Nghiên cứu tạo mô hình chuột mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHAN NGỌC UN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO MƠ HÌNH CHUỘT MANG THAI HỘ NHẰM ỨNG DỤNG TẠO CHUỘT CHUYỂN GEN Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình Cán chấm nhận xét : Cán chấm nhận xét : Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày 14 tháng 01 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Nguyễn Đức Lượng PGS TS Trần Lê Bảo Hà PGS TS Nguyễn Thị Thủy Tiên TS Hoàng Mỹ Dung TS Nguyễn Trọng Bình Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phan Ngọc Uyên Phương MSHV: 1570770 Ngày, tháng, năm sinh: 26/03/1991 Nơi sinh: Quảng Trị Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo mơ hình chuột mang thai hộ nhằm tạo chuột chuyển gen NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Xác định giai đoạn động dục chuột phương pháp quan sát trực quan âm đạo thông qua phương pháp vết phết tế bào âm đạo  Tạo chuột mẹ mang thai hộ thành công phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng theo dõi chuột mẹ mang thai sau chuyển phôi II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/08/2019 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019 IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng cảm ơn đến q Thầy, Cơ giảng dạy chương trình Cao học Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM hết lòng truyền nhiệt huyết kiến thức q giá giúp tơi hồn thành tốt luận văn sống Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Tiến sĩ Nguyễn Trọng Bình tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực luận văn thạc sĩ khoa học Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Giáo sư Fumihiro Sugiyama, Phó giáo sư Seiya Mizuno, Tiến sĩ Đinh Thị Hương Trà, chị Tanimoto, chị Kato, Chị Daitoku, chị Okano, nghiên cứu sinh Suziki toàn thể anh, chị, em, bạn bè Khu nuôi động vật thử nghiệm Trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Cám ơn tập thể lớp cao học tất anh, chị, em khóa học, đặc biệt chị Nguyễn Thị Anh Thư động viên tinh thần giúp vượt qua nhiều khó khăn suốt thời gian học trường Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học tài trợ nguồn kinh phí để tơi thực luận văn thạc sĩ Đồng thời, gửi lời cảm ơn đến anh, chị, em, bạn bè thuộc Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Động vật – Trung tâm Công nghệ Sinh học Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè tạo nguồn động viên để tơi hồn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn! Phan Ngọc Uyên Phương ii TÓM TẮT Việc tạo chuột mẹ mang thai hộ đóng vai trị quan trọng việc tạo chuột biến đổi gen phục vụ nghiên cứu khoa học đặc biệt lĩnh vực liên quan đến y sinh học Mặc dù việc tạo chuột mẹ mang thai hộ nghiên cứu áp dụng rộng rãi giới, nhiên Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố liên quan đến việc chuyển phôi mang gen ngoại lai vào chuột mẹ mang thai hộ Các nghiên cứu liên quan đến tạo phôi chuột chuyển gen nghiên cứu Việt Nam, nhiên để tạo sinh vật chuyển gen, phôi phải chuyển vào chuột mẹ mang thai hộ để sinh chuột mang gen Vì nghiên cứu chúng tơi có tiềm lớn việc ứng dụng tạo chuột biến đổi di truyền Trong nghiên cứu này, phương pháp tạo mơ hình chuột mẹ mang thai hộ thực sau: Đầu tiên, chuột đực hữu thụ phẫu thuật cắt ống dẫn tinh giao phối với chuột hữu thụ nhằm kiểm tra kết bất thụ Chuột cho phôi gây siêu noãn IU PMSG IU hCG, giao phối với chuột đực hữu thụ thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho trình vi tiêm gen egfp vào tiền nhân đực Các phơi giai đoạn 1-2 tế bào sau chuyển vào ống dẫn trứng chuột mẹ mang thai hộ nhằm kiểm tra hiệu việc tạo chuột mẹ mang thai hộ Mặt khác, chuột hữu thụ khác xác định giai đoạn động dục phương pháp vết phết tế bào âm đạo làm đối chứng với phương pháp quan sát trực quan âm đạo Các chuột giai đoạn động dục sàng lọc ghép đôi với chuột đực bất