Sàng lọc và tuyển chọn probiotic có khả năng kiểm soát vibrio vulnificus nhằm định hướng ứng dụng trong hệ thống ương tôm siêu thâm canh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LƢU THỊ HẠNH SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN PROBIOTIC CĨ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT Vibrio vulnificus NHẰM ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG HỆ THỐNG ƢƠNG TÔM SIÊU THÂM CANH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 60-42-02-01 LUẬN VĂN THẠC SỸ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 03 năm 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LƢU THỊ HẠNH SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN PROBIOTIC CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT Vibrio vulnificus NHẰM ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG HỆ THỐNG ƢƠNG TÔM SIÊU THÂM CANH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 60-42-02-01 LUẬN VĂN THẠC SỸ GVHD: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng TP HỒ CHÍ MINH, tháng 03 năm 2020 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG - HCM TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG Cán chấm nhận xét 1: TS Lê Thị Thủy Tiên Cán chấm nhận xét 2: TS Trần Trung Hiếu Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng: Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 07 tháng 03 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Phản biện 1: TS Lê Thị Thủy Tiên Phản biện 2: TS Trần Trung Hiếu Ủy viên: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng Thƣ ký: Hoàng Anh Hoàng Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Trƣởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LƢU THỊ HẠNH MSHV: 1770500 Ngày, tháng, năm sinh: 07/06/1994 Nơi sinh: Thái Bình Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số : 60.42.02.01 I TÊN ĐỀ TÀI SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN PROBIOTIC CĨ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT Vibrio vulnificus NHẰM ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG HỆ THỐNG ƢƠNG TÔM SIÊU THÂM CANH II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Sàng lọc tuyển chọn chủng probiotic đối kháng Vibrio vulnificus gây bệnh tôm Khảo sát khả đối kháng chủng probiotic tuyển chọn V vulnificus mơ hình ni cấy đồng thời in vitro mơ hình ƣơng tơm in vivo III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2019 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2019 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG Tp HCM, ngày 01 tháng 01 năm 2020 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô môn Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh cho tơi kiến thức chuyên sâu, bổ ích suốt thời gian tham gia chƣơng trình Cao học trƣờng Những kiến thức kết hợp với đƣờng nghề nghiệp mà chọn sau tốt nghiệp Đại học tới sở để thực đề tài “Sàng lọc tuyển chọn probiotic có khả kiểm soát Vibrio vulnificus nhằm định hƣớng ứng dụng hệ thống ƣơng tôm siêu thâm canh” Đặc biệt, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng đóng góp quan trọng việc định hƣớng mục tiêu Luận văn Thạc sỹ Trong trình thực đề tài, lúc gặp khó khăn tƣởng chừng nhƣ muốn bỏ Cô ngƣời đồng hành em, động viên em để vƣợt qua khó khăn Một lần em xin đƣợc cảm ơn Cô Con xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Bố, Mẹ Dù xa nhƣng Bố, Mẹ động viên hỗ trợ cách Bố, Mẹ ln cho lời khun bổ ích ln ủng hộ định Xin đƣợc cảm ơn Chị gái Em gái ngƣời động viên mặt tinh thần lúc khó khăn Tơi xin cảm ơn sâu sắc đến Anh Nguyễn Tấn Đức Anh Chị Tổ Môi trƣờng - Trung tâm Cơng nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ tạo không gian môi trƣờng làm việc thân thiện thời gian thực phần đề tài Tổ Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn ngƣời bạn, ngƣời anh, ngƣời chị đồng nghiệp bên