Thực tập môn Kỹ thuật cơ bản trong công nghệ sinh học phần protein: Tinh sạch enzyme catalase có trong dịch chiết của gan bò bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, xác định hàm lượng protein, hoạt tính của enzyme, tính khối lượng phân tử và kiểm tra độ tinh sạch của catalase bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDSPAGE).
CHƯƠNG TRÌNH THỰC TẬP MƠN KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC (Dành cho sinh viên năm thứ 4, ngành CNSH) Mục tiêu: tinh enzyme catalase có dịch chiết gan phương pháp sắc ký trao đổi ion, xác định hàm lượng protein, hoạt tính enzyme, tính khối lượng phân tử kiểm tra độ tinh catalase điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) Chuẩn bị dịch chiết gan Nguyên liệu - Gan: - g - Đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 có 50 mM NaCl (Đệm A) (khoảng 200 ml) Các bước tiến hành Nghiền gan đệm A đến đồng (tỷ lệ đệm nghiền chiết g gan : ml đệm), sử dụng chày cối sứ để sẵn lạnh, bổ sung nitơ lỏng, đệm gan lạnh nhằm đảm bảo hoạt tính enzyme Ly tâm 13.000 vịng/phút, oC 20 phút, thu dịch chiết (ghi lại tổng thể tích), lặp lại bước ly tâm dịch lẫn cặn Tủa protein dịch chiết gan ethanol 70%, trộn đều, để lạnh oC 15 phút, thu tủa ly tâm 4oC 20 phút; hoà tủa ml đệm A (Nếu tủa khơng tan hết bổ sung thêm đệm A đến tối đa 10 ml) Thêm bước ly tâm để loại bỏ tủa chưa tan hết Xác định hàm lượng protein tổng số dịch chiết quang phổ kế đo bước sóng 280 nm (Lưu ý pha protein nồng độ thích hợp để số đọc A280 nằm khoảng 0,1 - 1,0) Xác định hoạt tính catalase quang phổ kế Nguyên tắc: Catalase phân giải H202 theo phương trình: Cho catalase phân giải H 202, H202 hấp thụ cực đại, đặc hiệu bước sóng 240 nm, có hoạt tính catalase cho độ hấp thụ giảm dần bước sóng Một đơn vị hoạt độ catalase định nghĩa lượng enzyme phân giải µmol H202 phút 25oC, với lượng H202 ban đầu 3,05 µmol Các bước tiến hành: tổng thể tích phản ứng 300 µl bao gồm nồng độ cuối thể tích chất sau: - Dùng pipet hút 290 µl H202 0,036% (w/v) pha đệm kaliphosphate 50 mM pH 7,0 - Đặt cuvet vào máy quang phổ đo bước sóng 240 nm đến số đọc ổn định (nồng dộ H202 phù hợp cho xác định hoạt tính catalase có số đọc A 240 nm khoảng 0,52 đến 0,55; ghi lại số đọc) - Bổ sung 10 µl mẫu có hoạt tính catalase đo số đọc máy quang phổ 240 nm hai thời điểm phút phút Nồng độ enzyme phù hợp cho denta (A240 nm phút - A240 nm phút) dao động khoảng 0,05 - Hoạt độ riêng catalase tính theo cơng thức: U/ml enzyme = [denta (A 240 nm phút - A240 nm phút)* độ pha loãng mẫu*3,05] / (A240 nm chất*3*0,01) U/mg = [U/ml enzyme] / [nồng độ protein (mg/ml)] Tinh catalase từ dịch chiết gan sắc ký trao đổi anion Q-sepharose Hoá chất - Dịch chiết từ gan (bước 1) - Gel Q-sepharose ml Các bước tiến hành - Nhồi gel Q sepharose lên cột - Cân cột lần thể tích đệm A, tốc độ 40-60 ml/h - Gắn mẫu lên cột với tốc độ 20-30 ml/h, tải gel 20 mg protein/ml gel - Rửa cột đệm A với tốc độ 30-50ml/h Rửa OD280