Extraction ecdysteroid compounds from taxus wallichiana and research potential moult of crab (scylla paramamosain

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN VĂN TRÍ CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT ECDYSTEROID TỪ THƠNG ĐỎ VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY LỘT XÁC TRÊN CUA (SCYLLA PARAMAMOSAIN) (Extraction Ecdysteroid compounds from Taxus wallichiana and research potential moult of crab (Scylla Paramamosain)) Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số: 60.52.03.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020 Cơng trình hoàn thành tại: Trung Tâm Sâm Dược Liệu Tp HCM Cán hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phạm Thành Quân Cán hướng dẫn khoa học 2: Cán chấm nhận xét : PGS TS Bạch Long Giang Cán chấm nhận xét : TS Phan Thị Hoàng Anh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 01 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Chủ tịch Hội đồng: PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong Cán phản biện 1: PGS TS Bạch Long Giang Cán phản biện 2: TS Phan Thị Hoàng Anh Ủy viên: TS Nguyễn Thanh Tùng Thư ký: TS Lê Vũ Hà Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Văn Trí MSHV: 1670679 Ngày, tháng, năm sinh: 18/03/1992 Nơi sinh: Đăk Lăk Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số: 60.52.03.01 TÊN ĐỀ TÀI: Chiết tách hợp chất ecdysteroid từ thông đỏ nghiên cứu khả gây lột xác cua (Scylla paramamosain) I NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Chiết tách, tinh β-ecdysone từ cao thơng đỏ - Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu ecdysteroid chiết 500 gam cao ecdysteroid bán thành phẩm quy mơ pilot Từ làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn viên cho cua - Nghiên cứu phối trộn chế phẩm thức ăn viên chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua - Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm cao trung gian chế phẩm thức ăn cua - Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/06/2019 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/12/2020 IV.CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1: PGS TS Phạm Thành Quân CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2: Tp HCM, ngày 25 tháng 12 năm 2019 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin cảm ơn ba mẹ anh, chị bên tạo điều kiện tốt để đạt thành ngày hôm Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Phạm Thành Quân, người thầy ln tận tình hướng dẫn em thực đề tài Xin cảm ơn GS TS Phan Thanh Sơn Nam, PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan thầy giảng viên cao học K2016 Khoa Kỹ Thuật Hóa Học trường Đại học Bách Khoa Tp HCM dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho em suốt khóa học Cảm ơn TS Bùi Thế Vinh, ThS Lâm Bích Thảo, KS Nguyễn Nhật Minh Thầy Cô, Anh Chị em, bạn bè Trung tâm sâm dược liệu Tp HCM, mơn Hóa Hữu Cơ, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Tp HCM giúp đỡ thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Nguyễn Văn Trí ii TĨM TẮT LUẬN VĂN Phân lập thành công hợp chất β-ecdysone từ cao thơng đỏ Lựa chọn quy trình chiết tách ecdysteroid lắc phân bố với ethyl acetate cho hiệu suất (0,138%) cao so với chạy qua cột Diaion HP-20 (0,073%) Đã phối trộn thức ăn cho cua dạng