The extraction and separation technology of keratin and collagen and research of the functional polypeptide in eggshell membrane

四川食品与发酵 Ｓｉｃｈｕａｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ 第 ４４ 卷（ 第 ４ 期） Ｖｏｌ．４４ ， Ｎｏ．４ 对蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的提取分离技术 及功能多肽的概述 周艳华， 马美湖， 蔡朝霞， 李涛 （华中农业大学食品科技学院， 武汉 ４３００７０） 摘 要： 中国是世界第一禽蛋生产和消费大国。随着人们对鸡蛋消费量的增加以及鸡蛋的集中加工使得大量蛋壳堆 积与丢弃， 这不仅对环境造成了严重的污染， 也是资源上的极度浪费， 对蛋壳的资源化利用具有极其重要的意义。国 内外对蛋壳的资源化利用甚多， 而对蛋壳膜的利用则相对较少。事实上， 蛋壳膜是蛋白和多肽等的潜在资源， 具有十 分可观的应用价值。为此本文概述了蛋壳膜这一具有高附加值的生物膜 ， 并对其内在的角蛋白与胶原蛋白及其生物 活性肽进行了相应的介绍 ， 着重强调了其提取分离的方法。旨在为开发利用鸡蛋壳膜这一丰富的资源提供科学的理 论依据。 关键词： 蛋壳膜； 角蛋白； 胶原蛋白； 提取 ； 功能多肽 中图分类号： ＴＳ２５３．４ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７１－ ６８９２ （ ２００８ ） ０４－ ００４８－ ０００７ Ｔｈｅ Ｅｘｔｒ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｋｅｒ ａｔｉｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ Ｅｇｇｓｈｅｌｌ Ｍｅｍｂｒ ａｎｅ ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ ｈｕａ， ＭＡ Ｍｅｉ－ ｈｕ， Ｃａｉ Ｚｈａｏ－ ｘｉａ ， ＬＩ Ｔａｏ （ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｃｈｉｎａ ｉｓ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｅｇｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ． Ａｓ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｇｇｓ， ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｉｓｃａｒｄｅｄ ｅｇｇｓｈｅｌｌｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃａｕｓｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ， ｂｕｔ ａｌｓｏ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｗａｓｔｅ ｏｆ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ． Ｉｔ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｅ ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｇｇｓｈｅｌｌｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｔ ｈｏｍｅ ａｎｄ ａｂｒｏａｄ， ｂｕｔ ｈｏｗ ｔｏ ｕｓｅ ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｌａｃｋ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｉｎ ｆａｃｔ， ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ａ ｖｅｒｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ． Ｔｈｅ ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｄｄｅｄ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｏｖｅｒｖｉｅｗｅｄ． Ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎ， ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ， ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍ－ ｂｒａｎｅ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ， ｗｈｉｃｈ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ： Ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ； Ｋｅｒａｔｉｎ； Ｃｏｌｌａｇｅｎ； Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ０ 引言 我国是世界上养禽最多的国家。２００７ 年我国禽 蛋产量达 ３１００ 万 吨 左 右 ， 占 世 界 的 ４３．９％ ， 居 世 界 质。含有丰富的钙、角蛋白、胶原蛋白、粘多糖、溶菌 酶等重要的成分， 又基于蛋壳资源数量巨大， 故对其 进行深加工就显得特别地必要［１］。 的第一位。随着禽蛋生产与消费的日益增加， 其不可 在各类动物性食品的废弃物中， 其中骨、皮、血 食用部分蛋壳也随之大量产生， 这不仅对环境造成 的资源化程度较高， 市场上有多种骨钙补剂、氨基 了严重的污染， 也是资源上的极度浪费。废弃的蛋 酸、胶原蛋白功能制剂等， 但尚未见到蛋壳钙剂、蛋 壳， 实际上包含蛋壳与蛋壳内膜两种可以利用的物 壳蛋白、蛋壳胶原等商品。蛋壳的开发利用明显滞 收稿日期： ２００８－ ０７－ ０４ 作者简介： 周艳华（ １９８３－ ） ， 女， 湖南郴州人， 硕士研究生， 畜产食品科学与生物技术。 基金项目： 国家“ 十一五” 支撑课题“ 液态蛋与专用蛋粉开发与产业化示范” 项目（ 项目编号 ２００６ＢＡＤ０５Ａ１７） 及国家“ ９４８ 项目”（ 项目编 号 ２００６－ Ｇ３６） 第 ４４ 卷（ 总第 １４５ 期） 周艳华等： 对蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的提取分离技术及功能多肽的概述 ４９ 由表 １ 可见氨基酸 组 成 中 脯 氨 酸 （Ｐｒｏ）、胱 氨 酸 后， 这与长期以来蛋壳来源十分分散及科研投入不 足有直接的关系 。现代蛋制品加工业的发展将在很 （Ｃｙｓ）居多， 同时含有弹性蛋白特有的锁链素和胶原 大程度上改变蛋壳来源分散、不易收集、污染严重的 蛋白特有的羟脯氨酸（Ｈｙｐ）、羟赖氨酸（Ｈｙｌｙ）。 ［２］ 现状。因此， 对蛋壳的研究与开发具有极其重要的理 另外， 弋峰等对蛋壳膜进行了电镜扫描， 其中图 论与实践意义。本文主要阐述了蛋壳膜的开发利用 １ 为鸡蛋壳内外膜扫描电镜照片。鸡蛋壳膜外表面 问题， 旨在为今后的科研工作提供相应的理论依据。 呈现出相互交织的纤维网状结构， 纤维直径为微米 １ 级 （图 ２ｂ）， 而内表面则表现得较外表面致密， 呈现出 蛋壳膜的组成、结构和性能 鸡蛋的组成分为鸡蛋壳、蛋白、蛋黄及胚盘或胚 凹凸形貌〔图 ２ａ）［７］。 珠四部分， 其构造如图 １ 所示。蛋壳由外向内分为硬 蛋壳、胶质膜、蛋膜和气室。蛋膜是位于蛋壳与蛋清 之间的纤维状薄膜， 大约厚 ７０ｕｍ， 约占鸡蛋湿重的 １．０２％， 干重的 ０．２４％ ， 由外蛋壳膜和内蛋壳膜构成， 为双层结构。在蛋未产出以前是没有气室的， 当产出 后遇冷， 内容物收缩， 外蛋壳膜和内蛋壳膜之间分 离， 于是在蛋的钝端就形成了气室。鸡蛋内蛋壳膜 附着一层白色半透明而富于营养的粘性半流动体物 图２ 质， 由浓厚蛋白及水样蛋白组成［３］。 鸡蛋壳膜电子显微镜照片， （ ａ ） 鸡蛋壳膜内膜表面； （ ｂ ） 鸡蛋壳膜外膜表面 ２ ２．１ 蛋壳膜中角蛋白的提取 角蛋白的形态结构及其化学性质 角蛋白是蛋白质的一种， 属于纤维性的、非营养 型的硬蛋白。它广泛存在于人和动物毛发、皮肤、及 指、趾甲等结构中， 是结缔组织极重要的结构蛋白 质， 起着保护机体的作用。Ｘ 射线衍射研究表明角蛋 白在自然状态下有两种结构， 分别为 α螺旋和 β折 图１ 叠 （见图 ３）。 鸡蛋的构造 蛋膜的主要成分是蛋白质， 以糖蛋白的形式存 在， 类似于细胞膜蛋白质的构成 ［４］ 。蛋膜中含有约 ９０％的蛋白质、３％的脂质体和 ２％的糖类。其中的蛋 白质有角蛋白、胶原蛋白 （大部分为 Ⅰ 、Ⅴ 、Ⅹ 型 ）、复 合蛋白等， 如 ＯＣ１７（ｏｖａｌｂｕｒｆｉｎ）， 唾液酸糖蛋白 （ｓｉａｔｏ－ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＰＮ（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、卵清蛋白 （ｏｖａｌｂｕｒｆｉｎ）、溶解 酵素 （ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、卟啉蛋白（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）等［５］。 蛋膜中还含有很多可溶性的高分子化合物 ， 如 图３ Ｎ 一乙酰氨基葡萄糖半乳糖、葡萄糖醛酸、透明质 角蛋白中的二级结构 角蛋白大分子主链是通过酰胺键 （又称肽键 ）联 酸、硫酸软骨素、氨基酸等。蛋膜中的无机物有钙、 镁、锶， 而几乎不含铅、铝、镉、汞、碘。此外， 蛋膜还含 结构成的多缩氨酸链。 ２Ｏ 多种 α一氨基酸 （氨基在 有粘多糖类的碳水化合物。蛋膜中的氨基酸组成可 羧基的 α位）构成其不同侧链。角蛋白中氨基酸的通 见表 １ 。 式为： Ｈ２Ｎ—ＣＨＲ—ＣＯＯＨ， 其中 Ｒ 是具有不同性质 ［６］ 表１ 蛋膜的氨基酸组成 （％） 氨基酸 Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ 含量 ３．３４ ３．３１ ５．５４ ５．５８ ６．２１ ９．７０ Ｐｒｏ Ｇｌｙ 的侧链， 由这些氨基酸缩聚而形成的多肽链的结构 Ａｌａ Ｃｙｓ 为： １２．０１ ９．５９ ４．１２ １０．３８ 氨基酸 Ｖａｌ Ｉｌｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＯＨ－ Ｐｒｏ ＯＨ－ Ｌｙｓ Ｍｅｔ 锁链素 含量 ７．９１ ３．５７ ４．７７ １．３９ １．４５ ０．９０ ０．１２ ３．０５ ０．０１ 其 中 侧 链 Ｒ１， Ｒ２， Ｒ３ 的 种 类 和 性 质 决 定 了 其 整 四川食品与发酵 ５０ ２００８ 年第 ４ 期 体的物理和化学性质， 也就是说角蛋白的物理性质 ６Ｏ％［１０］。而挤出法 ［９］是使粉碎的固体原料在介质 （水 ） 和化学性质并不决定于它的蛋白质主链， 而是决定 和 还 原 性 添 加 剂 （主 要 为 Ｎａ２Ｓ）中 形 成 液 相 ， 于 高 温 于侧链的种类以及侧链的交联情况。角蛋白大分子 高压下在挤出装置中加热熔化， 主要用于制备热塑 主链间能形成盐式键、二硫交联键（即胱氨酸键 ）和氢 性材料。 键等空间联键（见图 ４）。 表２ 提取角蛋白的机械方法 主要设备 主要的操作条件和操作方法 方法 高压水解法 高压釜 ０．６４Ｍｐａ ， １６５℃～１７０℃， ４０ｍｉｎ 高压膨化法 膨化设备 ０．２９Ｍｐａ ～０．５９Ｍｐａ ， １００Ｍｐａ ～１８０℃ ， ２０Ｍｐａ～３０ｓ， 迅速减压至大气压 挤压法 挤压机 压 缩 段 ： １００℃～１２０℃， 熔 融 段 （ 挤 压 温 度 ） ： １４０℃～２００℃， 挤 压 稳 定 后 取 样 碾 碎（ 过 ８０ 目筛） 挤出法 挤出装置 ７．６８Ｍｐａ～１１．５２Ｍｐａ ， ７０℃～１５０℃， 直 接 加热熔化 ２．２．２ 图４ 角蛋白大分子结构图 角 蛋 白 富 含 疏 水 性 氨 基 酸 ， 如 Ｐｈｅ， Ｉｌｅ， Ｖａｌ， Ｍｅｔ， 和 Ａｌａ， 故不溶于 水 、此 外 ， 其 结 构 中 有 大 量 的 化学法提取角蛋白 目前文献中报道的利用化学方法制备可溶性角 蛋白的方法主要包括酸碱处理法、还原法和氧化法。 ２．２．２．１ 酸碱处理法 二硫键相连， 所以具有较强的耐酸、碱及酶的能力 ， 酸碱法是比较传统的提取角蛋白的方法， 一般 但当一 Ｓ－ Ｓ 一受到破坏后， 便能在稀碱液中很快膨 做法是先用酸预处理来溶胀天然角蛋白， 然后在一 ［８］ 胀而溶解 。 定的温度和碱浓度下溶解， 过滤后收集滤液， 用等电 ２．２ 提取方法 点法提纯角蛋白。在酸碱处理过程中， 二硫键和肽键 角蛋白质物质因其独特的网状结构， 只能通过 均被破坏， 所以一般可溶蛋白质的收率越高则其分 选择适当的溶剂并控制适度的降解才能制成溶液。 子量越低。张瑞宇［１１］等用碱水解壳内膜提取角蛋白， 角蛋白质的大分子之间主要通过 － Ｓ－ Ｓ－ 键建立起稳 得出角蛋白提取的最佳工艺参数为 ： ＮａＯＨ５．２％ 、固 定的结合， 从而构成不溶性的蛋白质。可见， 若制取 液比 １：１６、温度 ８５℃。从壳内膜中提取角蛋白的得率 角蛋白质溶液， 使其溶解的关键是使分子链间的主 为 ４８．６％ 。 要交联 － Ｓ－ Ｓ－ 键断裂。文献中报道的角蛋白的加工 ２．２．２．２ 为了增大产物的亲水性， Ｔｉｍｍｏｎｓ 等［１２］用氧化剂 和提取方法主要有机械法、化学法及其酶法三类。 ２．２．１ 机械法提取和制备角蛋白 机械法提取角蛋白一般都是应用加热 （１００℃～ 氧化法 （如过氧乙酸、卤素、双氧水等 ）将角蛋白中的双硫键 部分氧化成磺酸基团。部分氧化后的角蛋白原料经 ２００℃）、加 压 （Ｏ．２９４ＭＰａ－ ０．２９８ＭＰａ）的 方 法 使 角 蛋 白 过干燥， 研磨成粉。此角蛋白粉可以直接用浓硫酸或 内部的双硫键被断裂水解， 从而使它变为可溶、易消 甲酸酸化， 在 ｐＨ＜１ 的条件下制得角蛋白溶液。 化的多肽混合物。文献中报道的主要的机械方法归 ２．２．２．３ 纳于表 ２。从表 ２ 可以看出高压膨化法所需的压力、 还原法 常用的打开双硫键的还原剂是巯基化合物 ， 巯 温度都比水解法的低， 时间也较短。另外， 水解法得 基化合物只作用于双硫键而不导致肽链的断裂 ， 还 到的产物呈凝胶状， 需要经过干燥、粉碎才能得到角 原法是提取角蛋白的一种较常用的方法。其反应式 蛋白粉， 而膨化所得产物呈疏松卷状， 不需要干燥过 如下 程就可以直接轻压成角蛋白粉， 消化率可达 ８０％ 左 右［９］。因此， 膨化法比水解法简单。挤压法是在高温、 高压、强剪切的条件下使角蛋白中的双硫键断裂， 粗 产物呈膨松状， 轻压即得角蛋白粉。