thụ, sau kiểm tra dấu hiệu giao phối nút nhầy âm đạo Đối với chuột có dấu hiệu giao phối thành công phẫu thuật mở lưng kiểm tra vị trí chuyển phơi với diện trương phồng ống dẫn trứng cuối chuyển phôi vào ống dẫn trứng, theo dõi trình mang thai sau ngày đến 19±3 ngày Kết cho thấy chuột đực bất thụ đạt tỉ lệ 80% Đối với chuột cái, nhóm nghiên cứu xác định giai đoạn động dục với diện tế bào đặc trưng tế bào biểu mơ sừng hóa khơng nhân đồng thời trực quan âm đạo sưng, mở rộng, màu hồng, ẩm ướt Các chuột giai đoạn động dục quan sát mắt thường sau giao phối với chuột đực bất thụ cho tỉ lệ giao phối thành công việc tạo chuột mang thai giả 81,67% iii Toàn chuột mang thai giả với xuất đoạn bóng cho q trình chuyển phôi giai đoạn 1-2 tế bào đạt tỉ lệ 100% chuột nhận phơi mang thai Trong có 2/134 chuột phát sáng huỳnh quang chiếm tỉ lệ 1,49% Mặc dù tỉ lệ chuột phát sáng huỳnh quang chưa cao, nhiên kết nghiên cứu cho thấy tiềm to lớn việc tạo mô hình chuột mang thai hộ phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng nhằm hướng đến tạo chuột chuyển gen iv ABSTRACT The creation of surrogate mothers plays an important role in creating genetically modified mice for scientific researches, especially in biomedical fields Although surrogate mother mice have been studied and widely applied in the world, but in Viet Nam has not been any published related to transfer of embryos carrying DNA into recipient foster mice So our research has great potential for the application of genetically engineered mice In this study, the method of creating a model of surrogate mother was performed as follows: at first, the male mice were surgically cut vasa deferens and mate with the female mice in order to check the results Females were superovulated, first by IU PMSG injection, then 46 – 48 h later by IU hCG injection After that, Females were placed with males for collecting Pronuclear-stage embryos and microinjection egfp into these embryos These 1-2 stage embryos were then transferred to the oviducts of surrogate mothers On the other hand, other female mice will be identified as the estrus (estrous) stage by vaginal cytology as a control against visual observation Estrus females were screened and paired with vasectomized ICR males and were checked copulation plug and collect ICR females with vaginal plug to check position of embryo transfer is ampulla and then reimplantation of injected embryos Pregnancy female mice after days to 19-21 days The results showed that male infertility was 80% For female mice, the team identified the estrus stage with the presence of cornified epithelial cell and visual, pink, less wet vaginal were paired with together infertility male mice and the success rate of mating mice was 81.67% The whole of pseudo pregnant mice were used for transferring of – stage embryo, reached the rate of 100% of mice receiving pregnant embryos In which 2/134 fluorescing mice accounted for 1.49% Although the ratio of mice with fluorescent fluorescence is not high, the results of this study show the great potential of creating surrogate mice model by surgical transfer of embryos into the fallopian tubes to guide to create transgenic mice v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực thực nhóm nghiên cứu chúng tơi Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên Phan Ngọc Uyên Phương vi MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng chuột mẹ mang thai hộ phương pháp phẫu thuật chuyển phôi vào ống dẫn trứng 2.2 Vai trò chuột nghiên cứu 2.3 Tổng quan chuột nhắt trắng 2.3.1 Sinh lý sinh sản 2.3.2 Cơ quan sinh sản chuột nhắt trắng 2.3.3 Chu kì động dục chuột 2.3.4 Các loại tế bào giai đoạn chu kì động dục chuột 10 2.4 Công nghệ cấy truyền phôi 11 2.5 GFP – EGFP tầm quan trọng nghiên cứu 13 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu 14 3.1.1 Thiết bị, dụng cụ 14 3.1.2 Hóa