cạnh động viên, chia sẻ với suốt thời gian thực đề tài Kiến thức tơi chƣa đƣợc hồn thiện, cịn nhiều thiếu sót q trình thực nhƣ viết Luận văn Thạc sỹ Rất mong q Thầy, Cơ thơng cảm cho góp ý để đề tài đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 01 năm 2020 TÓM TẮT Vibrio vulnificus tác nhân gây bệnh tơm hội chứng phân trắng dịch bệnh chƣa có phƣơng pháp nhƣ chế phẩm điều trị hiệu Do việc nghiên cứu tìm chủng probiotic có khả đối kháng V vulnificus an toàn điều cần thiết Trong nghiên cứu này, chủng Lactobacillus pentosus đƣợc phân lập từ mẫu bùn ao nuôi tôm cho kết đối kháng V vulnificus tốt với đƣờng kính kháng đạt 20,33 ± 0,68 mm sinh khối 12,00 ± 0,20 mm dịch sau lọc Thành phần kháng khuẩn dịch sau lọc đƣợc xác định acid lactic với hàm lƣợng 12,1 mg/ml Kết khảo sát mơ hình ni cấy đồng thời in vitro xác định đƣợc khả ức chế hoàn toàn V vulnificus 105 CFU/ml L pentosus mật độ 107 CFU/ml Khảo sát mơ hình ƣơng tơm in vivo cho kết quả: tỷ lệ sống tôm đạt 90%; tổng trọng lƣợng thu hoạch đạt 24,67 ± 0,58 g nghiệm thức đƣợc bổ sung L pentosus xuyên suốt trình khảo sát 10,67 ± 1,15 g nghiệm thức đối chứng; đƣờng ruột tôm mật độ vi sinh tổng số 5,05 ± 0,05 log CFU/ml so với nghiệm thức đối chứng 5,51 ± 0,03 log CFU/ml; mật độ Vibrio sp mức 3,08 ± 0,01 log CFU/ml so với 4,47 ± 0,01 log CFU/ml nghiệm thức đối chứng; mật độ vi khuẩn lactic 4,96 ± 0,02 log CFU/ml nghiệm thức đối chứng mức 2,43 ± 0,01 log CFU/ml Kết đề tài sở để nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic ứng dụng ni thủy sản phù hợp với tình hình ABSTRACT Vibrio vulnificus causes some diseases on shrimp included White Feces Syndrome (WFS) that have not been completely treated until now in Vietnam Screening and selecting probiotic bacteria for the control V vulnificus is essentail In this study, probiotic bacteria, isolated from sludge of shirmp pond, is Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus totally inhibit V vulnificus 105 CFU/ml at 107 CFU/ml in in vitro condition The inhibiting diameter of L pentosus in biomass and post-filtering suspension are 20.33 ± 0.68 mm and 12.00 ± 0.20 mm, respectively The lactic acid is major component of bacterial inhibiting post-filtering suspension with 12.1 mg/ml concentration The inhibiting ability of L pentosus is presented more transparenter through in vivo super-intensive system: the survival rate of shrimp (Litopenaeus vannamei) was finally over 90 percent in all treatments; the total weight gain of continuously L pentosus - suplemented group 24.67 ± 0.58 g was higher (P< 0.05) than control group 10.67 ± 1.15 g; the total bacteria count in the digestive tract of L pentosus - suplemented group 5.05 ± 0.05 log CFU/ml was compared to control group 5.51 ± 0.03 log CFU/ml; Vibrio sp count in the digestive tract of L pentosus suplemented group 3.08 ± 0.01 log CFU/ml were lower (P< 0.05) than control group 4.47 ± 0.01 log CFU/ml after days of challenging V vulnificus; the lactic bacteria in continuously L pentosus - suplemented group and control group were 4.96 ± 0.02 log CFU/ml and 2.43 ± 0.01 log CFU/ml, respectively In brief, L pentosus is potential probiotic bacteria that should be studied more in probiotic production for aquaculture LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Học viên Lƣu Thị Hạnh MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH i DANH MỤC BẢNG i DANH MỤC SƠ ĐỒ ii DANH MỤC ĐỒ THỊ ii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vibrio vulnificus hội chứng phân trắng tôm 1.1.1 Vibrio vulnificus 1.1.1.1 Phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa .5 1.1.1.3 Độc tố chế gây bệnh 1.1.2 Hội chứng phân trắng tôm .7 1.2 Probiotic nuôi trồng thủy sản 1.2.1 Vi khuẩn lactic 10 1.2.1.1 Khái niệm 10 1.2.1.2 Phân loại 11 1.2.2 Các hợp chất kháng khuẩn 16 1.2.2.1 