cốm, có diện ecdysteroid Xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao thông đỏ chế phẩm thức ăn cua chứa ecdysteroid Độ ẩm cao không 20%, độ ẩm thức ăn cua không 12%, nồng độ β-ecdysone cao không thấp 0,138% Kết ni thí nghiệm ban đầu cho thấy nuôi với thức ăn viên nhân tạo 45% đạm bổ sung 10 ppm ecdysone có khả kích thích cua lột xác, thời gian lột xác cua diễn sớm hơn, tập trung đồng loạt vào khoảng 20 ngày ABSTRACT β-ecdysone compound was successfully isolated from Taxus wallichiana Liquid-liquid extraction with ethyl acetate was selected as the extraction process of ecdysteroid, which had higher efficiency (0.138%) than through the Diaion HP-20 column (0.073%) Food for nuggets of crabs has been mixed and has the presence of ecdysteroid The standard for Taxus wallichiana extract and crabs’ food containing ecdysteroid has been formulated The moisture of the extract and crabs’ food not exceed 20% and 12%, respectively, and the concentration of β-ecdysone in the extract is not lower than 0.138% Preliminary experimental results showed that when crabs were fed with artificial pellets 45% protein supplemented with 10 ppm ecdysone has the ability to stimulate crab molting, crab molting time takes place earlier, focused and simultaneously at 20th day iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác Học viên Nguyễn Văn Trí iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i ABSTRACT ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung thông đỏ dài (Taxus wallichiana) 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Sinh thái 1.1.5 Công dụng 1.1.6 Độc tính 1.2 Giới thiệu ecdysteroid 1.2.1 Giới thiệu chung β-ecdysone 1.2.2 Công thức cấu tạo danh pháp 1.2.3 Tính chất vật lý 1.2.4 Ứng dụng β-ecdysone 1.3 Giới thiệu sinh lý lột xác cua 1.3.1 Sinh lý lột xác cua 1.3.2 Đặc điểm trình lột xác cua 11 1.4 Phương pháp cô lập hợp chất hữu 12 1.4.1 Sắc ký phân bố - sắc ký cột 12 1.4.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 13 v Chƣơng 2: Thực Nghiệm 14 2.1 Nội dung nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu, hóa chất sử dụng 14 2.2.1 Vật liệu 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.2.3 Thiết bị 15 2.3 Quy trình thực 15 2.3.1 Chiết tách, tinh β-ecdysone từ cao methanol 15 2.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid chiết 500g cao ecdysteroid bán thành phẩm quy mô pilot 18 2.3.3 Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 21 2.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm cao trung gian chế phẩm phối trộn 23 2.3.5 Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua mơ hình thí nghiệm 23 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Chiết tách, tinh β-ecdysone từ cao tổng 26 3.1.1 Chạy cột sắc ký phân bố 26 3.1.2 Sắc ký hấp phụ cột silica gel 27 3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid chiết 500 g cao ecdysteroid bán thành phẩm quy mô pilot 30 3.2.1 Kết chạy cột Diaion HP-20 30 3.2.2 Lắc phân bố với ethyl acetate 31 3.2.3 Định lượng β-ecdysone phương pháp HPLC 32 3.3 Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa Ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 40 3.3.1 Phối trộn cao chứa ecdysteroid vào thành phần thức ăn cho cua 40 3.3.2 Đánh giá tính chất hóa lý viên thức ăn thành phẩm 40 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm cao bán thành phẩm viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid 41 vi 3.4.1 Độ ẩm cao bán thành phẩm chế phẩm phối trộn 41 3.4.2 Định tính ecdysteroid SKLM cao bán thành phẩm viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid 43 3.5 Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua mơ hình thí nghiệm 47 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 60 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây thơng đỏ Hình 1.2 Một số cơng thức ecdysteroids [30] Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo β-ecdysone [30] Hình 2.1 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố cột A 16 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sắc ký hấp phụ cột B 17 Hình 2.3 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố 18 Hình 2.4 Quy trình lắc phân đoạn với ethyl acetate 19 Hình 3.1 SKLM phân đoạn cột A Hệ dung môi DCM - MeOH (80 : 20) 26 Hình 3.2 SKLM phân đoạn cột B1 Hệ dung môi DCM - MeOH (85:15) 28 Hình 3.3 SKLC phân đoạn cột B2 Hệ dung môi DCM – MeOH (85:15) 29 Hình 3.4 Kết tinh phân đoạn V 29 Hình 3.5 SKLM đối chứng kết tinh chuẩn β-ecdysone 30 Hình 3.6 Kết SKLM lắc phân bố với ethyl acetate 31 Hình 3.7 Kết thẩm định độ đặc hiệu quy trình phân tích 32 Hình 3.8 Đường chuẩn sắc ký đồ β-ecdysone chuẩn 33 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu cao ethyl acetate 35 Hình 3.10 Sắc ký phân đoạn 40% ethanol 37 Hình 3.11 (1)Thiết bị chiết (2) thiết bị lắc phân đoạn 39 Hình 3.12 Mẫu cao sau phối trộn thức ăn xát hạt (trước sấy) 41 Hình 3.13 Kết định tính ecdysteroid thức ăn cua cao thơng đỏ 43 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu cao bán thành phẩm 44 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cua 45 Hình 3.16 Thức ăn chế biến dùng cho ni thí nghiệm 48 Hình 3.17 Bố trí cua bể ni thí nghiệm 48 Hình 3.18 Sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ cua nuôi 50 Hình 3.19 Tỷ lệ lột vỏ cua nghiệm thức theo thời gian nuôi 52 60 PHỤ LỤC Phụ lục A Phân tích phổ NMR hợp chất phân đoạn V Chất phân đoạn V thu dạng tinh thể màu trắng, tan dung môi MeOH Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi DCM - MeOH (85:15) thu giá trị Rf = 0,35, màu dung dịch acid sulfuric 10% cồn cho vết màu xám đen, vết phát quang tia UV 366 nm Dựa vào phổ 1H-NMR pđ V ta thấy mũi cộng hưởng tương ứng với diện năm nhóm –CH3 liên kết với carbon tứ cấp vùng trường cao 1.63 ppm (CH3 – 21, s); 1.40 ppm (CH3 – 26 CH3 – 27, s,); 1.24 ppm (CH3 – 18, s,) 1.09 ppm (CH3 – 19, s) Ba proton ba carbon liên kết với oxy có tín hiệu 4.26 ppm (H-3, s); 4.27ppm (H-2, m,) 3.91ppm (H-22, d, J=10) Ở vùng trường thấp cho thấy tín hiệu proton olefin cộng hưởng 6.28 ppm (H-7, s) Ngoài ra: 3.03 ppm (H – H – 17, m); 61 Phổ 1H- NMR 62 Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HMQC cho thấy hợp chất V có tất 27 carbon, có năm nhóm –CH3, tám nhóm –CH2, bảy nhóm –CH bảy carbon tứ cấp Ở vùng trường thấp thấy diện carbon nhóm carbonyl cộng hưởng 203.9 ppm (C-6), hai carbon olefin 166.5 ppm (C-8) 122.2 ppm (C-7) Tín hiệu sáu carbon liên kết trực tiếp với oxy xuất 84.7 ppm (C-14), 78.1 ppm (C-22), 77.4 ppm (C-20), 70.1 ppm (C-25), 68.6 ppm (C-2), 68.6 ppm (C-3) Phổ 13C- NMR 63 Số liệu phổ 1H-NMR (500MHz) 13C-NMR (125MHz) hợp chất PĐ V C5D5N Carbon V δH (ppm) 1.90 (1H, m) 2.17 (1H, m) δC (ppm) 38.4 4.27 (1H, m) 68.6 4.26 (1H, s) 68.6 1.82 (1H, m) 2.05 (1H, m) 3.03 (1H, m) 6.28 (1H, s) 122.1 166.7 3.60 (1H, m) 10 11 51.9 204.2 32.9 34.9 39.1 1.76 (1H, m) 1.91 (1H, m) 21.6 2.60 (1H, dt, J1=13, 12 J2=5) 32.5 1.96 (1H, m) 13 48.6 14 84.7 15 16 2.16 (1H, m) 1.90 (1H, m) 2.47 (1H, m) 2.05 (1H, m) 32.2 21.9 64 17 3.03 (1H, m) 50.6 18 1.23(3H, s) 18.4 19 1.09(3H, s) 24.9 20 77.4 21 1.63 (3H, s) 22.1 22 3.91 (1H, d, J=10) 78.1 23 24 1.87 (1H, m) 2.17 (1H, m) 2.31 (1H, m) 1.83 (1H, m) 25 27.9 43.1 70.1 26 1.40 (3H, s) 30.5 27 1.40 (3H, s) 30.6 65 Tương quan phổ 1H-1H COSY hợp chất V phù hợp với cấu trúc βecdysone: OH OH 22 21 24 25 18 12 19 HO 11 20 16 13 23 17 14 27 OH 26 15 10 HO OH O Tương quan 1H-1H COSY Phổ 1H – 1H COSY Phổ 1H – 1H COSYcủa ecdysone phân đoạn V 66 Phổ HMBC cho thấy tương tác proton olefin với C-5, C-9 C-14 nên proton olefin nằm C-7 Do có tương quan H-19 C-1, C-5, C-10 nên nhóm CH3-19 gắn vị trí C-10 Proton C-18 tương quan với C-12, C-13, C-14 C-17 chứng tỏ nhóm CH3-18 gắn với C-13 Tương quan H-21 với C-17, C-20, C-22 cho thấy nhóm CH3-21 liên kết với C-20 Các proton C-26 C-27 cho tương quan với C-24 C-25, hai nhóm CH3-26 CH3-27 gắn C-25 Phổ HMQC ecdysone phân đoạn V Mối tương quan proton cacbon thể qua hình đây: 67 H 21 OH OH 22 25 H 18 12 H HO 19 11 20 23 27 OH 17 16 13 H 24 14 H 26 15 10 HO OH H O Tương quan HMBC hợp chất pđ V Tương quan phổ HMBC Carbon δH (ppm) 1.90 (1H, m) 2.17 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4.26 (1H, s) 1.82 (1H, m) 2.05 (1H, m) J C-2, C-3, C-5, C-9, C-10, C-19 C-1, C-10 C-2, C-3, C-10 3.03 (1H, m) C-4, C-6, C-7, C-10, C-19 6.28 (1H, s) C-5, C-6, C-9, C-14 3.60 (1H, m) C-1, C-7, C-8, C-10, C-11 10 11 12 1.76 (1H, m) 1.91 (1H, m) 2.60 (1H, dt, J1=13, J2=5) 1.96 (1H, m) C-9, C-10 C-9, C-11, C-13, C-14, C-18 68 13 14 15 16 2.16 (1H, m) 1.90 (1H, m) 2.47 (1H, m) 2.05 (1H, m) C-8, C-14, C-16, C-17 C-13, C-14, C-15, C-17, C-20 C-13, C-15, C-16, C-18, C-20, C-21, 17 3.03 (1H, m) 18 1.23(3H, s) C-12, C-13, C-14, C-17 19 1.09(3H, s) C-1, C-5, C-10 21 1.63 (3H, s) C-17, C-20, C-22 22 3.91 (1H, d, J=10) C-20, C-21, C-24 C-22 20 23 24 1.87 (1H, m) 2.17 (1H, m) 2.31 (1H, m) 1.83 (1H, m) C-24, C-25 C-23, C-26, C-27 25 26 1.40 (3H, s) C-24, C-25 27 1.40 (3H, s) C-24, C-25 69 Phổ HMBC Phổ HMBC ecdysone phân đoạn V Những liệu cho thấy hợp chất PĐ V steroid khung cholestan có tất 27 carbon, có năm nhóm –CH3, tám nhóm –CH2, bảy nhóm –CH, bảy carbon tứ cấp, nối đôi C7, sáu nhóm –OH nhóm –C=O Kết hợp so sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo β-ecdysone thấy có trùng khớp chất V chình β-ecdysone 70 So sánh hợp chất V β-ecdysone Carbon Hợp chất V(δC (ppm)) β-ecdysone(δC (ppm)) 38.4 37.98 68.6 68.13 68.6 68.04 32.9 32.45 51.9 51.4 204.2 203.49 122.1 121.64 166.7 166.11 34.9 34.39 10 39.1 38.65 11 21.6 21.47 12 32.5 31.98 13 48.6 48.05 14 84.7 84.15 15 32.2 31.77 16 21.9 21.09 17 50.6 50.08 18 18.4 17.88 19 24.9 24.46 20 77.4 76.82 21 22.1 21.69 22 78.1 77.53 23 27.9 27.47 24 43.1 42.65 71 25 70.1 69.51 26 30.5 29.99 27 30.6 30.12 72 Phụ Lục B Tiêu chuẩn sở Tiêu chuẩn sở cho cao nguyên liệu thông đỏ STT Chỉ tiêu Phƣơng pháp thực TCCS Độ ẩm DĐVN V phụ lục 9.6