研究表明， 角蛋 白二硫键经挤压作用后发生降解， 幅度可达 ５Ｏ％～ 还原法的一般做法是用巯基乙酸钠的碱性溶液 （用 ＮａＯＨ 溶液调节 ｐＨ－ ｐＨ８～ｐＨ１２） 处理固体原料， 第 ４４ 卷（ 总第 １４５ 期） 周艳华等： 对蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的提取分离技术及功能多肽的概述 ５１ 随后向溶液中加入一定量的尿素以使角蛋白溶胀 ， 在一定的温度下再反应一段时间， 滤去未溶解的原 料， 所得的滤液用渗析袋 （截留分子量一般为 １００００） 进行渗析， 再离心分离得到角蛋白溶液； 或者是先离 心分离， 再用盐析法从离心分离所得的上层清液中 析出角蛋白， 然后将此角蛋白溶于氨水、水或水和醇 的混合液中， 重新形成角蛋白溶液。 ２．２．３ 酶法制备角蛋白 酶法制取蛋膜中的角蛋白相对于传统的蛋白质 的酸水解或者碱水解等， 其优点在于反应条件温和， 对环境不造成污染， 过程易于控制， 酶解产物稳定， 图５ 保留了更多的营养价值， 能较好的满足生产的需要， 是一条环境友好的资源化、清洁化工艺技术， 该技术 ３．２ 胶原的右手超螺旋结构 胶原蛋白的提取方法 具有良好的环境效益、社会效益和推广前景。杨德玉 胶原的提取与纯化的目标是 ： 尽量使胶原提取 等［１３］以鸡蛋蛋壳膜为原料， 酶法提取蛋壳膜中角蛋 的产率、纯度更高， 并且使所提取的胶原能满足不同 白， 在最佳工艺条件下即酶用量为蛋膜量的 ３％（Ｗ／ 领域的要求。迄今为止， 胶原的提取方法主要有以下 Ｗ）， 固 液 比 １：１５， ｐＨ９～ｐＨ１０， 提 取 温 度 ５５℃～６５℃， 四种：酸法、碱法、盐法、酶法。在实际提取过程中， 不 提取时间 ６０ｍｉｎ， 角蛋白产率可达到 ２６％ 。 同提取方法之间往往相互结合， 以取得较好的提取 ３ 效果。至今仍未见有从蛋壳膜中提取胶原蛋白的报 蛋壳膜中胶原蛋白的提取 ３．１ 胶原蛋白的结构及其氨基酸组成 胶原， 最初的意思是“生成胶的产物”。 １８９３ 年 道。 ３．２．１ 酸法提取胶原蛋白 牛津大词典给胶原的定义是“结缔组织的组成成份， 酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条 煮沸时产生胶质”。随后， Ｇｒｏｓｓ （１９５６）首先命名构建 件下提取胶原蛋白， 主要采用低离子浓度酸性条件破 胶原纤维的蛋白质单体为原胶原 （ｔｒｏｐｏｃｏｌｌａｇｅｎ）。现 坏分子间的盐键和希夫碱， 而引起纤维膨胀、溶解， 作 在胶原的科学定义是 ： “细胞外基质 的 结 构 蛋 白 质 ， 为溶剂使用的酸， 主要有盐酸、醋酸、柠檬酸和甲酸 分子中至少应该有一个结构域具有 α链组成的三股 等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法， 用 螺旋构象 （即胶原域 ）”。 胶原一般为白色、透明、无 酸法提取的胶原最大程度的保持了其三螺旋结构， 适 分支的原纤维。已知的胶原中含有两种构象， 即三股 用于医用生物材料及原料的制备。赵苍碧等 ［１６］采用 螺旋和球形。成纤维胶原， 即 Ｉ， ＩＩＩ， Ｖ 和 ＸＩ 型胶 ０．３％ 的醋酸溶液在 ４℃条件下从牛膜中提取胶原蛋 原， 其基本结构单元是三股螺旋的原胶原。图 １－ ２ 为 白， 得到高纯度的胶原蛋白溶液。余海等 胶原的右手超螺旋结构示意图， 发挥人体生理功能 ０．５ｍｏｌ／Ｌ 的醋酸 溶 液 在 ４℃条 件 下 提 取 鼠 尾 肌 键 胶 的胶原必须是由三条缠绕的直链所组成， 成为螺旋 原蛋白， 经鉴定为 Ｉ 型胶原蛋白。Ｔａｋｅｓｈｉ 等［１８］的课 ［１４］ 构造， 好像麻花一般 。 胶原的氨基酸组成具有如下特征： ３．１．１ 甘 氨 酸 （ｇｌｙｃｉｎｅ） 约 ２５％－ ３０％ ， 每 隔 两 个 其 它 氨基酸残基 （Ｘ， Ｙ）即有一个甘氨酸， 其肽链可用 （Ｇｌｙ 一 Ｘ 一 Ｙ）ｎ 表示。 ３．１．２ ［１７］ 采用 题组采用 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ 的醋酸溶液从海妒鱼、鳍鱼、金 枪鱼、酮、水母等的皮中提取、分离纯化胶原蛋白， 并 对所提取的胶原蛋白的理化性质作了系统的研究。 ３．２．２ 碱法提取胶原蛋白 碱法提取即利用一定浓度的碱在一定的外界条 胶原中脯氨酸 （ｐｒｏｌｉｎｅ）约 １２％ ， 羟脯氨酸 （ｈｙ－ 件下提取胶原蛋白， 碱处理法中常用的处理剂为石 ｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ， Ｈｙｐ）约 １０％ ， 一 般 动 物 性 蛋 白 质 中 羟 灰、氢氧化钠、碳酸钠等。由于它容易造成肽键水解， 脯 氨 酸 含 量 极 少 ， 另 外 丙 氨 酸 （ａｌａｎｉｎｅ）约 为 １１％， 羟 因此得到的水解产物分子量比较低。所以， 若想保留 赖氨酸（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）约 ０．５％ 。 胶原的三股螺旋结构， 用此提取方法是不可行的。 ３．１．３ Ｈｏｌｚｅｒ［１９］采用 １％－ １．５％ 的石灰水浸泡的方法提取胶 胶原中缺乏色氨酸， 所以它在营养上为不完 全蛋白质［１５］。 原蛋白。有关单独采用碱法提取胶原蛋白的报道很 四川食品与发酵 ５２ 少， 一般是碱法提取和酸法提法结合使用。 ３．２．３ ２００８ 年第 ４ 期 生物活性肽的主要来源可分为天然存在的活性 盐法提取胶原蛋白 肽、人工合成的活性肽和蛋白质水解产生的活性肽 盐法提取是利用各种不同的盐在不同的浓度条 三种。 件下提取盐溶性胶原蛋白的方法。常用来提取胶原 天然存在的活性肽是目前研究最多的一类生物 的中性盐有盐酸一三羟甲基胺基甲烷 （Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ ）． 氯 活性肽， 它们分布于陆地和海洋的生物体中， 包括肽 化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下， 当盐的浓度达到 类抗生素、激素等生物体的代谢产物以及生物体的 一定量时， 胶原就会溶解在其中。一般情况下， 可采 组织、骨骼、肌肉、免疫系统、中枢神经系统中存在的 用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处 活性肽类 ；人工合成活性肽的途径主要有三条 ： 化学 理， 可以沉淀出不同类型的胶原蛋白 。 合成、酶法合成和重组 ＤＮＡ 技术， 化学合成途径主 ３．２．４ 要是固相合成法和液相合成法， 化学合成肽类的技 ［２０］ 酶法提取胶原蛋白 用蛋白酶可使胶原溶解， 且具有水解反应快、无 术要求高， 成本昂贵， 实际使用价 值 低 ： 蛋 白 质 水 解 环境污染、提取的水解胶原蛋白纯度高、水溶性好、 产生的活性肽主要是以化学法和酶法水解而来 ， 化 理化性质稳定等特点 ；同时， 蛋白酶还可以催化水解 学法以酸或碱断开蛋白质肽键， 由于反应环境较极 胶原的端肽的非螺旋区， 而对螺旋区无作用， 但引起 端， 不利于活性的保持， 而酶解蛋白质生产活性肽的 α１ 和 α２ 链展开， 这样溶解的胶原蛋白仍有完整的三 安全性却很高， 能在温和的条件下进行定位水解分 股螺旋结构， 适用于作为医用生物材料及原料。一般 裂产生特定的肽， 且水解过程易控制， 因而近几年报 对于交联程度较高的胶原蛋白原料， 采用醋酸并不 道的活性肽的制备方法均为酶解法。酶的选择是酶 能使其完全溶解， 可以使用一定量的胃蛋白酶， 在低 解法生产活性肽的关键， 而目标活性肽的下游技术 温条件下使其溶解， 采用胃蛋白酶溶解的方法所提 则是决定能否将之用于生产的关键。 取的胶原蛋白通常称为胃蛋白酶 溶 解 性 胶 原 蛋 白 （ ｐｅｐｓｉｎ － ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ， ＰＳＣ）。 Ｔａｋｅｓｈｉ 酶法生产的生物活性多肽是将人体平常所食用 和 Ｓ． 的食物蛋白质酶解成小分子的活性多肽， 得到的产 Ｋｉｍｕｒａ 等人分别从鱿鱼、乌贼皮和体壁及水母体壁 物安全可靠， 无副作用。这种酶法生产的小分子多肽 中提取了胶原蛋白， 并对所提取的胶原蛋白的理化 具有极强的生物活性和多样性， 已在世界范围内引 性质作了系统的研究。 起关注， 成为当今世界相关领域研究的热点。具有药 ４ 物学功能活性的生物活性肽不仅可以作为新的功能 ［２０］ 蛋壳膜中生物活性肽的制取 生 物 活 性 肽 （ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ） 是 介 于 氨 基 酸 与 性食品， 而且通过其作用机理以及结构的深入研究 蛋白质之间的分子聚合物， 它小至由两个氨基酸组 可以为提取或合成药物指明新的途径［２２］。 成， 大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成， 具有十 ４．２ 所用蛋白酶的选择与水解 分重要的生物学意义。现代生物代谢研究发现：人类 酶的选择是生产活性肽的关键， 目前商业用酶 摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后， 不像以 主要是微生物酶 （酸性蛋白酶、中性蛋白 酶 、碱 性 蛋 前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收， 更多的是以 白酶及复合酶）、植物蛋白酶及动物蛋白酶（见表 ３）。 表３ 低肽的形式直接吸收， 而且二肽和三肽的吸收速度 常用蛋白酶及其特性 比相同组成的氨基酸快 ［２１］。其中某些低肽不仅能提 种类 来源 供人体生长发育所需的营养物质， 且同时具有重要 胃蛋白酶 猪或其它动物 １．８－ ２．０ ４０－ ６５ 作用于蛋白水解物及多肽， 特 的胃 别是邻近芳香族氨基酸或二羟 的生理功能， 如促进矿物质吸收肽、防治肝性脑病 最适 ｐＨ 最适 Ｔ／℃ 特异性 基 Ｌ－ 氨基酸的肽链 肽 、易 消 化 吸 收 肽 、抗 菌 肽 、吗 啡 片 肽 、类 吗 啡 拮 抗 肽、血管紧张素转换酶抑制肽、抑制胆固醇作用肽、 机体防御功能肽等。上述功能是原蛋白质或组成氨 胰蛋白酶 动物的胰 木瓜蛋白酶 木瓜 ７．０－ ９．０ ５５ ５－ ７ ６０－ ７５ 专一性较宽， 水解多肽﹑酰胺及 脂 中 连 接 碱 性 氨 基 酸 Ｌｅｕ﹑Ｇｌｙ 基酸所不具备的独特的生理机能， 且许多活性肽的 的键 组成氨基酸并不一定是必需氨基酸。这就为更充分 碱性蛋白酶 地衣芽孢杆菌 １０－ １１ 的利用蛋白质资源， 特别是那些原本认为生物效价 中性蛋白酶 枯草芽孢杆菌 ７．０－ ７．５ ４５－ ５５ 不高的蛋白质资源提供了新的机遇。 动 物 蛋 白 水 复合酶制剂 ４．１ 解酶 生物活性肽的来源 专一性地与 Ｌｙｓ 或 Ａｒｇ 残基结合 ４０－ ５０ ６．５－ ７．５ ５０－ ６０ 主要断裂疏水氨基酸的碳末端 广谱 其主要由蛋白内切酶、外切酶 和风味酶等组成。 第 ４４ 卷（ 总第 １４５ 期） 周艳华等： 对蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的提取分离技术及功能多肽的概述 微生物蛋白酶与动物蛋白酶和植物蛋白酶相比 ５３ 的多肽不断被发现并用于防病治病中。近年来多肽 具备溶解性好、活力高、专一性不强的特点， 对蛋白 的分离与分析方法， 主要有高效液相色谱法、电泳、 质作用强烈， 非常适合于对蛋白质进行较深程度的 质谱及核磁共振等方法。 目前多肽的分离纯化方法有以下几种： 水解。微生物蛋白酶己经工业化生产， 例如诺维信 （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ ）公司生产的碱性蛋白酶和中性蛋白酶， ４．３．１ 高效液相色谱（ＨＰＬＣ） 因此， 微生物蛋白酶是今后应用的主要方向。当前的 高 效 液 相 色 谱 （Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏ－ 研究者常常要从大量的酶中进行筛选， 主要是对酶 ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＨＰＬＣ） 的出现为多肽的分离提供了非常 按原料蛋白质组成与酶的专一性进行筛选， 也可根 有效的手段， 在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示 据活性肽的结构， 应用酶工程生产高活性特定酶。选 出优异的性能。目前用于分离纯化多肽的模式主要 择的酶要有较强的专一性， 并且不会随着水解度的 有三种 ：一是凝胶过滤色谱， 按照多肽分子的大小进 提高出现苦味。针对不同的底物， 由于单一酶系往往 行分离， 二是离子交换色谱， 按多肽分子所具有的带 转化效果不佳， 采用复合酶系水解效果较好， 这样能 电基团的性质和数目进行分离 ；三是反相色谱， 按照 ［２３］ 获得较好的氨基酸、二肽、三肽比例 。利用基因工 多肽分子的疏水性强弱进行分离。 程对生产生物活性肽的酶进行改造， 从而获得新特 ４．３．２ 亲和层析 性的活性肽， 也会是一个重要的发展方向 。另外， 亲 和 层 析 （Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． ＡＣ） 是 利 用 要制备尽可能多的活性肽类产品， 一般不应选用端 连接在固定相基质上的配基与可以与其产生特异性 肽酶， 除非要进行必要的修饰在短时间加入， 但会增 作用的配体之间的特异的亲和性而分离的层析方 加操作的复杂性。 法。对多肽的分离目前主要应用其单抗或生物模拟 ［２４］ 水解后的水解也经常会有一些杂味 （主要是苦 配基与其亲和， 这些配基有天然的， 也有根据其结构 味 ）， 可以经脱味除去不愉快的挥发性呈味物质和掩 人工合成的。Ｐａｔｅｌ 等人利用一系列亲和柱分离纯化 蔽法掩蔽， 有研究发现， 应用微生物酶直接脱苦效果 得到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。 ［２３］ 好， 很有发展前景 。 ４．３．３ 毛细管电泳 国外科学家提出水解度 （ｄｅｇｒｅｅ ｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ， ＤＨ） 毛细管电泳（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＣＥ）是本世 的概念， 以此衡量酶切蛋白质的肽键成为小分子肽 纪 ６０ 年代末由 Ｈｊｅｒｔｅｎ 在传统的电泳技术基础上发 的情况。关于水解度的控制范围， 报道的数据有很大 明的， 它利用小的毛细管代替传统的大电泳槽， 使电 差别， 具体应根据目标活性肽的长度、活性肽产品的 泳效率提高了几十倍。此技术在 ８０ 年代得到迅猛地 风味而定。酶的种类、酶对底物的浓度、底物本身的 发展， 是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性 性质与变性程度、水解系统的 ｐＨ 值与离子强度、酶 多肽与蛋白类物质的有利工具。ＣＥ 根据应用的原理 反应浓度与时间都会影响水解度的大小， 一般水解 不同可分为以下几种 ：毛细管区带电泳、毛细管等电 度随反应时间的增加而增加， 但到一定程度增长趋 聚焦电泳、毛细管凝胶电泳和胶束电动毛细管层析 ［２５］ 于平缓 。 