Hydrogen peroxide 16 1.2.2.2 Bacteriocin 17 1.2.2.3 Diacetyl 18 1.2.2.4 Reuterin 18 1.2.2.5 Acid lactic .18 1.2.3 Một số sản phẩm probiotic nuôi trồng thủy sản thị trƣờng .19 1.3 Mơ hình ƣơng tơm siêu thâm canh 19 1.3.1 Mơ hình biofloc 20 1.3.2 Mơ hình raceway 21 1.4 Các nghiên cứu nƣớc liên quan đến đề tài 22 1.4.1 Nghiên cứu nƣớc 22 1.4.2 Nghiên cứu nƣớc .23 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .27 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 27 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 29 2.2.2.1 Hoạt hóa, tăng sinh kiểm tra số đặc điểm sinh hóa V vulnificus 29 2.2.2.2 Đa dạng sƣu tập probiotic 29 2.2.2.3 Sàng lọc, tuyển chọn chủng probiotic đối kháng với V vulnificus định danh chủng probiotic tiềm 31 2.2.2.4 Khảo sát yếu tố kháng V vulnificus chủng probiotic tiềm .33 2.2.2.5 Khảo sát khả kháng V vulnificus chủng probiotic tiềm mơ hình ni cấy đồng thời in vitro mơ hình bể ƣơng tơm in vivo 35 2.3 Phƣơng pháp phân tích 40 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu .42 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43 3.1 Các thí nghiệm tiền đề 43 3.1.1 Hoạt hóa, tăng sinh kiểm tra số đặc điểm sinh hóa Vibrio vulnificus .43 3.1.2 Đa dạng sƣu tập probiotic 45 3.1.2.1 Phân lập probiotic 45 3.1.2.2 Hoạt hóa, tăng sinh chủng vi khuẩn lactic từ nguồn có sẵn .45 3.2 Sàng lọc, tuyển chọn chủng probiotic đối kháng V vulnificus định danh chủng probiotic tiềm .46 3.2.1 Sàng lọc, tuyển chọn chủng probiotic đối kháng với V vulnificus .46 3.2.2 Định danh chủng probiotic tiềm 48 3.3 Khảo sát yếu tố kháng V vulnificus chủng tiềm L pentosus 49 3.4 Khảo sát khả kháng V vulnificus chủng tiềm L pentosus mô hình ni cấy đồng thời in vitro mơ hình bể ƣơng tôm in vivo 52 3.4.1 Mơ hình ni cấy đồng thời in vitro 52 3.4.2 Mơ hình ƣơng tơm in vivo 54 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1 Kết luận 61 4.1 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .62 PHỤ LỤC 72 [66] C Ouwehand, S Vesterlund, “Antimicrobial Components from Lactic Acid Bacteria,” in Acid lactic bacteria, 2004, pp 375–397 [67] J L Parada et al, “Bacteriocins from lactic acid bacteria: Purification, properties and use as biopreservatives,” Brazilian Arch Biol Technol., vol 50, No 3, pp 521–542, 2007 [68] M B Hanlin et al, “Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria in Combination Have Greater Antibacterial Activity,” Journal of Food Protection, vol 56, No 3, pp 252–255, 1993 [69] T R Klaenhammer, “Bacteriocins of lactic acid bacteria,” Biochimie, vol 70, No 11171, pp 337–349, 1988 [70] K A Stevens et al, “Nisin Treatment for Inactivation of Salmonella Species and Other Gram-Negative Bacteriat,” Applied And Environmental Microbiology, vol 57, No 12, pp 3613–3615, 1991 [71] B S M Mahmoud, “Controlling Vibrio vulnificus and spoilage bacteria in fresh shucked oysters using natural antimicrobials,” Soc Appl Microbiol., vol 58, No August, pp 1–7, 2013 [72] V Domrongpokkaphan and P Wanchaitanawong, “In vitro antimicrobial activity of Bacillus spp Against pathogenic Vibrio spp in black tiger shrimp (Penaeus monodon),” Kasetsart J - Nat Sci., vol 40, No 4, pp 949–957, 2006 [73] M Y Ina-Salwany et al, “Elucidating the probiotic potential of Malaysian Paenibacillus pabuli against Vibrio alginolyticus in Artemia culture,” Asian J Agric Res., vol 9, No 5, pp 223–236, 2015 [74] A Javadi et al, “Effect of dietary probiotic on survival and growth of Penaeus indicus cultured shrimps,” J Anim Vet Adv., vol 10, No 17, pp 2271–2274, 2011 [75] K Kongnum and T Hongpattarakere, “Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white 69 shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi,” Fish Shellfish Immunol., vol 32, No 1, pp 170–177, 2012 [76] M Bachruddin et al, “Effect of probiotic culture water on growth, mortality, and feed conversion ratio of Vaname shrimp (Litopenaeus vannamei, Boone),” IOP Conf Ser Earth Environ Sci., vol 137, No 1, pp 1-8, 2018 [77] N Sivakumar et al, “Probiotic effect of Lactobacillus acidophilus against vibriosis in juvenile shrimp (Penaeus monodon),” African Journal of Biotechnology, vol 11, No 91, pp 15811–15818, 2012 70 PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh thức ăn HI-AQUA cho tôm thẻ công ty TNHH Uni-President Việt Nam 72 Phụ lục Đặc điểm đại thể, vi thể chủng probiotic phân lập STT Ký hiệu chủng vi khuẩn probiotic L1.1 L1.2 B1.3 Nguồn Đại thể Vi thể Ba Tri – Bến Tre B1.4 B1.5 B1.6 73 B2.1 L2.2 L2.3 10 L2.4 11 L2.5 12 L2.6 13 B2.7 74 14 L2.8 15 L2.9 16 B3.1 17 L3.2 18 B3.3 19 L3.4 20 L3.5 75 21 L3.6 22 L3.7 23 L4.1 24 L4.2 25 L4.3 Châu Thành – Long An 26 L4.4 27 L4.5 76 28 B4.6 29 L5.1 Phụ lục Đặc điểm đại thể, vi thể chủng probiotic từ nguồn có sẵn STT Ký hiệu chủng vi khuẩn probiotic P1.1 P1.2 Nguồn Đại thể Vi thể Bộ môn CNSHĐH Bách Khoa P2.1 P2.2 77 P2.3 P2.4 P2.5 P2.6 P2.7 78 Phụ lục Kết định danh chủng P2.2 phƣơng pháp giải trình tự 16S rRNA 79 80 81 Phụ lục Kết định lƣợng acid lactic dịch sau lọc chủng L pentosus phƣơng pháp sắc ký HPLC 82 Phụ lục Mật độ V vulnificus nghiệm thức đồng nuôi cấy với L pentosus Mật độ V vulnificus nghiệm thức (log CFU/ml) Thời điểm khảo sát NT [P4V5] NT [P5V5] NT [P6V5] NT [P7V5] NT [V5] 5,11 ± 0,00bA 5,11 ± 0,00cA 5,11 ± 0,00aA 5,11 ± 0,00aA 5,11 ± 0,00aA 5,06 ± 0,02aC 4,38 ± 0,03bB 4,93 ± 0,01bC 0,00 ± 0,00bA 7,20 ± 0,33cD 24 5,16 ± 0,01cC 3,51 ± 0,46aB 3,36 ± 0,00dB 0,00 ± 0,00bA 6,87 ± 0,30cD (giờ) (Các chữ a, b, c, d đằng sau số liệu thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê kết theo hàng dọc; A, B, C, D, E thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê kết theo hàng ngang) Phụ lục Kết kiểm tra tiêu hai nghiệm thức giai đoạn phịng bệnh trị bệnh mơ hình ƣơng tơm in vivo GĐ PHỊNG BỆNH GĐ TRỊ BỆNH Tỷ lệ sống (%) 96,67 ± 0,44aA 94,17 ± 0,44aA aA 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00aA Tổng trọng lƣợng thu hoạch (g) 13,50 ± 0,50aB 10,67 ± 1,15aA 21,33 ± 1,53bA 24,67 ± 0,58bB Trọng lƣợng thu hoạch trung bình (g) 0,35 ± 0,01aA 0,28 ± 0,04aA 0,53 ± 0,04bA 0,62 ± 0,01bA Tốc độ tăng trƣởng tuyệt đối (g) 0,03 ± 0,00aB -0,02 ± 0,00aA 0,05 ± 0,00bA 0,03 ± 0,00bA Hệ số chuyển đổi thức ăn – FCR 1,48 ± 0,06bA 1,85 ± 0,19aB 0,94 ± 0,07aB 0,79 ± 0,02aA Vi sinh tổng số (log CFU/ml) 4,38 ± 0,07aA 5,51 ± 0,03aB 4,95 ± 0,02bA 5,05 ± 0,05bA Vibrio sp (log CFU/ml) 3,12 ± 0,03bA 4,47 ± 0,01bB 2,83 ± 0,03aA 3,08 ± 0,01aA Vi khuẩn lactic (log CFU/ml) 3,67 ± 0,01aB 2,43 ± 0,01aA 4,88 ± 0,06bA 4,96 ± 0,02bA NGHIỆM THỨC NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 NT1 - ĐC NT2 - P7 83 (Các chữ a, b đằng sau số liệu thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê kết theo hàng dọc; A, B thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê kết theo hàng ngang) Phụ lục Hình ảnh sợi phân trắng xuất bề mặt bể nghiệm thức ĐC 84 ... Cơng nghệ sinh học Mã số : 60.42.02.01 I TÊN ĐỀ TÀI SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN PROBIOTIC CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT Vibrio vulnificus NHẰM ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG HỆ THỐNG ƢƠNG TÔM SIÊU THÂM CANH II... KHOA LƢU THỊ HẠNH SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN PROBIOTIC CĨ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT Vibrio vulnificus NHẰM ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG HỆ THỐNG ƢƠNG TÔM SIÊU THÂM CANH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số... hệ thống ƣơng tôm siêu thâm canh? ?? đƣợc thực Mục tiêu nghiên cứu Sàng lọc tuyển chọn chủng probiotic có khả kiểm soát V vulnificus định hƣớng ứng dụng hệ thống ƣơng tôm siêu thâm canh Nội dung