chất, mơi trường sử dụng cho nghiên cứu 14 3.1.3 Động vật sử dụng cho nghiên cứu 15 3.2 Phương pháp 15 3.2.1 Tạo mơ hình chuột đực bất thụ 16 3.2.2 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 17 3.2.3 Xác định giai đoạn động dục chuột nhắt trắng ICR 18 3.2.3.1 Các phương pháp xác định chu kì động dục 18 3.2.3.2 Phương pháp quan sát trực quan âm hộ 18 3.2.3.3 Xác định chu kì động dục chuột vết phết tế bào âm đạo 19 3.2.4 Thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 23 3.2.4.1 Chuẩn bị đĩa vi giọt mơi trường cho q trình thu nhận hợp tử giai đoạn tiền nhân 23 vii 3.2.4.2 Gây siêu noãn chuột thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 24 3.2.5 Kiểm tra hoạt động plasmid mang gen egfp 25 3.2.6 Chuẩn bị egfp cho trình vi tiêm 25 3.2.7 Vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân 27 3.2.8 Kiểm tra phát triển hợp tử biểu huỳnh quang phôi giai đoạn tế bào 27 3.2.9 Nuôi phôi chọn lọc phôi chuyển 28 3.2.10 Phương pháp kiểm tra huyết thống chuột mẹ mang thai hộ chuột sinh 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34 4.1 Tạo chuột đực bất thụ 34 4.2 Biểu âm hộ chuột giai đoạn động dục 35 4.3 Sự diện loại tế bào vết phết tế bào âm đạo (vaginal smear) chuột giai đoạn động dục 37 4.4 Kiểm tra hoạt động egfp 39 4.5 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân cho trình vi tiêm 40 4.6 Tạo chuột mang thai hộ 41 4.7 Kiểm tra huyết thống chuột mẹ mang thai hộ chuột sinh 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 40 tiến hành sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho trình vi tiêm egfp Hình 4.5 tế bào HEK293T kính hiển vi huỳnh quang (thang đo: 100 µm) A: Quan sát ánh sáng trắng B: Quan sát ánh sánh kích thích với phát sáng huỳnh quang xanh egfp 4.5 Sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân cho trình vi tiêm Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho trình vi tiêm egfp vào tiền nhân đực nhằm tạo chuột phát sáng huỳnh quang dấu hiệu để kiểm tra khác mặt huyết thống với chuột mẹ nhận phơi Q trình thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân kế thừa thực theo cơng trình cơng bố rộng rãi giới [4], [8], [27], [44], [54], [55] mô tả sơ lược sau: Chuột khỏe mạnh, trưởng thành mặt sinh dục gây siêu noãn IU PMSG IU hCG sau 46 – 48 giờ, sau phối với chuột đực hữu thụ kiểm tra nút nhầy âm đạo cuối thu nhận hợp tử giai đoạn hai tiền nhân chuẩn bị cho trình vi tiêm egfp Bảng 4.4 Số hợp tử thu nhận cho trình vi tiêm egfp Số phôi Số chuột sử Số phôi thu Số phôi dụng nhận vi tiêm 132 110 79 227 224 204 Lô TN chuyển phôi sau vi tiêm Kết bảng 4.5 cho thấy với liều tiêm hormone PMSG, hCG IU nhóm nghiên cứu chúng tơi nhu nhận trung bình 32,64 hợp tử giai đoạn hai tiền nhân (359/12) Đối với chuột độ tuổi sinh sản bình thường cho 8-12 chuột 41 con/ lần sinh sản Như kết thu nhận hợp tử hoàn toàn đáng ghi nhận cho việc tối thiểu hóa số động vật sử dụng Các phơi sau vi tiêm đánh giá sinh trưởng phát triển, sau chuyển phơi vào chuột mẹ mang thai hộ Hình 4.6 Hợp tử giai đoạn hai tiền nhân Hình 4.7 Vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân làm nguyên liệu cho trình chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ Trong nghiên cứu này, với quy trình thực trên, chúng tơi ghi nhận dấu hiệu thụ tinh thể diện hợp tử giai đoạn hai tiền nhân có xuất hai thể cực Sau đó, hợp tử quan sát thấy rõ ràng tiền nhân lựa chọn, hợp tử bất thường có tiền nhân, có ba tiền nhân, màng bào tương khơng trịn đều… bị loại bỏ Như vậy, trình sàng lọc hợp tử giai đoạn hai tiền nhân (hình 4.6) chúng tơi thành công Các hợp tử chuẩn bị cho trình vi tiêm egfp (hình 4.7) chuẩn bị cho q trình chuyển phơi vào chuột mẹ mang thai hộ 4.6 Tạo chuột mang thai hộ Chuột mang thai hộ 0,5 dpc (days postcoitum) sử dụng cho chuyển phôi vào ống dẫn trứng; 2,5 dpc sử dụng cho chuyển phôi vào tử cung 42 Chuột mang thai hộ cho thành công có dấu hiệu giao phối với diện lớp màu trắng đục vàng nhạt nút nhầy âm đạo (hình 4.8 B) diện đoạn bóng (ampulla) ống dẫn trứng chuẩn bị cho q trình nhận phơi hình 4.9 B Sau q trình chuyển phơi, chuột nhận phơi có dấu hiệu mang thai Bảng 4.5 Tỉ lệ thành công việc tạo chuột mang thai giả Số chuột sử dụng Số chuột có diện ampulla (%) Số chuột sử dụng chuyển phôi 12 10 (83,33) 10 (80,00) Trung bình 81,67% Trong tổng số 17 chuột kiểm tra dấu hiệu giao phối thành cơng (hình 4.8) để tạo chuột mang thai giả, có 14 số 17 (81,67%) chuột nhận phôi (pseudopregnant recipient females) sử dụng để chuyển phôi số 17 (18,33%) chuột không sử dụng để chuyển phơi trước có diện giao phối thành cơng (hình 4.8 B) Điều cho thấy việc kiểm tra vị trí nhận phơi ống dẫn trứng khơng có đoạn bóng (hình 4.9 A) có đoạn bóng (4.9 B) sau q trình giao phối thành cơng với chuột đực bất thụ quan trọng, yếu tố định việc chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột mẹ mang thai hộ Hình 4.8 Âm hộ chuột A: Chưa giao phối giao phối không thành công B: Giao phối thành công (một lớp màu vàng nhạt trắng đục) 43 Hình 4.9 Ống dẫn trứng chuột mang thai hộ A: Ống dẫn trứng chuột ampulla B: Ống dẫn trứng chuột với diện ampulla rõ rệt chuẩn bị cho trình chuyển phơi C: Ống dẫn trứng chuột sau chuyển phôi với diện bong bóng khí bên D: Kim chuyển phơi (transfer pipette) sử dụng cho q trình chuyển phơi với đan xen đoạn mơi trường – khơng khí – mơi trường – khơng khí – mơi trường Từ kết trên, tiến hành chuyển phôi giai đoạn - tế bào vào đoạn ống dẫn trứng Hình 4.9 C cho thấy diện bong bóng khí nhằm đảm bảo phơi bên kim chuyển phơi (hình 4.9 D) đẩy vào ống dẫn trứng để đảm bảo thêm lần nữa, kim chuyển phôi sau chuyển phôi kiểm tra kính hiển vi soi để chắn khơng cịn phơi cịn sót lại kim, đồng thời bong bóng khí giúp cho mơi trường lỏng chứa phôi không bị trào khỏi ống dẫn trứng, làm sở cho việc theo dõi dấu hiệu mang thai chuột sau đưa chuột mang thai hộ trở lại buồng ni (hình 4.10) Bảng 4.6 Tỉ lệ thành cơng hình thành chuột mẹ mang thai hộ qua q trình chuyển phơi Số phơi sử dụng Số phôi chuyển vào ống dẫn trứng Số chuột mẹ mang thai /chuột mang thai hộ sử dụng (%) Số chuột sinh biểu huỳnh quang /chuột sinh 4/4 (100) 0/69 10/10 (100) 2/134 79 283 (204+79) (đối chứng – không vi tiêm egfp) 204 (vi tiêm egfp) 44 Hình 4.10 Lồng chuột ni chuột nhận phơi sau q trình chuyển phôi Theo dõi mang thai chuột mẹ từ ngày 19 ngày sau chuyển phôi Dựa vào kết bảng 4.4, ghi nhận 4/4 chuột mang thai hộ mang thai nhóm đối chứng 10/10 chuột mang thai sau trình chuyển phơi nhóm vi tiêm egfp Điều cho thấy nhóm nghiên cứu tạo mơ hình chuột mẹ mang thai hộ với tỉ lệ thành công cao Làm chủ quy trình nghiên cứu nhằm ứng dụng cho nghiên cứu Chuột sinh sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống với chuột mẹ mang thai hộ Theo dõi mang thai chuột mẹ từ ngày 19 ngày sau chuyển phơi Hình 4.11 cho thấy q trình mang thai chuột sau chuyển phơi Cụ thể hình 4.11 B cho thấy có hồi phục vết thương lưng, có tăng kích thước vú tăng nhẹ trọng lượng Hình 4.11 C cho thấy tăng trọng lượng cách rõ rệt, điều chứng minh trình tạo chuột mẹ mang thai hộ chuyển phôi thành công Chuột sinh sau 19±3 ngày đồng thời kiểm tra huyết thống chuột sinh chuột mẹ nhận phơi Hình 4.11 Theo dõi trình mang thai chuột mang thai hộ sau chuyển phôi 45 A: Chuột vừa chuyển phôi ngày 0,5 B: Chuột nhận phơi có dấu hiệu mang thai sau 7,5 ngày C: Chuột nhận phôi mang thai sau 18,5 ngày 4.7 Kiểm tra huyết thống chuột mẹ mang thai hộ chuột sinh Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng chuột khỏe mạnh giao phối với chuột đực bất thụ, điều dẫn đến ống dẫn trứng chuột nhận phơi khơng có tinh trùng, khơng có hình thành phơi thai thân chuột nhận phơi Từ nhóm nghiên cứu dễ dàng kết luận toàn chuột sinh khác mặt huyết thống với chuột nhận phôi Bên cạnh đó, chúng tơi sử dụng phơi vi tiêm plasmid mang gen egfp để chuyển phôi chuột mẹ nhận phôi chuột không mang gen egfp, chuột sinh phát sáng huỳnh quang ánh sáng kích thích (hình 4.12 bảng 4.4) xem thành cơng q trình tạo chuột mẹ mang thai hộ, chuyển phơi Tồn chuột sinh nhóm nghiên cứu kiểm tra biểu huỳnh quang kính hiển vi soi có gắn huỳnh quang (hình 4.12) với bước sóng 530550 nm [56] ghi nhận thấy phát sáng màu xanh lục với biểu protein egfp hình bên Hình 4.12 Hệ thống kính hiển vi soi có gắn huỳnh quang sử dụng cho việc kiểm tra biểu phát sáng huỳnh quang chuột 46 Hình 4.13 Chuột phát sáng huỳnh quang protein egfp A1, B1, C1: ánh sáng trắng A2, B2, C2: ánh sáng kích thích có bước sóng 530 – 550 nm Trong cặp đơi A1, A2 chuột bên trái chuột không mang gen, chuột bên phải mang gen biểu huỳnh quang egfp B1, B2: Chuột không mang gen biểu huỳnh quang egfp C1, C2: Chuột mang gen biểu huỳnh quang egfp Nhằm chứng minh việc tạo thành công chuột mẹ mang thai hộ, chuyển phôi phương pháp tiếp cận vị trí chuyển phơi thơng qua ống dẫn trứng Dựa vào bảng 4.4 cho thấy 14 lần chuyển phôi cho 14 chuột mẹ mang thai hộ thành công với tỉ lệ 100%, lơ đối chứng phôi không vi tiêm, thu nhận tỉ lệ chuyển phơi 71,83% thí nghiệm sử dụng phôi vi tiêm DNA thu nhận tỉ lệ chuyển phôi 65,69% Mặc dù nhiều nghiên cứu chứng minh egfp không gây hại cho tế bào xem dấu hiệu nhận biết việc chuyển gen vào phôi hay tế bào, nhiên Mohamed S Hassanane cộng năm 2017 [42] chứng minh việc chuyển gen ngoại lại vào tế bào làm giảm khả phân chia thành tế bào, điều lí giải kết chuyển phôi lô đối chứng không vi tiêm egfp vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân lại có kết chuyển phôi mang thai cao lô thí nghiệm Về việc chuyển phơi Masahito Ikawa cộng nghiên cứu họ sử dụng 12 47 chuột mang thai hộ, ghi nhận chuột mang thai chiếm tỉ lệ 75% Pablo Gonza´lez-Jara năm 2017 chuyển phôi giai đoạn tế bào vào ống dẫn trứng tổng số 391 chuột chuyển phơi có 333 chuột mang thai đạt tỉ lệ thành công 85,2% tổng số 5029 phôi chuyển có 1824 phơi chuyển thành cơng chiếm tỉ lệ thành công 36,26% [28] Như kết chứng minh việc tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm phục vụ nghiên cứu tạo chuột chuyển gen chuyển phôi từ vị trí ống dẫn trứng điều cần thiết [57] Nghiên cứu ghi nhận 2/134 chuột sinh phát sáng huỳnh quang, đạt tỉ lệ 1,49% kết khiêm tốn so với nghiên cứu giới Tuy nhiên, đề cập trên, để tạo động vật biến đổi di truyền, tùy theo mục đích sử dụng mà chuột chọn lựa phù hợp Các nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột biến đổi gen sử dụng chuột chủng, điều kiện khơng cho phép, Việt Nam chưa có chuột chủng để nghiên cứu mà chủ yếu chuột nhắt trắng có biến đổi gen (chuột không chủng), điều lí giải tỉ lệ tạo chuột phát sáng huỳnh quang có kết thấp Tuy nhiên, kết nghiên cứu việc tạo thành cơng mơ hình chuột mang thai hộ góp phần cho thấy tiềm lớn việc thực nghiên cứu liên quan đến việc tạo chuột chuyển gen phương pháp Crispr/cas mà giới đẩy mạnh nghiên cứu nhằm đưa nghiên cứu Việt Nam tiến đến gần với nghiên cứu giới 48 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Tạo thành công chuột đực bất thụ với tỉ lệ 80% - Việc xác định giai đoạn động dục chuột nhằm tạo chuột mẹ mang thai giả cần thiết Việc sàng lọc chuột có dấu hiệu giao phối thành công yếu tố quan trọng, yếu tố định việc đưa định phẫu thuật kiểm tra vị trí nhận phơi - Tạo thành công chuột mang thai giả đạt tỉ lệ 81,67%, ghi nhận 100% chuột chuyển phơi có dấu hiệu mang thai, tỉ lệ chuyển phơi tự nhiên 71,83%, phôi vi tiêm DNA ngoại lai 65,69% - Tạo thành công chuột mẹ mang thai hộ với tỉ lệ thành công cao (100%), tất 14 chuột sử dụng làm chuột mẹ mang thai hộ có dấu hiệu mang thai ổn định qua lần chuyển phôi Đồng thời, chuột đực sử dụng để tạo chuột mang thai giả chứng minh không làm cho chuột mang thai sau tuần ghép đơi có dấu hiệu giao phối thành cơng, chuột sinh có biểu phát sáng huỳnh quang ánh sáng kích thích, sở để chứng minh khác mặt huyết thống chuột chuột mẹ mang thai hộ 5.2 Kiến nghị - Phân tích kiểu gen chuột sinh để xác định chuột mang gen ngoại lai nhằm phục vụ nghiên cứu tạo chuột chuyển gen nói riêng động vật biến đổi di truyền nói chung - Lai tạo chuột phát sáng huỳnh quang với dịng chuột bình thường nhằm tạo đàn chuột mang gen ngoại lai phục vụ cho nghiên cứu - Thực nghiên cứu việc đau đớn khả mang thai tái sử dụng chuột mẹ mang thai hộ cho lần chuyển phôi 49 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN Phan Ngọc Uyên Phương, Lê Bảo Thơ, Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Đăng Qn, Dương Hoa Xơ “Xác định chu kì động dục -tiềm ứng dụng nghiên cứu liên quan đến chuột thí nghiệm” – Poster Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc – năm 2019 Tiểu ban Công nghệ Sinh học Y Dược – Mã số: DV – 015 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] F A Ran, P D Hsu, J Wright, V Agarwala, D A Scott, and F Zhang, “Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system,” Nat Protoc., vol 8, no 11, pp 2281–2308, 2013 M Okabe, M Ikawa, K Kominami, T Nakanishi, and Y Nishimune, “‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells,” FEBS Lett., vol 407, no 3, pp 313–319, 1997 D D Carson et al., “Embryo implantation,” Dev Biol., vol 223, no 2, pp 217–237, 2000 L M Ittner, “Pronuclear injection for the production of transgenic mice,” Nat Protoc., Vol 2, No 5, pp 1207–1215, 2007 F Itoi et al., “Offspring from Mouse Embryos Developed Using a Simple Incubator-Free Culture System with a Deoxidizing Agent,” PLoS One, vol 7, no 10, 2012 A Isotani, K Yamagata, M Okabe, and M Ikawa, “Generation of Hprtdisrupted rat through mouse←rat ES chimeras,” Sci Rep., vol 6, no 1, p 24215, 2016 A J Modzelewski, S Chen, B J Willis, K C K Lloyd, J A Wood, and L He, “Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology,” Nat Protoc., vol 13, no 6, pp 1253–1274, 2018 Y Wu et al., “Generating viable mice with heritable embryonically lethal mutations using the CRISPR-Cas9 system in two-cell embryos,” Nat Commun., vol 10, no 1, 2019 U Lampreht Tratar, S Horvat, and M Cemazar, “Transgenic Mouse Models in Cancer Research,” Front Oncol., vol 8, no July, pp 1–18, 2018 R H Waterston et al., “Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome,” Nature, vol 420, no 6915, pp 520–562, 2002 L A Ogilvie, A Kovachev, C Wierling, B M H Lange, and H Lehrach, “Models of Models: A Translational Route for Cancer Treatment and Drug Development,” Front Oncol., vol 7, no September, pp 1–7, 2017 K Deb, J Reese, and B C Paria, “Methodologies to Study Implantation in Mice,”, Methods in Molecular Medicine, vol 121, pp 9–34 A Manuscript, “Generation of Transgenic Mice,” 2011 F A La et al., “Mouse sperm begin to undergo acrosomal exocytosis in the upper isthmus of the oviduct,” Dev Biol., vol 411, no 2, pp 172–182, 2016 E Mizutani, A Ogura, and T Wakayama, “Chapter 20 Nuclear Transfer in the Mouse Oocyte,” vol 957, pp 285–300 M B & T W Satoshi Hishigami, Sayaka Wakayama, Nguyen Van Thuan, Hiroshi Ohta, EiJi Mizutani, Takafusa Hikichi, Hong-Thuy Bui, Sebastian Balbach, Atsuo Ogura, “Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer,” Nat Protoc., vol 1, no 1, pp 125–138, 2006 L Cui et al., “Transcervical Embryo Transfer in Mice,” Journal of the American Associasion for Laboratory Animal Science, vol 53, no 3, pp 228231, 2014 51 [18] M Johnson, “Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual,” Trends in Genetics, vol p 298, 1986 [19] H J Cooke and P T K Saunders, “Mouse models of male infertility,” Nat Rev Genet., vol 3, no 10, pp 790–801, 2002 [20] S L Byers, M V Wiles, S L Dunn, and R A Taft, “Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images,”, Plos one, vol 7, no 4, pp 1–5, 2012 [21] Y Li, Q Wei, J Feng, M Xu, R Huang, and F Shi, “Expression of bone morphogenetic protein , , and related components of the BMP signaling pathway in the mouse uterus during the estrous cycle *,”, Journal of Zhejiang University-SCIENCE B, vol 15, no 7, pp 601–610, 2014 [22] A S Aguiar, A E Speck, I M Amaral, P M Canas, and R A Cunha, “The exercise sex gap and the impact of the estrous cycle on exercise performance in mice,” Sci Rep., vol 8, no 1, pp 1–8, 2018 [23] S Mahjabeen, M K Hatipoglu, D M Benbrook, S D Kosanke, D GarciaContreras, and L Garcia-Contreras, “Influence of the estrus cycle of the mouse on the disposition of SHetA2 after vaginal administration,” Eur J Pharm Biopharm., vol 130, no July, pp 272–280, 2018 [24] I T Performance, “Visual Guide to the Mouse Estrous Cycle JAX ® Mice Pup Appearance by Age,”,Plos one, vol 7, no 4, 2012 [25] J D Vidal and A J Filgo, “Evaluation of the Estrous Cycle, Reproductive Tract, and Mammary Gland in Female Mice,” Curr Protoc Mouse Biol., vol 7, no 4, pp 306–325, 2017 [26] A Sarvari, M M Naderi, and M R Sadeghi, “A Technique for Facile and Precise Transfer of Mouse Embryos,”, Avicenna Journal of Medical Biotechnology , vol 5, no 1, pp 3–6, 2013 [27] S Mizuno et al., “Simple generation of albino C57BL/6J mice with G291T mutation in the tyrosinase gene by the CRISPR/Cas9 system,” Mamm Genome, vol 25, no 7–8, pp 327–334, 2014 [28] P González-Jara, T Fontela, E López-Mimbela, M Cereceda, D Del Olmo, and M Moreno, “Optimization of the balance between effort and yield in unilateral surgical transfer of mouse embryos,” Lab Anim., vol 51, no 6, pp 622–628, 2017 [29] R Carballada, T Degefa, P Esponda, and C D I Biolo, “Transfection of Mouse Eggs and Embryos Using DNA Combined to Cationic Liposomes,”, Molecular reproduction and development, vol 365, no January, pp 360–365, 2000 [30] N V T Pham Hoang Anh, Pham Truong Duy, Cao Thuy Khanh, Bui Hong Thuy, “Establishment Of Gfp Mouse Embryos Using Intracytoplasmic Injection Of Preserved Gfp Spermatozoa At -80 Degree C The national confernce on biotechnology of Vietnam, 2019” [31] Y Ishikawa, T Usui, M Yamashita, Y Kanemori, and T Baba, “Surfing and Swimming of Ejaculated Sperm in the Mouse Oviduct1,” Biol Reprod., vol 94, no 4, pp 1–9, 2016 [32] B Ghassemi, M Shamsara, M Soleimani, J Kiani, and M Rassoulzadegan, 52 [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] “Pipeline for the generation of gene knockout mice using dual sgRNA CRISPR/Cas9-mediated gene editing,” Anal Biochem., 2018 M Ikawa, K Kominami, Y Yoshimura, K Tanaka, Y Nishimune, and M Okabe, “Green fluorescent protein as a marker in transgenic mice,” Development, Growth & Differentiation, vol 37, no pp 455–459, 1995 H Jang, “Regulation of Cyclic AMP-Response Element Binding Protein Zhangfei ( CREBZF ) Expression by Estrogen in Mouse Uterus,” vol 22, no 1, pp 95–104, 2018 A K Champlin, D L Dorr, and A H Gates, “Determining the Mouse the Stage by the of the Estrous Cycle in Appearance of the Vagina mice,” Biol Reprod., vol 8, pp 191–194, 1973 S D Ramos, J M Lee, and J D Peuler, “An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle,” pp 667–670, 2001 S Achiraman et al., “Biochemical Analysis of Female Mice Urine with Reference to Endocrine Function : A Key Tool for Estrus Detection Biochemical Analysis of Female Mice Urine with Reference to Endocrine Function : A Key Tool for Estrus Detection,”, Zoological Science, 2011 T Yener, A T Tunc, H Aslan, H Aytan, and A C Caliskan, “Determination of Oestrous Cycle of the Rats by Direct Examination : How Reliable ?,”, Journal compilation, vol 77, pp 75–77, 2007 C Fu, K Begum, and P A Overbeek, “Primary ovarian insufficiency induced by fanconi anemia e mutation in a mouse model,” PLoS One, vol 11, no 3, pp 1–13, 2016 C Caligioni, “NIH Public Access,”, Curr Protoc Neurosci., pp 1–11, 2010 J M Walker, Transgenic mouse metholds and protocols Spinger protocol, 2011 M S Hassanane et al., “First study of sperm mediated gene transfer in Egyptian river buffalo,” J Genet Eng Biotechnol., 2017 M Ikawa, K Kominami, Y Yoshimura, K Tanaka, Y Nishimune, and M Okabe, “A rapid and non-invasive selection of transgenic embryos before implantation using green fluorescent protein (GFP),” FEBS Lett., vol 375, no 1–2, pp 125–128, 1995 M Kato, K Yamanouchi, M Ikawa, M Okabe, K Naito, and H Tojo, “Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as a marker gene,” Mol Reprod Dev., vol 54, no 1, pp 43–48, 1999 A Cho, N Haruyama, and A B Kulkarni, “Generation of transgenic mice,” Curr Protoc Cell Biol., no SUPPL 42, pp 1–22, 2009 T B Hildebrandt et al., “rhinoceros,” Nat Commun., 2018 T Kolbe, R Palme, C Touma, and T Ru, “Repeated Use of Surrogate Mothers for Embryo Transfer in the Mouse Parameters of Reproduction,”, Biology of reproduction, vol 86, no June 2011, pp 1–6, 2012 H Chin and C L Wang, “Utero-Tubal Transfer of Mouse Embryos,”, genesis, vol 81, pp 77–81, 2001 53 [49] E G Lavoie, I Go, D Aranda, and J Se, “Changes in expression and activity levels of ecto- ¢ -nucleotidase / CD73 along the mouse female estrous cycle,”, Acta Physiol, pp 191–197, 2010 [50] C C Paccola, C G Resende, T Stumpp, S M Miraglia, and I Cipriano, “The rat estrous cycle revisited : a quantitative and qualitative analysis,”, Anim Reprod, pp 677–683, 2013 [51] G Manzano Nieves et al., “Early life stress delays sexual maturation in female mice,” Front Mol Neurosci., vol 12, no February, pp 1–12, 2019 [52] M Aly, “Pathological and Hormonal Effects of Aflatoxins on Reproduction of Female Albino Rats,”, Middle East Journal of Applied Sciences, no October, 2015 [53] N Bagheripour, S Zavareh, M T Ghorbanian, S H Paylakhi, and S R Mohebbi, “Changes in the expression of OCT4 in mouse ovary during estrous cycle,”, Veterinary Research Forum, vol 8, no 1, pp 43–48, 2017 [54] C a Pinkert, M H Irwin, L W Johnson, and R J Moffatt, “Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.,” Transgenic Res., vol 6, no 6, pp 379–83, 1997 [55] J Marh et al., “Hyperactive self-inactivating piggyBac for transposaseenhanced pronuclear microinjection transgenesis,” Proc Natl Acad Sci., vol 109, no 47, pp 19184–19189, 2012 [56] S Kawamoto et al., “A novel reporter mouse strain that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated recombination,” FEBS Lett., vol 470, no 3, pp 263–268, 2000 [57] M Pe, E Pericuesta, M A Ramı, and A Gutie, “Effect of Stem Cell Activation , Culture Media of Manipulated Embryos , and Site of Embryo Transfer in the Production of F0 Embryonic Stem Cell Mice 1,”, Biology of reproduction, vol 1222, no February, pp 1216–1222, 2009 54 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Phan Ngọc Uyên Phương Ngày, tháng, năm sinh: 26/03/1991 Nơi sinh: Quảng Trị Địa liên lạc: 2374 Quốc lộ 1, PK2, Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP HCM QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2009 – 2014: học Đại học Tại Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP HCM 2015 - nay: Học Cao học Trường Đại học Bách Khoa TP HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC 2016: Cơng tác Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM ... chuột mẹ mang thai hộ để sinh chuột mang gen Vì nghiên cứu chúng tơi có tiềm lớn việc ứng dụng tạo chuột biến đổi di truyền Trong nghiên cứu này, phương pháp tạo mô hình chuột mẹ mang thai hộ thực... việc chuyển phôi mang gen ngoại lai vào chuột mẹ mang thai hộ Các nghiên cứu liên quan đến tạo phôi chuột chuyển gen nghiên cứu Việt Nam, nhiên để tạo sinh vật chuyển gen, phôi phải chuyển vào chuột. .. đổi gen đáp ứng nhu cầu cho nghiên cứu liên quan đến mơ hình chuột Mục tiêu chung đề tài: Tạo chuột mẹ mang thai hộ nhằm ứng dụng tạo chuột chuyển gen phục vụ nghiên cứu liên quan đến chuột thí