对蛋白酶解工艺主要集中 在 以 下 几 个 方 面 ：（１） 对新开发的蛋白质资源的酶解工艺研究以求获得最 等。 ５ 蛋壳膜中角蛋白与胶原蛋白的分子化技术及功 能多肽的研究 优的加工的功能特性产物为食品工业提供新的添加 中国是人口大国， 蛋的消费量非常大， 蛋膜资源 剂和配料；（２） 利用新的水解蛋白酶制备出肽分子量 丰富， 廉价易得。从资源利用化的角度出发， 蛋膜资 分布比较集中的水解物 ：（３）通过水解工艺的改善， 进 源的开发不仅具有一定的科学理论价值， 而且具有 一步提高生物活性肽的得率 ；（４） 新式的酶解工艺的 重要的社会效益、环境效益和经济效益， 有着越来越 ［２３］ 研究 。 ４．３ 多肽的分离纯化 广阔的前景。 蛋膜粉和角蛋白与人体皮肤天然相容， 因此具 多肽广泛存在于自然界中， 对多肽的研究和应 有良好的皮肤保健、保护、治疗功效。角蛋白的护肤 用， 一直是科学研究的一个主要方向。随着现代科技 功效相似于珍珠， 以角蛋白代替之， 产品成本可下降 的飞速发展， 从天然产物中获得多肽类物质的手段 ８５％。开展从蛋壳膜中提取角蛋白的研究工作， 特别 也不断得到提高， 一些新方法、新思路的应用使得新 是要保持角蛋白较大的分子量， 打破角蛋白中的二 ５４ 四川食品与发酵 ｓｉｔｉｏｎ ［Ｐ］ ＷＯ／１４５００，１９９８，４ 硫键， 但不破坏过多的肽键， 使其以近似分子的形式 被提取出来， 保持角蛋白的生物活性， 此项研究工作 ［６］ 成功地从蛋膜中提取纯的胶原蛋白尚未见文献报 道。胶原蛋白在各领域中的应用广泛， 特别是在化妆 品领域、食品领域、医药领域等。开展从蛋壳膜中提 Ｃｏｍｐｂｅｌｌ ｃｅｐｔｓ 具有极其重要的意义。 蛋膜中含有其自重 １０％ 左右的胶原蛋白， 然而 ２００８ 年第 ４ 期 ＮｅｄＡ，ＬａｗｒｅｎｃｅＣ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｍ－ Ａｎｄ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ［Ｍ］， ３ｒｄ， ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ， ｃｕｍｍｉｎｇ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ， １９９９，２７（１２）：１８－ １９． ［７］ 弋峰等 ． 可溶性鸡蛋壳膜蛋白的制备及其生物相容性 ［Ｃ］． 全国高分子材料科学与工程研讨会论文集 ， ２００４：４８９－ ４９０ ［８］ Ｓｈｅｎａｌ Ｖ Ａ ， Ｄａｌｖｉ Ｍ Ｃ．Ｗｏｏｌ Ｆｉｂｒｅｓ— Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｄｙｅｒ＆ Ｐｒｉｎｔｅｒ， １９８９ ， １４（６）： ２５ 取纯化胶原蛋白的研究工作， 通过提取纯化方法的 ［９］ 郭素华 ． 中国专利， １０５６９８Ａ．１９９１ 比较， 选择合适的提取纯化方法。此外， 还可对所提 ［１０］ 朱选， 金征宇， 刘当慧 ． 羽毛角蛋白剂压机制的研究 ． 中 国 取的胶原蛋白的各理化性质进行研究， 为蛋壳膜中 胶原蛋白的应用提供相应的理论依据。相关资料表 明， 利用一定量的酸主要有盐酸、醋酸、柠檬酸和甲 酸等或胃蛋白酶处理样品， 在一定条件下对样品进 行提取分离， 可使胶原蛋白保持完整的三股螺旋结 构， 以近似分子的形式被提取出来， 可适用于作为医 用生物材料及原料。此项研究工作为今后蛋壳膜中 胶原蛋白在化妆品、食品及医药等领域中的应用具 有举足轻重的重大意义。 生物活性肽是蛋白质经过生物酶降解后产生的 具有特殊生物学活性、氨基酸组成少于 ５０ 的肽类混 合物。生物活性肽具有许多特殊的生理活性， 主要体 现在免疫活性、抗高血压、降血脂、促生长活性、肿瘤 抑制性活性等。同时， 它又是重要的营养物质， 且极 易被人体吸收利用， 因此， 这些年来， 生物活性肽的 研究已成为高科技领域及产业化的新热点， 有着广 阔的前景。可在前人的研究基础上， 对蛋壳膜酶解过 程进行实验的再优化， 并建立动力学方程， 求取动力 学参数， 以指导实验的进行 ； 在条件 许 可 的 情 况 下 ， 粮油学报， １９９８ ， １３（４）： １６ ［１１］ 张瑞宇 ， 陈嘉聪 ． 蛋壳内膜中角蛋白的提取研究 ［Ｊ］． 食品科 学 ，２００５，２６ （ ９ ） ：２５１－ ２５４ ［１２］ Ｔｉｍｍｏｎｓ Ｓ Ｆ， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｃ Ｒ ， Ｓｍｉｔｈ Ｒ Ａ ．Ｕ Ｓ Ｐａｔ， ６１２４２６５．１９９９ ［１３］ 杨 德 玉 等 ． 酶 法 提 取 蛋 壳 膜 中 的 角 蛋 白 ［Ｊ］． 食 品 科 学 ， ２００７，２８ （ ６ ） ：２４０－ ２４２ ［１４］ 蒋 挺 大 ． 胶 原 与 胶 原 蛋 白 ［Ｍ］． 北 京 ： 化 学 工 业 出 版 社 ， ２００６： １－ １４ ［１５］ 陆璐 ．Ｉ 型胶原 的 提 取 及 其 组 装 和 表 征 ． ［Ｄ］． 东 南 大 学 ， ２００６ ［１６］ 赵 苍 碧 ， 黄 玉 东 ， 李 艳 辉 ． 从 牛 腆 中 提 取 胶 原 蛋 白 的 研 究 ［Ｊ］． 哈尔滨工业大学学报 ．２００４：３６（４）：５１５－ ５１９ ［１７］ 余 海 ， 廖 小 宜 ， 周 志 瑜 ． 鼠 尾 肌 腔 胶 原 蛋 白 提 取 及 凝 胶 的 制备 ． 海南医学， ２０００， ｌ１（３）：６４－ ６５ ［１８］ Ｔａｋｅｓｈｉ Ｎａｇａｉ， Ｅｉｊｉ Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｋｅｉ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎｏｒｉｏ Ｋａｎａｍｏｒｉ， Ｎｏｂｕｔａｋａ Ｓｕｚｕｋｉ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｓｋｉｎ ｗａｓｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｃｕｔｔｌｅｆｉｓｈａ ｌｙｃｉｄａｓ）． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１， ７２： ４２５－ ４２９ ［１９］ Ｈｏｌｚｅｒ， Ｄａｖｉｄ． Ｇｅｌａｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５４８４８８８， １９９６ 与质谱技术相结合对生物活性肽进行结构与序列分 ［２０］ Ｔａｋｅｓｈｉ Ｎａｇａｉ， Ｅｉｊｉ Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｋｅｉ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎｏｒｉｏ 析， 建立一套完整的多肽分离纯化及分析检测技术 ； Ｋａｎａｍｏｒｉ， Ｎｏｂｕｔａｋａ Ｓｕｚｕｋｉ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 对产物活性肽进行生物学功能实验， 以增加蛋膜多 ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｓｋｉｎ ｗａｓｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｃｕｔｔｌｅｆｉｓｈａ 肽的附加值， 开辟保健药和功能添加剂的研究和应 用。 ｌｙｃｉｄａｓ）． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１， ７２： ４２５－ ４２９ ［２１］ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ． Ｍｏｌｙｎｅｕｘ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｏｏｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ－ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２， ５０：６９３６－ ６９４２ 参考文献： ［１］ 皮钰珍等 ． 鸡蛋壳膜资源的开发与应用前景 ［Ｊ］． 食品科技 ， ２００６（４）：１２８－ １３０ ［２］ 张瑞宇 ． 废弃蛋壳的利用价值及其资源化途径与技术 ［Ｊ］． 重庆工商大学学报 （自然科学版 ）， ２００６， ２３（６）：５５１ — ５５５ ［３］ 申 进 亮 ， 赵 艳 红 ， 吴 文 霞 ． 贴 敷 蛋 壳 膜 治 疗 角 膜 溃 ３０ 例 月 ． 河南中医， １９９９，１９（２）：３７－ ３８． ［４］ 王淑珍 ， 萧炜 ， 陈亮 ． 蛋壳膜美容保健奶研制及其营养分析 ［Ｊ］． 食品工业 ，２００４（６）： ４１－ ４２． ［５］ Ｍａｒｕｔａ， Ｍｉｙａｚａｋｉｅ． Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｅｇｇｓｈｅｌｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏ－ ［２２］ Ｉｑｂａｌ Ｇｉｌｌ， Ｒｏｓｉｎｓ Ｌｏｐｅｚ－ Ｆａｎｄｉｎｏ， Ｘａｖｉｅｒ Ｊｏｒｂａ， Ｅｖｇｅｎｙ Ｎ． Ｖｕｌｆｓｏｎ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｐ－ ｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９６， １８： １６２－ １８３． ［２３］ 蒲 首 承 ， 王 金 水 ． 生 物 肽 活 性 的 制 备 与 应 用 ［Ｊ］． 粮 食 加 工 ， ２００５ （５）： ４９－ ５１ ［２４］ 杜林， 李亚娜 ． 生物活性肤的功能与制备研究进展 ［Ｊ］． 中国 食物与营养， ２００５， Ｃ８）： １８－ ２１ ［２５］ 陈芳， 阐健全， 陈宗道， 王光慈 ． 生物活性肤的酶法制备 ［Ｊ］． 四川食品与发酵， ２００１， ３６（３）：２７－ ３１