sản bối cảnh biến đổi khí hậu vùng ven bờ vùng đất ngập mặn Thực vật thủy sinh chưa xem xét cách nghiêm túc làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học cho tới thời gian gần Nhiều dự án khác bắt đầu thực ba năm trời lại đây, kết yêu cầu giảm phụ thuộc vào lượng nước cho trồng trọt chuyển hoá thực vật cạn Nhật Bản nước đầu nghiên cứu sử dụng rong lục (green algae) làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học Akiko Isa (2009) xác định thành phần Carbonhydrate số loài rong Enteromorpha sp., Cheatomorpha sp., Cladophora sp., Ulva sp Mọc tự nhiên Thái Lan, Việt Nam Nhật Kết cho thấy rong Việt Nam chứa hàm lượng glucose cao (300mg/g sinh khối) sử dụng cellulase chuyển 95% carbonhydrate thành đường Mặc dù rong biển bắt đầu nghiên cứu sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho trình sản xuất nhiên liệu sinh học nhiều nước giới Việt Nam có đề tài TS Nguyễn Như Hậu – NITRA“Nghiên cứu đánh giá tiềm rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu (Biofuel) triển khai ba năm từ 2009 -2011, khuôn khổ đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn đến năm 2025 (Bộ Cơng Thương) Trang Đồ án tốt nghiệp Ở Việt Nam, nhìn chung có nhiều cơng trình nghiên cứu rong biển ni trồng rong biển, nhiên chưa có cơng trình phát triển sinh khối rong biển vùng nuôi tôm trọng điểm ĐBSCL dùng nguồn sinh khối làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học sản phẩm có giá trị khác Việc chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường lên men sau thành ethanol butanol cách tiếp cận mẻ có triển vọng Mục đích nghiên cứu: Tìm nguồn vật liệu khởi đầu thích hợp cho việc nghiên cứu chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường lên men sau thành ethanol butanol từ rong biển thông qua hàm lượng đường khử sau trình thủy phân tạo glucose Giải vấn đề lượng Nhiệm vụ nghiên cứu: Xác định thành phần hóa sinh rong Vaucheria spp Xác định thơng số thích hợp cho q trình tiền xử lý mẫu rong trước tiến hành thủy phân tạo đường Xác định yếu tố ảnh hưởng trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa q trình thủy phân Phương pháp nghiên cứu: Các thành phần hóa sinh rong xác định theo phương pháp LAPS ( Standard compositional laboratory analytical procedure ) mơ tả Dien et al 2010 Theo Protein dược xác định phương pháp Kjeldahl, Lipid xác định phương pháp Soxhlet; Các tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng, tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro ẩm dược xác định theo phương pháp FAO AOAC Xác định yếu tố thích hợp cho trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp nồng độ H2SO4 giai đoạn tiền xử lý mẫu, nồng độ chất, nồng độ enzyme, pH, thời gian, nhiệt độ trình ủ mẫu Trang Đồ án tốt nghiệp Định lượng hàm lượng glucose sau trình ủ mẫu xác định theo phương pháp Miller dựa việc đo mật độ quang phức màu đỏ sậm đặc trưng tạo đường khử với thuốc thử DNS bước sóng 540nm Định lượng hàm lượng HMF mẫu sau ủ phương pháp so màu quang phổ kế Định lượng độ brix mẫu thiết bị khúc xạ kế Các q trình tối ưu hóa tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm bậc Các thí nghiệm lặp lại 2- lần để đảm bảo độ tin cậy Kết tính tốn, xử lý phần mềm excel 2007 Statgraphics Dự kiến kết đạt đề tài Kết cho số liệu cụ thể tiêu sinh hóa rong Vaucheria spp Xác định yếu tố thích hợp để sử dụng cho trình thủy phân nồng độ Enzyme, nồng độ chất, pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng Xác định hàm lượng carbohydrate, hàm lượng HMF, độ brix có rong sau q trình thủy phân Trang Đồ án tốt nghiệp Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung rong, tảo: Rong tảo sinh vật có nhân thật, tế bào ln có chất diệp lục nên chủ yếu sống tự dưỡng Một số cộng sinh với Nấm thành Địa y Rong tảo sống chủ yếu nước, số sống đất ẩm vỏ Từ thời Linné (1753), Tảo coi nhóm tập hợp tất “Thực vật bậc thấp” có diệp lục Phần lớn hệ thống phân loại công nhận quan điểm Theo quan điểm này, Tảo lam nằm nhóm Tảo Tuy nhiên, xét đặc điểm tế bào học đặc biệt có mặt nhân thật dấu hiệu tiến hóa, tảo lam chưa có nhân thật tách khỏi nhóm tảo Theo hệ thống sinh giới gồm giới: nhóm tảo xếp vào giới thực vật làm thành phân giới thực vật bậc thấp (theo P Raven & G Johnson (1989)) phân chia sinh giới nhóm có nhân chuẩn thành giới đơi tùy tiện Khơng có hệ thống phân loại toàn giới chấp nhận Ngày nay, số nhà sinh học chấp nhận hệ thống sinh giới gồm giới Theo hệ thống tảo tách khỏi giới thực vật xếp vào giới Nguyên sinh (Protista) 1.1.1 Tổ chức thể Tảo có cấu trúc đa dạng: đơn bào, tập đoàn hay đa bào Mặc dù cấu tạo, hình dạng, kích thước màu sắc tảo khác tảo có số điểm chung như: Tảo có thể dạng tản chưa phân hóa thành thân, rễ, gọi tản thực vật (Thallophyta) chưa có loại mơ điển hình cấu trúc tản Tảo có vài hình thức sinh sản mơi trường phân bố gần giống nên người ta thường gộp chúng thành nhóm có ý nghĩa sinh học 1.1.2 Cấu tạo tế bào Vách tế bào cellulose pectin Một vài ngành tảo: Tảo silic, tảo vàng ánh: vách thấm thêm silic, tảo vịng, tảo đỏ: vách có thêm canxi cacbonat Mỗi tế bào có nhân, đơi nhiều nhân (ở tảo thông tâm) Trong chất nguyên sinh có chứa chất màu (diệp lục chất màu phụ khác) gọi Trang Đồ án tốt nghiệp thể màu Thể màu có hình dạng khác nhau: hình bản, sao, dải, hình mạng lưới, đĩa, hạt… ổn định với chi Trong thể màu có thể nhỏ hạch tạo bột, chung quanh có hạt tinh bột lắng tụ (ở tảo lục, tảo vòng) Những chất dự trữ khác hydratcacbon đặc biệt (laminarin, amylodextrin…) thể màu Nhiều dạng tảo đơn bào cịn có roi, số lượng 1, nhiều Các roi xuất phát từ đầu tế bào, có chức vận chuyển Roi có cấu tạo giống với roi sinh vật có nhân thật Một số tảo cịn có chấm đỏ gốc roi gọi điểm mắt quan thụ cảm ánh sáng Một số tảo đơn bào nước có khơng bào co bóp 1.1.3 Sinh sản Tảo đa dạng sinh sản Các hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính, nhiều tảo có xen kẽ hệ 1.1.3.1 Sinh sản sinh dưỡng Được thực phần riêng rẽ thể, khơng chun hóa chức phận sinh sản Ở tảo đơn bào, sinh sản sinh dưỡng thực cách phân đôi tế bào Ở tảo tập đồn có số tế bào phân chia nhanh hình thành tập đồn nhỏ bên tập đoàn mẹ (ở tảo Volvox, tảo lưới) Ở tảo dạng sợi thực cách đứt đoạn gọi tảo đoạn hay hình thành chồi Tảo vịng (Chara) 1.1.3.2 Sinh sản vơ tính Được thực bào tử chuyên hóa, có roi (bào tử động) hay khơng roi (bào tử bất động), hình thành túi bào tử, sau bào tử nảy mầm thành tản 1.1.3.3 Sinh sản hữu tính Được thực kết hợp tế bào chuyên hóa giao tử, hình thành túi giao tử đơn bào Trang Đồ án tốt nghiệp Dựa vào mức độ giống hay khác giao tử mà có hình thức sinh sản hữu tính: đẳng giao, dị giao noãn giao Ở số tảo cịn có q trình sinh sản hữu tính đặc biệt theo lối tiếp hợp hai tế bào sinh dưỡng không tạo thành giao tử (ở Tảo xoắn) Một số tảo có xen kẽ hệ trình sống Sự xen kẽ hệ đẳng hình hay dị hình 1.1.4 Phân loại Hiện giới có nhiều hệ thống phân loại tảo nhiều tác giả: hệ thống Pascher (1931), hệ thống West & Fritsch (1927) Fritsch (1935), hệ thống Chadefaud (1960), hệ thống Chadefaud Fett sửa đổi (1967) Các hệ thống phân loại dựa vào màu sắc cấu trúc tản để phân loại Hiện số ngành Tảo chưa thống Gần nhiều tác giả thường xếp nhóm tảo vào ngành sau đây: Tảo giáp (Pyrrhophyta), Tảo vàng ánh (Chrysophyta), Tảo vàng lục (Xanthophyta), Tảo mắt (Euglenophyta), Tảo silic (Bacillariophyta), Tảo lục (Chlorophyta), Tảo vòng (Charophyta), Tảo nâu (Phaeophyta) Tảo đỏ (Rhodophyta) 1.1.5 Khái quát ngành Tảo lục (Chlorophyta) Tảo lục ngành lớn đa dạng, phân biệt với ngành tảo khác chỗ ln có màu lục giống thực vật Tổ chức thể: Đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình mỏng, có có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông chứa nhiều nhân) Cấu tạo tế bào: Vách tế bào cellulose, pectin hóa nhày, số dạng nguyên thủy có tế bào trần Thể màu có nhiều hình dạng khác nhau: hình bản, dải xoắn, sao, hạt… chứa diệp lục a b, carotin, xantophin, diệp lục a b chiếm ưu so với chất màu phụ khác nên tản ln có màu lục Trang Đồ án tốt nghiệp 6.00 35.00 32.27 4.84 5.00 30.00 24.47 22.78 4.00 17.523.17 3.17 25.00 20.00 3.00 2.00 1.73 1.46 1.19 2.01 15.00 % HMF BRIX % DNS 10.00 1.22 1.00 5.00 0.00 0.00 NT1 NT2 NT3 NT4 Đồ thị 3.10 biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix ảnh hưởng nồng độ H2SO4 giai đoạn tiền xử lý mẫu 140oC , thời gian 20 phút 7.00 40.00 35.97 6.21 35.00 6.00 30.19 30.00 5.00 4.02 25.00 4.00 3.3 17.53 19.84 3.00 2.01 2.00 1.23 1.40 1.69 1.11 1.00 % HMF 20.00 ĐỘ BRIX 15.00 % DNS 10.00 5.00 0.00 0.00 NT5 NT6 NT7 NT8 Đồ thị 3.11 biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix ảnh hưởng nồng độ H2SO4 giai đoạn tiền xử lý mẫu 140oC , thời gian 30 phút Trang 82 Đồ án tốt nghiệp 4.00 40.00 35.74 3.35 3.50 35.00 3.00 30.00 2.00 1.50 2.44 22.31 2.3 2.50 19.63 1.31 1.33 25.00 20.071.97 1.28 20.00 15.00 1.04 1.00 10.00 0.50 5.00 0.00 % HMF ĐỘ BRIX % DNS 0.00 NT9 NT10 NT11 NT12 Đồ thị 3.12 biểu diễn hàm lượng đường, hàm lượng HMF , độ brix ảnh hưởng nồng độ H2SO4 giai đoạn tiền xử lý mẫu 140oC , thời gian 40 phút Từ kết đồ thị 3.10; 3.11; 3.12 dễ dàng nhận thấy yếu tố nhiệt độ tăng lên 140oC hàm lượng đường giảm hẳn so với nhiệt độ 130oC Hàm lượng đường cao đạt 35,97% với điều kiện 140oC, vòng 30 phút với H2SO4 1,5% Từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ H2SO4 , thời gian nhiệt độ lên trình tiền xử lý khẳng định yếu tố nồng độ acid đóng vai trỏ quan trọng việc phân hủy thành tế vào Nồng độ acid yếu, không đủ sức phá hủy vách tế bào, cịn cao làm hư mẫu Ngồi yếu tố nhiệt độ 130oC cho kết tốt thời gian phù hợp để xử lý mẫu 30 phút Như vậy, yếu tố tiền xử lý mẫu xác định thích hợp nồng độ H2SO4 1,5%, 130OC 20 phút ( hàm lượng đường đạt 40,97%) Đây yếu tố sở cho việc tiến hành thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp 3.3 Khả thủy phân tạo đường Glucoe từ rong Vaucheria Spp 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme tới trình thủy phân Bảng 3.9 kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân Ngiệm thức DNS (%) HMF (%) Trang 83 Độ brix (oBx) Đồ án tốt nghiệp NT1 41.88 0.65 5.66 NT2 47.87 0.82 5.59 NT3 46.84 0.87 5.39 NT4 41.35 1.03 5.72 NT5 44.78 0.40 5.72 NT6 53.62 0.39 5.81 NT7 49.90 0.63 5.72 7.00 5.66 6.00 5.00 5.59 47.87 5.72 46.84 5.39 41.88 41.35 5.72 44.78 53.62 5.81 60.00 49.90 5.72 40.00 4.00 % HMF 30.00 % BRIX 3.00 % DNS 20.00 2.00 1.00 50.00 0.65 0.82 0.87 1.03 0.40 0.00 0.39 0.63 10.00 0.00 Đồ thị 3.13 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hàm lượng đường, hàm lượng HMF độ Brix Sau trình xử lý số liệu phần mền statgraphics , có kết bảng Anova ( phần phụ lục) , nhận giá trị p = 0.001 < 0.05, thí nghiệm có ý nghĩa, nồng độ đường nghiệm thức có chênh lệch có giá trị Kết từ đồ thị 3.13 cho thấy, hàm lượng đường khử cao 53,62% nghiệm thức với kết hợp enzyme cellulase %, pectinase 0,8 %, glucoamylase 1,2 % amylase 0,6% Quá trình lựa chọn nồng độ loại enzyme phụ thuộc vào khuyến cáo sử dụng nhà sản xuất Enzyme đóng vai trị q trình thủy phân celulase, thủy phân carbonhydrate thành đường 5C, Glucoamylase đóng vai trị thủy phân tạo đường 6C, Pectinase thủy phân thành phần pectin rong Khi enzyme công, phần cellulose dễ bị công Trang 84 Đồ án tốt nghiệp cấu trúc cellulose xốp, vơ định hình… bị thủy phân trước Khi phần cellulose bị tốc độ phản ứng giảm dần, khả cơng enzyme trở nên khó khăn Vì vậy, giai đoạn nhình chung, lượng enzyme có tăng lên khơng cải thiện tốc độ phản ứng tạo thành, kết nghiệm thức cho hàm lượng đường 49,9% thấp so với nghiệm thức Độ Brix thí nghiệm cao tương ứng với nghiệm thức đạt 5,81%, Hàm lượng HMF có thay đổi rõ rệt, % HMF phụ thuộc vào tác nhân phụ tạo trình thủy phân Như vậy, hỗn hợp enzyme thuộc nghiệm thức với cellulase %, pectinase 0,8 %, glucoamylase 1,2 % amylase 0,6% Là điều kiện tối ưu cho trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất tới trình thủy phân Bảng 3.10 kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất đến trình thủy phân Cơ chất DNS (%) HMF (%) Độ brix (oBx) 1g 49.53 0.78 5.55 1.25g 51.87 0.69 5.68 1.5g 54.11 0.54 6.15 1.75g 56.38 0.42 6.34 2g 53.09 0.59 6.11 Trang 85 Đồ án tốt nghiệp 7.00 6.00 5.68 5.55 58.00 6.34 56.38 6.15 6.11 56.00 54.11 5.00 53.09 4.00 54.00 % HMF 51.87 52.00 3.00 49.53 50.00 2.00 1.00 0.78 0.69 0.54 0.42 % BRIX % DNS 48.00 0.59 0.00 46.00 1g 1,25g 1,5g 1,75g 2g Đồ thị 3.14 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hàm lượng đường, HMF độ brix Số liệu xử lý phần mền statgraphics cho kết p = 0.0032 < 0,05( phụ lục) nên thí nghiệm có ý nghĩa Khi nồng độ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, có nhiều chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng Khi nồng độ chất đủ lớn, enzyme bị bão hịa chất, vậy, tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng không thay đổi đáng kể Như vậy, theo kết đồ thị 3.8 nhận thấy rõ chất mức 1,75 mang lại hiệu thủy phân cao cho lượng glucose đạt 56,38% (bảng 3.14) Nhận thấy hàm lượng chất ức chế HMF cao lượng đường thấp, độ brix tỉ lệ thuận với hàm lượng glucose chất mức 1,75g yếu tố tối ưu trình thủy phân 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian tới trình thủy phân Bảng 3.11 kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Thời gian DNS (%) HMF (%) Độ brix (oBx) 12h 44.74 0.77 6.43 24h 47.99 0.69 6.48 36h 50.50 0.66 6.65 Trang 86 Đồ án tốt nghiệp 48h 54.10 0.49 6.82 60h 63.36 0.39 6.98 72h 51.52 0.55 6.82 84h 44.69 0.75 6.60 8.00 70.00 7.00 6.00 44.74 47.99 6.82 6.65 6.48 6.43 63.36 6.98 54.10 6.82 6.60 60.00 51.52 50.50 44.69 50.00 5.00 40.00 4.00 30.00 3.00 % BRIX % DNS 20.00 2.00 1.00 % HMF 0.77 0.69 0.66 0.49 0.39 0.55 0.75 0.00 10.00 0.00 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h Đồ thị 3.15 Ảnh hưởng thời gian ủ đến hàm lượng đường, HMF độ Brix Trong trình thủy phân, thời gian tác dụng enzyme lên chất dài hay ngắn phụ thuộc nhiều yếu tố thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme cắt liên kết chất Khi chất cần thủy phân hết trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng tốt Theo đồ thị 3.15 nhận thấy hàm lượng glucose thay đổi theo mốc thời gian điều kiện thủy phân, đó, hàm lượng glucose tăng dần từ mốc 12h đến mốc 60h cao cao giảm dần thời gian kéo dài Như vậy, thời gian thích hợp để q trình thủy phân xảy hiệu 60h, lúc hàm lượng đường đạt 63,36% (theo bảng 3.15) Trang 87 Đồ án tốt nghiệp Độ Brix có biến thiên tương tự hàm lượng glucose, đạt cao thời gian 60h 6,98% Hàm lượng HMF tỷ lệ nghịch với hàm lượng đường, HMF giảm lượng đường cao 3.3.4 Ảnh hưởng pH tới trình thủy phân Bảng 3.12 kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân pH DNS (%) HMF (%) Độ brix (oBx) pH3 43.57 0.75 5.85 pH4 54.80 0.53 6.14 pH5 68.68 0.35 6.52 pH6 61.77 0.60 6.30 7.00 5.85 6.00 6.52 68.68 6.30 61.77 80.00 70.00 60.00 54.80 5.00 4.00 6.14 50.00 43.57 % HMF 40.00 3.00 30.00 2.00 1.00 % BRIX % DNS 20.00 0.75 0.53 0.60 0.35 10.00 0.00 0.00 pH3 pH4 pH5 pH6 Đồ thị 3.16 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường, HMF độ Brix Mỗi enzyme có giá trị pH thích hợp, khơng cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: chất, dung dịch đệm, nhiệt độ… Enzyme nhạy cảm với pH mơi trường pH ảnh hưởng đến mức độ inon hóa chất đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme Chính pH có ảnh hưởng mạnh đến phản ứng enzyme Mỗi enzyme thích hợp với vùng pH định Trang 88 Đồ án tốt nghiệp Từ biểu đồ 3.16 ta thấy pH tối ưu cho trình thùy phân pH cho hàm lượng đường cao đạt 68,68% độ brix cao đạt 6,52 % pH thấp cao , hàm lượng đường thủy phân giảm 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ tới trình thủy phân Bảng 3.13 kết thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Nhiệt độ DNS (%) HMF (%) Độ brix (oBx) 30oC 52.77 0.78 5.25 40oC 56.72 0.56 5.73 50oC 71.13 0.39 6.06 60oC 50.32 0.69 5.69 7.00 6.00 5.00 5.73 5.25 52.77 80.00 71.136.06 5.69 56.72 50.32 70.00 60.00 50.00 4.00 40.00 3.00 30.00 2.00 1.00 % HMF % BRIX % DNS 20.00 0.78 0.56 0.39 0.69 0.00 10.00 0.00 30oC 40oC 50oC 60oC Đồ thị 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đường, HMF độ Brix Nhiệt độ yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme , chúng ảnh hưởng đến khả thủy phân chất Thông thường hiệu lực phản ứng tăng đến giới hạn nhiệt độ định, vượt qua giới hạn hiệu lực phản ứng giảm Emzyme chất protein, enzyme hoạt động khoảng nhiệt độ định, khoảng nhiệt khơng làm enzyme bị biến tính , hiệu lực Khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng , tiếp tục tăng đến mức mặt vận tốc phản ứng tăng thông Trang 89 Đồ án tốt nghiệp thường, mặt khác enzyme bắt đầu bị biến tính, hoạt tính xúc tác giảm nhanh, lúc hiệu lực phản ứng dần tiến đến Do hàm lượng đường trình thủy phân đạt cao lúc nhiệt độ đạt giá trị tối ưu Từ bảng 3.17 cho thấy hàm lượng đường thủy phân nằm mức nhiệt độ 50oC cao đạt 71,13%, vượt hay thấp mức nhiệt độ trình thủy phân giảm cho lượng đường thấp Vì vậy, nhiệt độ 50oC yếu tốc cực đại cho trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp 3.4 Quy hoạch thực nghiệm 3.4.1 Xác định giá trị tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến khả thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp Bảng 3.14 Hàm lượng đường, HMF độ brix theo thực nghiệm Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 DNS 48,31 31,34 59,85 65,28 60,00 54,97 64,85 62,23 60,48 HMF 0,66 0,68 0,63 0,34 0,41 0,41 0,52 0,58 0,51 Nghiệm thức NT10 NT11 NT12 NT13 NT14 NT15 NT16 NT17 NT18 NT19 Brix 5,50 4,50 5,53 6,62 5,86 5,58 7,35 6,35 6,67 DNS 64,27 62,74 56,60 51,86 63,05 43,25 56,10 69,90 69,06 71,81 HMF 0,58 0,59 0,66 0,63 0,51 0,66 0,62 0,34 0,36 0,32 Brix 7,32 3,96 5,56 5,42 6,83 5,75 6,09 7,36 7,25 7,73 Bảng 3.15 Hàm lượng đường theo thực nghiệm phương trình hồi qui Số thí nghiệm Biến số mã hóa X1 X2 1,5 50 1,5 50 2,0 50 2,0 50 1,5 70 1,5 70 2,0 70 2,0 70 1,5 50 X3 45 45 45 45 45 45 45 45 55 Trang 90 X4 6 6 Y Ŷ 48.31 31.34 59.85 65.28 60 54.97 64.85 62.23 60.48 53.6494 26.0006 57.7081 67.4219 53.9406 61.0294 66.2719 60.8081 54.4206 Đồ án tốt nghiệp 10 1,5 50 11 2,0 50 12 2,0 50 13 1,5 70 14 1,5 70 15 2,0 70 16 2,0 70 17 1,75 60 18 1,75 60 19 1,75 60 (Với Y : Nồng độ đường theo thực 55 55 55 55 55 55 55 50 50 50 nghiệm, Ŷ: 64.27 70.3294 62.74 64.1619 56.6 55.1781 51.86 57.1994 63.05 57.7106 43.25 41.1081 56.1 58.2419 69.90 69.09 71.81 nồng độ đường theo phương trình hồi qui) Phương trình hồi qui có dạng: Ŷ = bo + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b12x12 + b13x13 + b14x14 + b23x23 + b24x24 + b34x34 + b123x123 + b124x124 + b134x134 + b234x234 + b1234x1234 Các hệ số phương trình xác định sau: 16 bj  x i 1 ji yi 16 Các hiệu ứng tương tác xác định tương tự hiệu ứng tuyến tính: 16 bj   (x x ) y i 1 j l i i 16 Giá trị b: bo 56.57375 b23 -2.72 b1 0.15625 b24 -4.91 b2 2.28875 b34 -4.19375 b3 0.465 b123 -0.525 b4 0.72 b124 -2.0675 b12 1.03375 b134 -0.5525 b13 1.8925 b234 1.45125 b1234 5.714375 b14 Trang 91 Đồ án tốt nghiệp Để kiểm định tính ý nghĩa hệ số phương trình hồi qui tương thích phương trình hồi qui với thực nghiệm, ta phải tìm phương sai tái thí nghiệm tâm Giá trị trung bình thí nghiệm tâm: Y u 1 Phương sai tái hiện: TB N  (Y Sth2  U 1 U  YTB0 ) n 1  Với n = số thí nghiệm tâm Phương sai hệ số: S bj   70,2567 3.9721  1.98605 1 S th N S bj  Với N = 16 thí nghiệm S th 1.409   0.3523 16  Sbj  0.3523 Đánh giá mức ý nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student: tj  bj S bj  tij với tij: mức p = 0.05, bậc tự f = n - → t(0.05;2) = 4.3 (Tra bảng tiêu chuẩn Student) t0  b0 Sbj  t0  56.57  161.62 0.352 161,62 > 4.3 tương tự ta tinh to = 160.722 t23 = 7.727 > 4.3 t1 = 1.467 < 4.3 t24 = 13.949 > 4.3 t2 = 6.502 > 4.3 t34 = 11.914 > 4.3 t3 = 1.321 < 4.3 t123 = 1.491 < 4.3 t4 = 2.045 < 4.3 t124 = 5.874 > 4.3 t12 = 2.937 < 4.3 t134 = 1.570 < 4.3 t13 = 5.376 > 4.3 t234 = 4.123 < 4.3 t14 = 7.259 > 4.3 t1234 = 16.234 > 4.3 Vì to, t1, t2,t13,t14, t23,t24, t34,t124,t1234 > tlt, t3, t4,t12, t123, t134, t234 < tlt Trang 92 Đồ án tốt nghiệp nên có hệ số b0,b1,b2, b13, b14, b23, b24, b34, b1234 có ý nghĩa, hệ số b3, b4, b12, b124, b134, b234 khơng có ý nghĩa cần loại khỏi phương trình Vậy phương trình hồi quy có dạng: Ŷ = 56.574 + 0.5163x1 + 2.2888x2 +1.8925x1x3 +2.555x1x4 - 2.72x2x3 -4.91x2x4 4.19375x3x4 - 2.0675x1x2x4 + 5.71438x1x2x3x4 Đánh giá mức độ tương thích phương trình theo tiêu chuẩn Fisher: Tính giá trị Ŷ: kết trình bày bảng 3.15 16 Phương sai tương thích: S tt2   (Y i 1 U ^  yi )2 N l  23.4537  4.69074 16  11 Với N: Số thí nghiệm = 16 l: Số hệ số có ý nghĩa = 11 Ftn  Giá trị chuẩn Fisher mức p = 0.05 ; S tt 4.69074   2.36 S th2 1.98605 f1  N  l ; f  n 1 ( tra bảng tiêu chuẩn Fisher) F0.05;5,   19.3  Flt Điều kiện để mơ hình tương thích : Ftn  Flt Và ta có ftn =2.36 < flt Vậy phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm Từ phương trình hồi qui thu được, tiếp tục tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm theo kế hoạch leo dốc nhằm xác định yếu tố tối ưu cho trình thủy phân tạo đường glucose cao Trong đó, yếu tố cố định nồng enzyme Bố trí thí nghiệm leo dốc phần quan trọng tối ưu hóa thực nghiệm Q trình leo dốc giai đoạn thứ hai q trình bố trí thí nghiệm, q trình giai đoạn Để có giai đoạn hai ta phải xử lý thông số giai đoạn một, lập phương trình hồi qui phương trình tương quan tuyến tính Trang 93 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.16 Bố trí thí nghiệm leo dốc Nghiệm Cơ chất thời gian nhiệt độ pH DNS HMF BRIX NT1 1,75g 60h 50oC 77.17 0.36 7.85 NT2 2g 65h 55oC 5,5 64.08 0.41 6.79 NT3 2,25g 70h 60oC 56.31 0.54 5.96 NT4 2,5g 75h 65oC 6,5 52.73 0.68 4.97 NT5 3g 80h 70oC 47.97 0.90 4.58 thức 9.00 8.00 90.00 77.177.85 80.00 6.79 64.08 7.00 6.00 70.00 5.96 56.31 52.73 4.97 60.00 47.974.58 50.00 % HMF 4.00 40.00 % BRIX 3.00 30.00 5.00 2.00 1.00 % DNS 20.00 0.36 0.41 0.68 0.54 0.90 0.00 10.00 0.00 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Đồ thị 3.18 Đồ thị biểu diễn dường leo dốc hàm lượng đường, HMF birx Bố trí nghiệm thức với thí nghiệm có yếu tố tăng dần theo bảng 3.18, nhận thấy yếu tố tăng dần hàm lượng đường giảm dầm từ mức sở hàm lượng HMF lại tăng dần Như tố ưu cho trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp là: 1,75g chất ủ 60h nhiệt độ 50oC pH5 Trong bốn yếu tố tác động đến trình thủy phân, yếu tố thời gian có ảnh hưởng lớn (b2 = 2,28875), đến pH (b4 = 72) , nhiệt độ (b3 = 0.465) cuối chất (b1 = 0.1562) Trang 94 Đồ án tốt nghiệp Xét tương tác yếu tố, kết cho thấy yếu tố có tương tác Trong tương tác yếu tố chất pH mạnh (b13 = 1,895) Giá trị lân cận tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân chất 1,75 g, thời gian ủ 60 h nhiệt độ 50 0C pH = Trang 95 Đồ án tốt nghiệp Chương – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã xác định số thành phần sinh hóa rong Vaucheria spp sở để nghiên cứu thêm loài rong chưa khai thác phục vụ cho nhu cầu người nhiều Khảo sát yếu tố tiền xử lý thích hợp cho rong Vaucheria spp làm sở để thực trình thủy phân tạo đường glucose Từ thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp kết luận yếu tố tốt chất 1,75 g, thời gian ủ 60h nhiệt độ 500C pH = 4.2 Kiến nghị Nhu cầu tìm nguồn lượng lớn, việc tìm nguồn nguyên vật liệu để giải vấn đề cấp bách Muốn thực mục tiêu cần phải: Trang bị kiến thức nghiên cứu enzyme trình thủy phân loại rong cho hàm lượng đường cao tạo nguồn sở cho trình lên men sản xuất bio ethanol Xây dựng trang trại ni trồng rong tảo để có nguồn vật liệu dồi tốt Nghiên cứu phương pháp sử dụng bã rong sau q trình lên men phục vụ nơng nghiệp chăn nuôi Trang 96 ... liệu sinh học từ tảo thu nhiều kết khả quan từ nguồn nguyên liệu Và việc xác định thành phần hóa sinh rong tảo tối ưu hóa q trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp đóng vai trị... Vaucheria spp Xác định thơng số thích hợp cho q trình tiền xử lý mẫu rong trước tiến hành thủy phân tạo đường Xác định yếu tố ảnh hưởng trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp Bố... xuất xăng sinh học từ tảo Đề tài ? ?Tối ưu hóa q trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp. ” nhu cầu cấp thiết giải vấn đề Tình hình nghiên cứu: Tình hình nghiên cứu rong biển giới: