Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật

Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thi ̣ Thanh THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thi ̣ Thanh THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN VI RÚT PRRS TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Tường Vân PGS TS Võ Thị Thương Lan Hà Nội – 2013 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vi rút gây ra, có khả lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế Ở Việt Nam bệnh đƣợc gọi bệnh “lợn tai xanh” lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trƣng bệnh tƣợng sẩy thai lợn nái chửa triệu chứng bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt lợn cai sữa Bệnh đƣợc phát lần Hoa Kỳ năm 1987 Sau xuất nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)… Từ năm 1992, bệnh gây ổ dịch lớn nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn giới Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp gián tiếp) bệnh lợn tai xanh năm gần lớn so với thiệt hại bệnh khác gây lợn Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu tổn tất bệnh gây khoảng 560 triệu USD việc tiêu huỷ lợn chết lợn ốm, chi phí chống dịch xử lý môi trƣờng Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát lần vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ vào tỉnh phía Nam Tuy nhiên dịch bệnh nặng đƣợc thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Đến bệnh trở nên khó có thể kiểm soát đƣơ ̣c lây lan ngày rộng tập quán hệ thống chăn nuôi heo phức tạp Việt Nam Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp đƣợc sử dụng tiêm phòng vắcxin kết hợp biện pháp thú y Gần có số lƣợng hạn chế vắcxin bất hoạt nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng chủng châu Mỹ châu Âu Tuy nhiên vắcxin dạng có số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, vắcxin nhƣợc độc ta ̣o mức độ bảo vệ tốt chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy phát triển độc tính trở lại Hiện thị trƣờng Việt Nam có hai loại vắcxin chống Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm PRRSV dạng nhƣng giá thành cao, hiệu lại thấp có khả điều trị các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắ cxin ăn đƣ ợc (edible vaccine) sản phẩm công nghệ sinh học đại Thực chất vắcxin thực vật vắcxin tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn So với hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất thu sinh khối; kháng nguyên biểu thực vật ổn định nhiệt độ phịng nên dễ bảo quản sử dụng; dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá) nấu chín (hạt, củ; an tồn; đặc biệt vắcxin ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể hệ thống niêm mạc ruột hiệu vắcxin tiêm Từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, chúng tơi tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu kháng nguyên vi rút PRRS tế bào thực vật”, đƣợc tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế KH&CN theo nghị định thƣ hai nƣớc Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc đậu tương” giai đoạn 2011-2013 Đề tài đƣợc tiến hành Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho số kháng nguyên vi rút PRRS vào tế bào thực vật ii) Đánh giá hiệu sử dụng vector thông qua việc phân tích biểu kháng nguyên tế bào thuốc BY-2 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS) 1.1.1 Giới thiệu chung Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vi rút gây ra, có lan khả lây nhanh ghép với loại mầm bệnh khác làm ốm chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59] Ở Việt Nam bệnh đƣợc gọi bệnh “lợn tai xanh” lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trƣng bệnh tƣợng sẩy thai lợn nái chửa triệu chứng bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt lợn cai sữa [61] Bệnh đƣợc mô tả lần Bắc Mỹ vào năm 1987 châu Âu vào năm 1990, Đức, Pháp Anh sau lan tràn khắp châu Âu Năm 1998, bệnh đƣợc phát châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59] Thời gian đầu chƣa xác định đƣợc nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác [59, 60]:  Bệnh bí hiểm lợn (Mystery Swine Disease, MDS)  Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED)  Hội chứng hô hấp sẩy thai lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS)  Hội chứng hô hấp vô sinh lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS) Năm 1992, hội nghị quốc tế sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y giới (OIE) đã trí đă ̣t tên cho bê ̣nh “H ội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7] Kể từ đó, tên trở thành tên gọi thức bệnh Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ Đến nay, bệnh bùng phát lây lan khắp tỉnh thành nƣớc [28] 1.1.2 Triệu chứng bệnh Bệnh xảy tất lứa tuổi thƣờng biểu hai trạng thái: sinh sản hô hấp [28, 61, 62]:  Rối loạn sinh sản: tăng số lƣợng lợn sinh bi ̣ch ết chết bào thai (25-35%), lợn sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa lợn nái nuôi làm tăng thêm tỉ lê ̣ lợn chết trƣớc cai sữa  Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi nặng 1.2 VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan phân lập đƣợc vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau Mỹ, Đức [59, 61] Đến nay, thơng tin loại vi rút đƣợc nghiên cứu rõ Bệnh lợn tai xanh gây vi rút PRRS thuô ̣c chi Arterivirus, họ Arteriviridae, Nidovirales, có genom ARN sợi đơn dƣơng [18] 1.2.1 Đặc điểm hình thái PRRSV vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngồi với đƣờng kính virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đƣờng kính từ 30 – 35 nm Đồng thời, PRRSV vi rút ARN, có gen phân tử ARN sợi đơn dƣơng, mang đặc điểm chung chi Arterivirus [18, 60, 61] Hình 1.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo vi rút PRRS gây bê ̣nh lơ ̣n tai xanh [61] 1.2.2 Cấu trúc di truyền Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hệ gen vi rút PRRS ARN sợi đơn dƣơng, có kích thƣớc khoảng 15 kb chứa khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b 3-7 Trong ORF1a 1b mã hóa cho protein phi cấu trúc nhƣ replicase, polymerase tham gia vào trình nhân vi rút Các ORF 2-7 mã hóa cho protein cấu trúc bao gồm phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), phân tử protein mạng lƣới (M) protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1.2) Hình 1.2 Mơ hình cấu trúc hệ gen vi rút PRRS [61] Dựa vào phân tích cấu trúc gen ngƣời ta xác tính đƣợc nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông vi rút Lelystad) gồm phân nhóm (subtype) đƣợc xác định Nhóm II gồm vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi VR-2332) [18, 62] Gần đây, biến thể nhóm II có độc lực cao xuất gây nhiều tổn thất châu Á [28, 61] Mặc dù đơi triệu chứng gây bệnh hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhƣng nghiên cứu cho thấy hai nhóm có khác biệt lớn gen (mức độ tƣơng đồng 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch nhƣ độc lực vi rút [7, 42] Điều có nghĩa vắcxin đƣợc làm từ chủng PRRSV bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ngƣời ta chứng minh có biến dị di truyền mạnh nhóm phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide axít amin khung đọc mở (ORFs).Tƣơng đồng trình tự axít amin VR-2332 so với LV 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 5), 91% (ORF6) 74% (ORF7) [7, 54] Phân tích trình tự cho thấy vi rút tiến hố Giải trình tự phần gen riêng biệt, toàn hệ gen, đặc biệt vùng gen chức cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá chủng vi rút đột biến ngẫu nhiên tái tổ hợp gen Ví dụ gen m có độ dài 522 bp nhóm LV 525 bp nhóm VR-2332 [9, 54] Ngồi ra, nhóm PRRSV có khác phân nhóm Ví dụ: Tổng độ dài hệ gen chủng vi rút nhóm VR-2332 phân lập Mỹ (số đăng ký: AY150564) 15451 bp, phần mã hố cho khung đọc mở 15071 bp Trong hệ gen vi rút PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho nhóm PRRS phân lập gần có độc lực cao Trung Quốc, thuộc nhóm VR-232 lại có độ dài 15353 bp, phần mã hố cho khung đọc mở 14981 bp [26, 28, 54] Về mặt độc lực, vi rút gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn PRRSV tồn dƣới dạng: dạng cổ điển có độc lực thấp, dạng lợn mắc bệnh có tỷ lệ chết thấp, từ - 5% tổng đàn dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm chết nhiều lợn [54] 1.2.3 Cơ chế phát