Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thụ muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn

Đồ Án Tốt Nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THU MUỐI VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GIẢM NHIỄM MẶN Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Hoàng Quốc Khánh HVCH Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Châu Thị Thùy Linh MSSV: 1411100757 Lớp: 14DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2018 Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Hồng Quốc Khánh HVCH Ngô Đức Duy, thực Viện Sinh học Nhiệt đới Những số liệu kết phân tích đề tài hồn tồn trung thực, khơng chép từ nguồn tài liệu tham khảo khác hình thức Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu trích dẫn cơng bố công khai báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo đồ án Nếu có chép khơng trung thực đồ án này, người thực đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech trước Ban Giám Hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ngày … tháng … năm 2018 Sinh viên thực Châu Thị Thùy Linh Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ẢNH .ii DANH MỤC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.2 Tình hình nghiên cứu nước Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 6 Các kết đạt Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình xâm nhập mặn Việt Nam hướng giải 1.1.1 Tình hình xâm nhập mặn Việt Nam 1.1.2 Nguyên nhân gây xâm nhập mặn 1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn 10 1.2 Các chế khử muối 12 1.2.1 Cơ chế khử muối tự nhiên 12 1.2.2 Cơ chế khử muối thực vật 12 1.2.3 Cơ chế khử muối động vật 13 1.2.4 Cơ chế khử muối vi sinh vật 14 1.3 Giới thiệu nhóm vi khuẩn quang hợp 15 1.4 Định danh phương pháp sinh học phân tử 17 1.4.1 Nguyên tắc 17 Đồ Án Tốt Nghiệp 1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật 17 1.4.3 PCR định danh vi sinh vật 18 1.4.4 Xây dựng phát sinh loài 21 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 22 2.2.2 Giống vi khuẩn 22 2.2.3 Hóa chất 22 2.2.4 Các phần mềm sử dụng 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 24 2.3.2 Thu mẫu 25 2.3.3 Tăng sinh 27 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp 27 2.3.5 Bảo quản 28 2.3.6 Chọn lọc chủng vi khuẩn có khả chịu mặn 28 2.3.7 Chọn lọc chủng vi khuẩn có khả hấp thu mặn 28 2.3.8 Định danh chủng vi khuẩn 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 3.1 Kết tăng sinh vi khuẩn 32 3.2 Kết phân lập vi khuẩn 33 3.3 Kết quan sát hình thái vi khuẩn 36 3.4 Kết khảo sát khả chịu mặn 39 3.5 Kết khảo sát khả hấp thụ mặn 42 3.6 Định danh 45 3.6.1 Ly trích, thu nhận DNA 44 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.6.2 Nhân sợi DNA phương pháp PCR 45 3.6.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng liệu gen NCBI 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 53 Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BIM Basic Isolation Media FO Forward Osmosis GM Glutamate – Malate IC Ion Exchange NSSW Nutrient Supplemented Seawater RO Reverse Osmosis SSI Rhodobacter Sphaeroides i Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơ chế dung nạp muối thực vật: hình thành tinh thể Avicennia germinans (A) Atriplex (B) 13 Hình 1.2 Giải thích nguyên nhân hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng (Halorhodopsin) tác động ánh sáng đặc trưng Cl- 14 Hình 2.1 Mơ vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa nằm vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đơng 25 Hình 2.2 Một góc đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đơng, rừng phịng hộ Nhưng Miên vị trí lấy mẫu 26 Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 30 Hình 3.1 Kết mẫu RL19 mẫu RL6 tăng sinh thành công 32 Hình 3.2 Kết phân lập sau ngày môi trường thạch BIM chủng CM24 (hình trái) kết làm chủng CM24 chuyển dần sang đỏ sau – ngày (hình phải) 35 Hình 3.3 Kết phân lập mơi trường thạch BIM số chủng vi khuẩn 35 Hình 3.4 Hình thái tế bào số chủng nhóm vi khuẩn quang hợp phân lập vật kính 100X 37 Hình 3.5 Chủng RL1 phát triển nồng độ muối Nhưng nồng độ muối 20‰ phát triển vượt trội nồng độ muối khác, giá trị OD660 đạt 0,504 sau ngày khảo sát 39 Hình 3.6 Chủng RL8.1 phát tốt nồng độ nồng độ muối 10, 15, 20‰ có phát triển cao hẳn, giá trị OD660 nồng độ 10‰ đạt 0,824 sau ngày khảo sát 39 Hình 3.7 Chủng 34.3 phát triển tốt nồng độ, chúng phát triển tốt nồng độ muối 5‰, giá trị OD660 đạt 0,666 sau ngày nồng độ muối 20%, giá trị OD660 đạt 0,658 sau ngày khảo sát 40 ii Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.8 Chủng 24.1 phát triển tốt nồng đồ muối, chúng phát triển ổn định tốt nhất, nồng độ 5‰ giá trị OD660 đạt 0,868, nồng độ 20% giá trị OD660 đạt 0,585 sau ngày khảo sát 40 Hình 3.9 Nồng độ muối chủng vi khuẩn (‰) sau kiểm tra 43 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA chủng vi khuẩn 44 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm ly trích gene DNA gel agarose 1% 45 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm ly trích gene DNA gel agarose 1% sau tinh 45 iii Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các tính chất vi khuẩn quang hợp 16 Bảng 1.2 Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA 20 Bảng 3.1 Giá trị pH mẫu tăng sinh thành công tỉnh Long An tỉnh Cà Mau 31 Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn phân lập 33 Bảng 3.3 Kết nhuộm Gram chủng 36 Bảng 3.4 Giá trị OD660nm chủng độ mặn 20‰ sau ngày 41 Bảng 3.5 Giá trị OD660 mật độ tế bào (cfu/ml) chủng vi khuẩn sau 48 42 iv Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Theo báo cáo Tổ chức Phát triển Nước Thế giới Liên Hiệp Quốc (The United Nations World Water Development) có khoảng 22% nước dùng cho công nghiệp, 8% nước dùng cho sinh hoạt người 70% nước dùng cho nông nghiệp Nhưng có tới 90% nước dùng cho nơng nghiệp phần lớn nước phát triển (FAO, 2011a) mà khơng có biện pháp sử dụng hiệu hay tiết kiệm, bên cạnh dự kiến tiêu thụ nước cho nông nghiệp tăng khoảng 20% toàn cầu vào năm 2050 (WWAP, 2012) Rất nhiều nguyên nhân gây ô nhiễm nước nông nghiệp ngày gia tăng, nhiễm trầm trọng xâm nhiễm mặn biến đổi khí hậu nước biển dâng Với số liệu thống kê cho thấy rằng, có ba phần tư bề mặt Trái đất bao phủ nước, 97% lượng nước dạng nước mặn sử dụng trực tiếp cho ăn uống nông nghiệp Trong 3% nước cịn lại có khoảng 0,5% có sẵn dạng nước khơng phân bố tồn giới Thêm vào dân số tăng nhanh, sản xuất nông nghiệp, công nghiệp phát triển ạt biến đổi khí hậu gây nhiều vấn đề môi trường Một vấn đề môi trường phổ biến xảy xâm nhập mặn vào vùng đất sản xuất nông nghiệp (Freeze Cherry 1979; Fang 1997; Todd and Mays 2005) Sự xâm nhập từ nước biển mối quan tâm toàn cầu nghiêm trọng gặp phải vùng lãnh thổ ven biển Bắc Phi, Trung Đông, Bờ biển Địa Trung Hải, Trung Quốc, Mexico, Đại Tây Dương, Hoa Kỳ Việt Nam Trong hàng triệu năm qua, vi sinh vật – bậc thầy thích ứng, sống sót trái đất mà khơng phải sử dụng nhiều lượng tài nguyên không ảnh hưởng đến môi trường sống Cụ thể, khử muối lượng mặt trời thông qua vi khuẩn quang hợp hội có tiềm để khai thác mục đích Các vi khuẩn Đồ Án Tốt Nghiệp RL1.2 Rhodobacter sp JA487 82 Rhodobacter johrii Rhodobacter sphaeroides JA914 Rhodobacter sp KCI-b Rhodobacter sp CM34.3 CM24.1 Hình 3.13 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA chủng RL1.2, CM34.3 CM24.1 với số chủng khác ngân hàng gen NCBI Tiến hành so sánh vùng gen mẫu phân lập với vùng gen bảo tồn chủng NCBI, đặc điểm hình thái học chủng tương đồng có kết sau: Chủng RL1.2 có mối quan hệ gần với Rhodobacter sphaeroides JA914 có mức độ tương đồng 98% Dựa vào kết so sánh trình tự gen so sánh hình thái chủng RL1.2 lồi Rhodobacter sphaeroides Chủng CM24.1 có mối quan hệ gần với Rhodobacter sphaeroides JA914 có mức độ tương đồng 99% % Dựa vào kết so sánh trình tự gen so sánh hình thái chủng CM24.1 lồi Rhodobacter sphaeroides Chủng CM34.3 có mối quan hệ gần với Rhodobacter sp, với mức độ tương đồng 96% Dựa vào kết so sánh trình tự gen so sánh hình thái chủng RL34.3 loài Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sphaeroides (SSI) thuộc nhóm vi khuẩn quang hợp tía, khơng lưu huỳnh Khuẩn lạc SSI phát triển tốt môi trường dị dưỡng điều kiện chiếu sáng thích hợp Màu sắc đặc trưng cho vi khuẩn nhóm màu đỏ điều kiện 50 Đồ Án Tốt Nghiệp chiếu sáng có màu xám đen ủ tối cấy sâu SSI thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-), hình oval Dựa vào cơng bố Saijai Panwichian cộng (2010), chủng vi khuẩn tía, không lưu huỳnh phân lập từ ao, đầm tôm, vùng nước nông [26] công bố Kei Sasaki cộng (2017) nói chủng SSI chứng minh tăng trưởng tốt, khả loại bỏ Na tối đa 39,3% điều kiện chiếu sáng 36,7% điều kiện tối [13] So sánh với kết đạt chủng RL1.2, CM24.1 CM34.3 với kết đặc điểm hình thái khẳng định RL1.2, CM24.1 CM34.3 thuộc chủng Rhodobacter sphaeroides 51 Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài tiến hành thí nghiệm để phân lập định danh vi khuẩn có khả chịu mặn hấp thu mặn từ mẫu nước Long An Cà Mau Các kết đạt gồm có: - Phân lập 44 chủng vi khuẩn môi trường thạch BIM 13 chủng phân lập từ mẫu ruộng Long An 31 chủng phân lập từ mẫu Cà Mau - Sau tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc hình ảnh nhuộm Gram, có 32 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (-) 12 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (+) Loại bỏ chủng Gram (+), lại 32 chủng - Kết khảo sát khả chịu mặn, hầu hết chủng vi khuẩn thích nghi với nồng độ muối khảo sát có 13 chủng có giá trị OD660nm > 0.5 nồng độ muối 20‰ Gồm có: RL1.2, RL3.1, RL10.1, CM7.1, CM11.1, CM12.1b, CM23.1, CM24.1, CM28.1, CM30.1, CM34.3 CM37.1 - Kết khảo sát khả hấp thụ muối, chủng hấp thụ muối cao nhất, (loại bỏ 1%) RL1.2, CM24.1, CM34.3 - Tiến hành ly trích DNA, thực phản ứng PCR chủng tốt Từ kết cho thấy chủng RL1.2, CM24.1, CM34.3 tuyển chọn có khả thuộc lồi Rhodobacter sp gần chi Rhodobacter sphaeroides 4.2 Kiến nghị Do lượng thời gian có hạn nên q trình nghiên cứu số vấn đề chưa thục Cần thực thêm số khảo sát: - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu mặn nhằm đưa môi trường tối ưu nhất, phục vụ cho thử nghiệm hấp thu mặn thí nghiệm khác - Khảo sát thêm khả ứng dụng chủng Rhodobacter sphaeroides thực tế 52 Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bùi Đoàn Phượng Linh, Hồng Hải Nhi, Hoàng Phương Thảo, Nguyễn Thanh Tú (2014), “Bài giảng Vi khuẩn quang hợp cố định nito” Trường đại học Đồng Nai [2] Mỵ Trần Hương Trà cộng (2015), “Nghiên cứu nhân nuôi sử dụng vi khuẩn Rhodobacter để xử lý chất hữu sulfide nước” Trường đại học Sài Gòn Tài liệu tiếng anh [3] Coenye T, Vandamme P (November 2003) “Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes” FEMS Microbiology Letters 228 (1): 45 – PMID 14612235.doi:10.1016/S0378 - 1097 (03)00717-1 [4] El-Dessouky, H.T and H.M Ettouney, 2002 “Fundamentals of salt water desalination” Elsevier [5] Ellis, R.A., C.C Goertemiller, and D.L Stetson, 1977 Significance of extensive /`leaky/' cell junctions in the avian salt gland Nature, 268(5620): p 555-556 [6] Flowers, T.J and T.D Colmer, 2015 Plant salt tolerance: adaptations in halophytes Annals of botany, 115(3): p 327-331 [7] Hall, J.E., 2010 “Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology” Elsevier Health Sciences [8] Handwerk, Brian (May 6, 2005) Egypt’s “King Tut Curse” Caused by Tomb Toxins_National Geographic [9] Hildebrandt, J.-P., 2001 Coping with excess salt: adaptive functions of extrarenalosmoregulatory organs in vertebrates Zoology, 104(3–4): p 209-220 (19) [10] Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.Th (Eds.) (2009) “The Purple 53 Đồ Án Tốt Nghiệp Phototrophic Bacteria” [27] [11] Jaime M Amezaga, Anna Amtmann*, Catherine A Biggs, Tom Bond, Catherine J Gandy, Annegret Honsbein, Esther Karunakaran, Linda Lawton, Mary Ann Madsen, Konstantinos Minas, and Michael R Templeton (2014) “Biodesalination: A Case Study for Applications of Photosynthetic Bacteria in Water Treatment” (3) [12] Jay ZJ, Inskeep WP (July 2015) “The distribution, diversity, and importance of 16S rRNA gene introns in the order Thermoproteales” Biology Direct 10 (35):35 PMC 4496867 PMID 26156036.doi: 10.1186/s13062-015-0065-6 [13] Kei Sasaki, Yuichiro Hosokawa, Kenji Takeno, Ken Sasaki (2017) “Removal of Sodium from Seawater Medium Using Photosynthetic Bacteria”, 6, 133-143 [14] Kim, K., E Seo, S.-K Chang, T.J Park, and S.J Lee, 2016 Novel water filtration of saline water in the outermost layer of mangrove roots Scientific Reports, 6: p 20426 [15] Krishnamurthy, P., P.A Jyothi-Prakash, L.I.N Qin, J.I.E He, Q Lin, C.-S Loh, and P.P Kumar, 2014 Role of root hydrophobic barriers in salt exclusion of a mangrove plant Avicennia officinalis Plant, Cell & Environment, 37(7): p 1656-1671 [16] Manousaki, E and N Kalogerakis, 2010 Halophytes Present New Opportunities in Phytoremediation of Heavy Metals and Saline Soils Industrial & Engineering Chemistry Research, 50(2): p 656-660 (12) [17] Maribel L Dionisio-Sese!, Satoshi Tobita (2000) “Effects of salinity on sodium content and photosynthetic responses of rice seedlings differing in salt tolerance”, pp 5458 [18] Mitra, A., 2013 Sensitivity of mangrove ecosystem to changing climate Berlin: Springer [19] M.M Lasat, et al., Physiological characterization of root Zn2+ absorption and translocation to shoots in Zn hyperaccumulator and nonaccumulator species of Thlaspi, Plant Physiol 112 (1996) 1715–1722 54 Đồ Án Tốt Nghiệp [20] Narong Wongkantrakorn, Yukari Sunohara and Hiroshi Matsumoto (2009) “Mechanism of growth amelioration of NaCl-stressed rice (Oryza sativa L.) by daminolevulinic acid”, 89–95 [21] Primers, 16S ribosomal DNA – Francois Lutzoni’s Lab [22] Schmidt-Nielsen, K., 1997 Animal Physiology: Adaptation and Environment Cambridge University Press [23] Shabala, S., A Moreno, Y Hariadi, A Mackay, Y Tian, and J Bose Halophytes: what makes them special? Revealing ionic mechanisms of salinity tolerance in XVIII International Botanical Congress 2011 [24] Taheri, R and M Shariati, 2013 Study of the inhibitory effect of the media culture parameters and cell population to increase the biomass production of Dunaliella tertiolecta Progress in Biological Sciences, 3(2): p 123-133 [25] Thanawan Kantha & Duangporn Kantachote & Nikkajit Klongdee, (2015) “Potential of biofertilizers from selected Rhodopseudomonas palustris strains to assist rice (Oryza sativa L subsp indica) growth under salt stress and to reduce greenhouse gas emissions”, 65:2109–2118 [26] Saijai Panwichian, Duangporn Kantachote, Banjong Wittayaweerasak, Megharaj Mallavarapu (July 15, 2010) “Isolation of purple nonsulfur bacteria for the removal of heavy metals and sodium from contaminated shrimp ponds”, 0717-3458.[26] [27] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (January 1991) “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study” Journal of Bacteriology 173 (2): 697 – 703 PMC 207061 PMID 1987160 [28] Woese CR, Fox GE (November 1977) “Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms” Prceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 (11): 5088 – 90 Bibcode:1977PNAS…74.5088W.(22) 55 Đồ Án Tốt Nghiệp [29] Desalinated water is planned to meet 30% of Singapore’s future water needs by 2060 Existing (25% of Singapore’s 2017 water demand) [30] Federman, Josef (May 30, 2014) "Israel solves water woes with desalination" Associated Press Archived from the original on June 2, 2014 Retrieved May 30, 2014./37 Tài liệu internet [31] http://www.hmpdacc.org/tools_protocols.php#sequencing [32] https://vi.wikipedia.org/wiki/Độ_mặn [33] https://voer.edu.vn/m/mot-so-nhom-vi-khuan/112d7119 56 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A: Kết tăng sinh thành công mẫu Long An Cà Mau Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Kết phân lập mẫu từ tỉnh Long An tỉnh Cà Mau Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Một số hình ảnh thu mẫu thực tế ... Chọn lọc vi khuẩn quang hợp 27 2.3.5 Bảo quản 28 2.3.6 Chọn lọc chủng vi khuẩn có khả chịu mặn 28 2.3.7 Chọn lọc chủng vi khuẩn có khả hấp thu mặn 28 2.3.8 Định danh. .. lọc định danh chủng vi khuẩn quang hợp có khả hấp thu muối định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn? ?? nhằm góp phần vào định hướng phát triển nông nghiệp bền vững chủ động ứng phó giải phần tốn xâm nhiễm. .. agar Khuẩn lạc đặc trưng: trịn, lồi, bóng, màu đỏ/hồng/cam/vàng Hình thái: hình trứng/thẳng/cong Khảo sát khả chịu mặn Vi khuẩn có khả chịu mặn cao Khảo sát khả hấp thu mặn Vi khuẩn hấp thụ mặn