sinh bệnh Đến chế gây bệnh PRRSV chƣa đƣợc hiểu rõ ràng Các nghiên cứu thấy vi rút PRRSV có lực đặc biệt với đại thực bào, đặc biệt đại thực bào phổi, gây tổn thƣơng đáp ứng miễn dịch tế bào, phá hủy bề mặt màng nhày [54, 60] Sau xâm nhập, vi rút chép bên đại thực bào phổi mô lympho để tạo nhiều vi rút mới, đồng thời phá vỡ tế bào đóng vai trò gây đáp ứng miễn dịch Các vi rút tồn lâu dài đại thực bào phổi đại thực bào amiđan Kháng nguyên PRRSV đƣợc phát đại Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm thực bào mô, tế bào khác bao gồm mơ [54, 60] Hình 1.3 cho thấy thay đổi hình thái đại thực bào trƣớc sau nhiễm PRRSV A B Hình 1.3: Hình thái đại thực bào bị nhiễm PRRSV A: đại thực bào bình thƣờng; B: đại thực bào bị phá hủy [54] Một 40% đại thực bào bị phá hủy, PRRSV hầu nhƣ loại bỏ hệ thống bảo vệ thể [54] Điều tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn vi rút khác gây bệnh Điển hình trƣờng hợp gia tăng nghiêm trọng viêm phổi Ngoài ra, lợn mắc bệnh PRRS thƣờng bị bội nhiễm với bệnh nhƣ dịch tả lợn, tụ huyết trùng, phó thƣơng hàn, bệnh xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh Steptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát nguyên nhân gây chết nhiều lợn mắc bệnh PRRS [7, 18, 54] 1.2.4 Đặc tính sinh miễn dịch Trong nghiên cứu phát triển vắcxin chống lại PRRSV đƣợc ghi nhận hai thập kỷ qua, việc thiết kế vắcxin tiểu đơn vị, việc tạo đáp ứng miễn dịch tế bào dịch thể đặc biệt quan tro ̣ng c ả hai chế liên quan đến việc bảo vệ chống lại vi rút Trong trình lây nhiễm, lợn thƣờng sản xuất kháng thể đặc hiệu protein N Mặc dù protein N protein cấu trúc phổ biến có tính kháng ngun cao , nhƣng mố i liên quan giƣ̃a kháng th ể kháng protein với đáp ứng miễn dịch bảo vệ lại khơng chă ̣t chẽ Vì protein N dùng để chuẩn đoán sƣ̣ có mă ̣t của PRRSV mà không dùng làmắcxin v tiểu đơn vị [15] Trong thành phần cấu tạo vi rút PRRS, phân tử protein cấu trúc có khả trung hoà kháng thể (bao gồm phân tử glycoprotein, phân tử protein Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm màng (M) protein vỏ nhân virut (N)) nhƣng hoạt động trung hoà xảy mạnh với protein GP5, M GP3 [18, 19, 23, 26, 54] Do vậy, protein thƣờng đƣơ ̣c dùng nhƣ mục tiêu hàng đầu để thiết kế vắcxin tiể u đơn vi ̣chố ng lại sƣ̣ xâm nhiễ m của PRRSV GP5 đƣơ ̣c biế t nhƣ yế u tố kích thích vi ệc sản sinh kháng thể trung hịa lợn vấn đề then chốt miễn dịch dịch thể [19, 23, 39] Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy GP5 luôn liêt kết với protein mạng lƣới M [32, 34, 55] Bên ca ̣nh đó , ngƣời ta cũng tim ̀ thấ y glycoprotein vỏ GP các mảnh vỡ nhƣ tế bào bị nhiễm vi rút , loại protein cũng kić h thić h sinh kháng thể trung hòa mức cao [54] 1.3 TÌNH HÌNH BỆNH LỢN TAI XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.3.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh giới Mặc dù năm 1980 có báo cáo bệnh song chƣa xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh Năm 1987 bệnh đƣợc ghi nhận Mỹ với triệu chứng lâm sàng sinh sản kết hợp với hô hấp Năm 1990 hội chứng tƣơng tự xuất châu Âu, Đức, Pháp Anh sau lan tràn khắp châu Âu [61, 62] Đến năm 1992, bệnh gây ổ dịch lớn nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu châu Á, gây tổn thất lớn kinh tế cho nghề chăn nuôi lợn giới [61, 62] Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc vùng lãnh thổ thuộc tất châu lục giới báo cáo cho Tổ chức Thú y giới khẳng định phát có bệnh lợn tai xanh lƣu hành [59, 62] Hiện nay, hội chứng trở thành dịch địa phƣơng nhiều nƣớc giới, kể nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức gây tổn thất lớn kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [59] Ở Mỹ, ngƣời ta đánh giá thiệt hại kinh tế (trực tiếp gián tiếp) bệnh lợn tai xanh năm gần lớn so với thiệt hại bệnh khác gây lợn Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu tổn tất bệnh gây khoảng 560 triệu USD việc tiêu huỷ lợn chết lợn ốm, chi phí chống dịch xử lý mơi Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 10 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm thiết kế thành công vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 Sẵn sàng cho việc chuyển gen vào tế bào thuốc siêu sinh trƣởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.3 KẾT QUẢ BIẾN NẠP CÁC GEN QUAN TÂM VÀO DÕNG TẾ BÀO THUỐC LÁ SIÊU SINH TRƢỞNG BY-2 THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens 3.3.1 Kết biến nạp vector chuyển gen thiết kế thành công vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 Để tiến hành thí nghiệm chuyển đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 vào tế bào thuốc BY-2 thông qua vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260, trƣớc tiên cần phải tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35Sltb-gp3 Do đó, chúng tơi tiến hành biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260 phƣơng pháp xung điện Kết biến nạp đƣợc kiểm tra phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen sử dụng khuôn plasmid tách từ khuẩn lạc mọc đĩa thạch Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết Hình 3.13 M Hình 3.13: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết biến nạp vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5m (giếng 6, 7), pCB-GW-35S-ltb-gp5 (giếng 3, 4, 5), pCB-GW35S-ltb-gp3 (giếng 1, 2) vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260 gel agarose 1% M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun) Kết điện di cho thấy ba trƣờng hợp sản phẩm PCR lên băng với kích thƣớc nhƣ tính tốn Chứng tỏ chúng tơi biến nạp thành công Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 67 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm vector pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens CV58 pGV2260 Các dòng A tumefaciens CV58 pGV2260-pCB-GW-35S-ltb-gp5m, A tumefaciens CV58 pGV2260-pCB-GW-35Sltb-gp5, A tumefaciens CV58 pGV2260-pCB-GW-35S-ltb-gp3 đƣợc sử dụng để chuyển gen ltb-gp5m, ltb-gp5m, ltb-gp3 vào tế bào thuốc siêu sinh trƣởng BY-2 3.3.2 Kết biến nạp gen quan tâm vào tế bào thuốc siêu sinh trƣởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tiến hành biến nạp với quy trình nhƣ mơ tả mục 2.2.2.12, thu đƣợc kết bƣớc đầu thể Hình 3.14 Tiếp theo, dòng phát triển tốt đĩa thạch đƣợc kiểm tra có mặt gen chuyển vào phƣơng pháp PCR khuôn ADN tổng số tách từ tế bào BY-2 với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hình 3.14: Kết bƣớc đầu chuyển gen quy định kháng nguyên PRRSV vào tế bào thuốc BY-2 A: tuần sau rửa khuẩn; B: Các dịng phát triển tốt mơi trƣờng có kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc mới; C: tuần sau chuyển sang môi trƣờng mới; D:3 tuần sau chuyển sang môi trƣờng 3.3.2.1 Kết sàng lọc dòng tế bào thuốc BY-2 mang gen cần chuyển phương pháp PCR a Kết tách ADN tổng số Các dòng phát triển tốt đĩa thạch có kháng sinh chọn lọc đƣợc đem tách ADN tổng số với quy trình nhƣ trình bày mục 2.2.2.13 Điện di sản phẩm tách chiết gel agarose 0.8% cho kết nhƣ Hình 3.15 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 68 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.15 Ảnh điện di minh họa kết tách ADN tổng số gel agarose 0.8% Kết điện di cho thấy ADN tổng số đạt chất lƣợng tốt, sử dụng làm khn cho phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen cần chuyển b Kết kiểm tra có mặt gen cần chuyển phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Dựa khn ADN tổng số tách từ dịng tế bào, tiến hành phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen cần chuyển Cặp mồi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết nhƣ sau: - Kết chuyển đoạn gen ltb-gp5m Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR cặp mồi đặc hiệu cho gen ltb-gp5m, cho sản phẩm PCR với kích thƣớc khoảng 1600 bp Kết điện di sản phẩm PCR (Hình 3.16) cho thấy chúng tơi thu đƣợc 27/40 dịng lên băng với kích thƣớc khoảng 1600 bp, kết luận dòng mang gen ltb-gp5m Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 69 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 1500 bp 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M 1500 bp Hình 3.16: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ltb-gp5m dịng tế bào BY-2 gel agarose 1% 1-40: Kí hiệu dòng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun) - Kết chuyển đoạn gen ltb-gp5 Theo tính tốn, sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ltb-gp5 mà chúng tơi sử dụng có kích thƣớc khoảng gần 1000 bp Ảnh điện di sản phẩm PCR (Hình 3.17) cho thấy dòng từ 1-11, 13-17 lên băng với kích thƣớc nhƣ tính tốn, chứng tỏ dòng tế bào đƣợc chuyển đoạn gen ltb-gp5 10 11 12 M - 13 14 15 16 17 M 1000 bp Hình 3.17: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt đoạn gen ltb-gp5 dịng BY-2 gel agarose 1% 1-17: Kí hiệu dòng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun); M: Thang chuẩn ADN Smart (Eurogentec) Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 70 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm - Kết chuyển đoạn gen ltb- gp3 Cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho gen cho sản phẩm PCR với kích thƣớc khoảng 1000 bp Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Hình 3.18) cho thấy dịng mà chúng tơi kiểm tra lên băng ADN với kích thƣớc tƣơng tự, chứng tỏ dòng mang đoạn gen ltb-gp3 M 1000 bp Hình 3.18: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ltb-gp3 dịng BY-2 gel agarose 1% 1-6: Kí hiệu dịng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Sciencetific) Qua sàng lọc PCR, chúng tơi thu đƣợc 27 dịng dƣơng tính trƣờng hợp chuyển đoạn gen ltb-gp5m, 23 dòng dƣơng tính trƣờng hợp chuyển đoạn gen ltb-gp5 dịng dƣơng tính trƣờng hợp chuyển đoạn gen ltb-gp3 vào tế bào thuốc siêu sinh trƣởng BY-2 3.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN CẦN CHUYỂN TRONG TẾ BÀO THUỐC LÁ SIÊU SINH TRƢỞNG BY-2 Luận văn đƣợc thực khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế KH&CN theo nghị định thƣ Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc đậu tương”, với mục tiêu biểu gen mã hóa cho kháng nguyên GP5 Vì quỹ thời gian dự án bị giới hạn nên trƣớc tiên tập trung tiến hành nghiên cứu biểu gen ltb-gp5 dòng tế bào BY-2 chuyển gen 3.4.1 Kết kiểm tra biểu gen ltb-gp5 mức độ phiên mã Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 71 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 23 dòng BY-2 mang đoạn gen ltb-gp5 sau sàng lọc PCR đƣợc tiến hành tách ARN tổng số với bƣớc nhƣ trình bày mục 2.2.2.14 Sau có mặt ARN thơng tin phiên mã từ gen hỗn hợp ARN tổng số đƣợc kiểm tra RT-PCR Kết kiểm tra đƣợc minh họa Hình 3.19 + - 1 1 2 2 M 1000 bp Hình 3.19: Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra biểu gen ltb-gp5 mức độ phiên mã gel agarose 1% 1-24: Kí hiệu dịng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun) Ảnh điện di cho thấy thu đƣợc 7/23 dòng cho kết RT-PCR dƣơng tính Mặt khác, để kiểm tra độ tinh ARN sau tách chiết tiến hành phản ứng RT (-) sử dụng ARN tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Kết thu đƣợc tất 23 mẫu sản phẩm RT(-) không lên băng điện di kiểm tra, chứng tỏ ARN tổng số tách không bị nhiễm ADN hệ gen Từ kết khẳng định dòng tế bào gen ltb-gp5 đƣợc phiên mã tạo ARN thông tin 3.4.2 Kết kiểm tra biểu gen ltb-gp5 mức độ dịch mã 3.4.2.1 Kết điện di kiểm tra protein tổng số gel polyacrylamide 12.6% dòng dƣơng tính từ phản ứng RT-PCR phía đƣợc tiếp tục kiểm tra biểu gen mức độ dịch mã Chúng tiến hành tách protein tổng số từ dịng tế bào sau điện di kiểm tra protein tổng số gel polyacrylamide 12.6% Kết điện di đƣợc minh họa Hình 3.20 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 72 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm WT M 116.0 kDa 66.2 kDa 45.0 kDa 35.0 kDa 25.0 kDa 18.4 kDa 14.4 kDa Hình 3.20: Ảnh điện di protein tổng số gel polyacrylamide 12.6% WT: chủng dại (khơng đƣợc chuyển gen); 1-7: Kí hiệu dòng tế bào BY-2; M: Thang chuẩn protein (Thermo Sciencetific) Sử dụng phần mềm BioEdit chúng tơi tính toán đƣợc đoạn gen ltb-gp5 sau dịch mã tạo protein có kích thƣớc khoảng 34 kDa Qua ảnh điện di dễ dàng quan sát thấy số dòng BY-2 chuyển gen (1, 5, 6) xuất băng protein kích thƣớc khoảng gần 35 kDa đậm hẳn so với băng tƣơng ứng dịng BY-2 khơng đƣợc chuyển gen Mặt khác, kích thƣớc lại tƣơng đƣơng với kích thƣớc theo tính toán lý thuyết kháng nguyên LTB-GP5 Từ kết này, chúng tơi suy đốn khác kháng nguyên LTB-GP5 đƣợc dịch mã từ ARN thông tin tế bào BY-2 chuyển gen Tuy nhiên, để khẳng định xác nhận định này, tiến hành phản ứng lai miễn dịch Western Blot 3.4.2.2 Kết kiểm tra biểu gen mức độ dịch mã phản ứng lai miễn dịch Western Blot Từ kết điện di kiểm tra protein tổng số gel polyacrylamide 12.6%, tiến hành phản ứng lai miễn dịch Western Blot cho dòng 1, 5, Phản ứng lai Western Blot dựa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Cmyc Kết phản ứng lai đƣợc minh họa Hình 3.21 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 73 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hình 3.21: Kết phản ứng lai miễn dịch Western Blot WT: dịng BY-2 khơng đƣợc chuyển gen; 1, 5, 6: Kí hiệu dịng BY-2 chuyển gen; M: Thang chuẩn protein (Thermo sciencetific) Kết lai cho thấy dịng mà chúng tơi kiểm tra lên băng với kích thƣớc khoảng 34 kDal băng khơng xuất dòng WT Chứng tỏ dòng này, protein LTB-GP5 đƣợc biểu Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 74 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ Từ kết thu đƣợc, đƣa mô ̣t số kế t luâ ̣n sau: Thiết kế thành công đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 Thiết kế thành công vector chuyển gen thực vật pCB-GW-35S-ltbgp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 Tạo đƣợc chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen Biến nạp thành công gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 vào tế bào thuốc siêu sinh trƣởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Qua kiểm tra thu đƣợc dòng BY-2 mang gen ltb-gp5 biểu sản phẩm protein Dƣ̣a nhƣ̃ng kế t quả , xin đƣa số kiến nghị cho hƣớng nghiên cƣ́u tiế p theo nhƣ sau: Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch kháng nguyên GP5 biểu tế bào thuốc BY-2 chuột lợn Tiế p tu ̣c kiể m tra biểu gen ltb-gp5m, ltb-gp3 dòng tế bào BY-2 chuyển gen Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 75 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2007), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2007 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2008), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2008, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2008 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2009), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2009 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2010), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2010, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2010 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2011), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2011, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2012), Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2012, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2012 Bùi Mỹ Duyên (2012), Thiết kế vector biểu số kháng nguyên virus lợn tai xanh (PRRSV) tế bào thuốc lá, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học Mở Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ , Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang An (2008), “Mô ̣t số đă ̣c điể m dich ̣ tễ Hô ̣i chƣ́ng sinh sản và hô hấ p (PRRS) lợn từ cuố i tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nƣớc” , Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (5), tr 14-20 Lê Thanh Hịa, Lê Thị Kim Xuyến, Đồn Thị Thanh Hƣơng,Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bá Hiến (2009), “Phân tích gen M mã hố protein màng virus gây bệnh lợn tai xanh”, Tạp chí Khoa học Phát triển, (7), tr 282 – 290 10 Nguyễn Thị Thanh Huyền, Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào tế bào thuốc BY-2 nhằm biểu protein HA vius H5N1, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Đại học Mở Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 76 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 11 Võ Thị Thƣơng Lan (2004), Sinh học phân tử , Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Cơng nghệ gen nơng nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm, Đại học Huế 13 Lê Quỳnh Liên , Phan Tro ̣ng Hoàng , Đỗ Xuân Đồng , Chu Hoàng Hà , Lê Trầ n Bình (2008), “Biểu kháng nguyên glycoprotein virus dại thuốc chuyển gen”, Tạp chí CNSH, (6), tr 445-452 14 Đinh Đoàn Long , Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyề n học phân tử và tế bào , Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 15 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất Giáo dục Việt nam 16 Trịnh Thị Trang Nhung (2010), Biểu tinh peptide kháng khuẩn Cecropin, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 17 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), “Công nghệ gen thực vật”, Hội nghị Khoa học công nghệ 2007,5, tr 345-411 18 Nguyễn Tƣờng Vân (2011), “Nghiên cứu biểu gen mã hóa protein vỏ Glycoprotein (GP5) virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc đậu tƣơng”, Thuyết minh nhiệm vụ hợp tác quốc tế KH&CN theo Nghị định thƣ, tr 1-25 Tài liệu tiếng Anh 19 Ansari, I.H., Kwon, B., Osorio, F.A., Pattnaik, A.K (2006), “Influence of Nlinked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies”, J Virol, (80), pp 3994–4004 20 Arakawa T, “Expression of Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997), cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants”, Transgenic Research, (6), pp 403-413 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 77 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 21 Arntzen C, Plotkin S, Dodet B (2008), “Plant-derived vaccines and antibodies: potential and limitations”, Vaccine, (23), pp 1753–1756 22 Aziz MA, Singh S, Kumar PA and Bhatnagar R (2002), “Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax”, Biochemical and Biophysical Research Communications, (299), pp 345-351 23 Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin CM, Pang VF, Jeng CR (2010), “Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant”, Vet Immunol Immunopathol, 135, pp 234-242 24 Dalsgaard K, Uttenthal A Jones TD, Xu F Merryweather A, Hamilton WDO, Langcveld JPM, Boshuizen RS, Karnstrup S Lomonossoff GP, Porta C, Vela C, Casa] JI, Meloen RH, Rodgers PB (1997), “Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease”, Nat Biotechnol, 15, pp 248-252 25 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001), “Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants”, Trends Plant Sci, 6, pp 219-226 26 Diaz I, Darwich L, Pappaterra G, Pujols J, Mateu E (2006), “Different European-type vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus have different immunological properties and confer different protection to pigs”, Virology, 351, pp 249–259 27 Dus Santos MI, Wigdorovitz A, Trono K, Rios RD, Franzone PM, Gil F, Moreno J, Carrillo C, Escnihano IM, Borca MV (2002), “A novel methodology to develop a toot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants”, Vaccine, 20, pp 1141-1147 28 Feng Y, Zhao T, Tung Nguyen, Inui K, Ma Y, Nguyen Thi Hoa, Nguyen Van Cam , Liu D , Bui Quang Anh, To Long Thanh , Wang C, Tian K, and Gao GF (2008), “Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China in 2007”, Emerging Infectious Diseases, 14, pp 1774-1776 Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 78 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 29 Hou YH, Chen J, Tong GZ, Tian ZJ, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng JM, An TQ, Yang HC (2008), “A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and the GP5 encoding-gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces protective immunity in piglets”, Vaccine, 26, pp 1438–1449 30 Invitrogen (2010), Gateway® Technology, Version E, Catalog nos 12535-019 and 12535-027 31 Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK (2002), “Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants”, Transgenic Res, 1, pp 447-454 32 Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S (2006a), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice”, Vet Immunol, 113, pp 169–180 33 Jiang W, Jiang P, Wang X, Li Y, Wang X, Du Y (2007), “Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein N-linked glycans on immune responses in mice”, Virus Genes, 35, pp 663–671 34 Jiang Y, Xiao S, Fang L, Yu X, Song Y, Niu C, Chen H (2006b), “DNA vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity”, Vaccine, 24, pp 2869–2879 35 Kim TG, Gruber A and Langridge WHR (2004), “HIV-1 gp 120 V3 cholera toxin B subunit fusion gene expression in transgenic potato”, Protein Expression and Purification, 37, pp 196-202 36 Lamphear BJ, Jilka JM, Kest L, Welter M, Howard JA, Streatfield Si (2004), “A corn-based delivery system or animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine”, Virology, 22, pp 2420-2424 37 Lauterslager TGM, Florack DEA, Wal TJV, Molthoff JW, Langeveld JPM, Bosch D, Boersma WJA and Hilgers LAT (2001), “Oral immunisation of Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 79 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LTB”, Vaccine, 19, pp 2749-2755 38 Mason HS, Warzecha H, Mor T and Arntzen CJ (2002), “Edible plant vaccines: application for prophylactic and therapeutic molecular medicine”, Trends in Molecular Medicine, 8, pp 324-329 39 Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002), “Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain”, J Virol, 76, pp 4241–4250 40 Palmer K E, Schnippenkoetter WH, Rybicki EP (1998), “Geminivirus isolation and DNA extraction” In Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance, pp 41-52 Edited by G Foster & S Taylor Totowa, NJ:Humana Press 41 Perlak FJ, Fuchs RL, Dean DA, McPherson SL and Fishhoff DA (1991), “Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes”, Proc Natl Acad Sci USA, 88, pp 3324-3328 42 Plagemann PG (2004), “GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus”, Virus Res, 102, pp 225–230 43 Rebay Lab (2013), Transformation of Bacteria via Electroporation Protocol 44 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 1, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 45 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 46 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 47 Streatfield SJ and JA Howard (2003), “Plant-based vaccines”, Int J Parasitol, 33, pp 479-493 48 Thermo sciencetific (2006), CloneJETTM PCR Cloning Kit procedure Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 80 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm 49 Thermo sciencetific (2008-2009), Molecular Biology Catalog and Product Application guide 50 Thermo Scientific (2006), GeneJET Gel Extraction Kit Procedure 51 Thermo Scientific (2006), GeneJETTM PCR Purification Kit Procedure 52 Thermo Scientific (2006), GeneJET™ RNA Purification Kit Procedure 53 Thermo Scientific (2006), RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Procedure 54 Wasin Charerntantanakul (2012), “Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects”, Virology, 1(1): 23-30 55 Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007), “Co-expressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)”, Virus Genes, 35, pp 585–595 Trang web 56 http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/molStudents/spring2003/McCord /electroporation.htm 57 www.bio.utk.edu/cellbiol/prot/by2-medium.pdf 58 http://www.protocolonline.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DNA_Extraction_Purification/DNA_ Extraction_from_Plants/ 59 http://www.prrs.org/Elimination/93/RegionalElimination.aspx#.Ui2T639EnqE 60 http://www.prrssymposium.org/default.aspx 61 http://www.respig.com/diseases/prrs.asp 62 http://www.thepigsite.com/diseaseinfo/97/porcine-reproductive-respiratorysyndrome-prrs Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 81 ... trên, để thực đề tài ? ?Thiết kế vector chuyển gen biểu kháng nguyên vi rút PRRS tế bào thực vật? ??, tiến hành chuyển gen mã hóa cho kháng nguyên GP5M, GP5, GP3 vi rút PRRS vào tế bào thuốc siêu sinh... xuất vắcxin thực vật đƣợc hình thành nhƣ dùng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, thực vật chuyển gen tạm thời, thực vật nhiễm vi rút nuôi cấy tế bào thực vật? ?? [18] Trong trình... hình thiết kế cấu trúc đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 Bƣớc 2: Thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật sử dụng kỹ thuật GateWay - Vi? ??c thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật