Luận văn thạc sĩ tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ HIỀN TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VƠI VÀ KHAI THÁC KHỐNG SẢN TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái nguyên 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ HIỀN TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VÔI VÀ KHAI THÁC KHỐNG SẢN TẠI THÁI NGUN Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Nguyễn Xuân Vũ 2.TS Nguyễn Mạnh Tuấn Thái Nguyên 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ quy tắc Kết trình bày luận văn thu thập trình nghiên cứu trung thực, chưa công bố trước Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả Đỗ Thị Hiền ii LỜI CẢM ƠN Luận văn thực môn Công nghệ Vi sinh, Viện khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông lâm- Đại học Thái Nguyên Để hoàn thành luận văn em nhận động viên, giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân tập thể Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Xuân Vũ TS Nguyễn Mạnh Tuấn, người thầy trực tiếp hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài, giúp em vượt qua khó khăn hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Bích Duệ cán môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học Sự sống cán nghiên cứu viện tạo điều kiện cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, cán Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên giúp đỡ, trang bị kiến thức tạo điều kiện cho em trình học tập Cuối em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ động viên tạo điều kiện cho em suốt trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh KTCC : Khuẩn ti chất KTKS : Khuẩn ty khí sinh MT : Mơi trường DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) MRSA : Staphylococcus aureus kháng methicillin iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn 25 Bảng 3.2 Đặc điểm nuôi cấy chủng P5-1 loại môi trường nuôi cấy 28oC sau 21 ngày .29 Bảng 3.3 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 31 Bảng 3.4 Khả sinh trưởng xạ khuẩn nồng độ muối khác .33 Bảng 3.5 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn P5-1 điều kiện nhiệt độ khác 33 Bảng 3.6 Khả sinh trưởng xạ khuẩn điều kiện pH khác 34 Bảng 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 mơi trường lên men khác 35 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 theo thời gian lên men .37 Bảng 3.9 Kết kiểm tra giá trị MIC 38 Bảng 3.10 Kết Search Blast trình tự tương đồng gen 16S- rRNA chủng P5-1 GenBank .41 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 3.1 Số lượng chủng xạ khuẩn phân lập ức chế sinh trưởng chủng vi khuẩn kiểm định 27 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập sử dụng phương pháp cấy chấm điểm 28 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng P5-1 môi trường 30 Hình 3.4 Xạ khuẩn sinh trưởng môi trường bổ sung nguồn cacbon 32 Hình 3.5 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn P5-1 điều kiện nhiệt độ khác 34 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 môi trường lên men khác 36 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 môi trường Gause I theo thời gian lên men 37 Hình 3.8 Kháng sinh thơ thu từ dịch lên men chủng P5-1 38 Hình 3.9 Kết MIC chủng P5-1 với chủng vi khuẩn kiểm định 39 Hình 3.10 Kết điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn P5-1 gel agarose 1% 40 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S- rRNA chủng P5-1 gel agarose 1% 40 Hình 3.12 Cây phân loại chủng P5-1 số chủng xạ khuẩn 42 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Giới thiệu xạ khuẩn 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 1.2.2 Phân loại theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.2.3 Phân loại xạ khuẩn phương pháp phân tích tự gene 16S-rRNA 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn 1.3.1 Khái niệm chất kháng sinh 1.3.2 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 10 1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh giới 13 1.4.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh nước 14 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 vii 2.3 Vật liệu 16 2.3.1 Nguồn xạ khuẩn 16 2.3.2 Vi sinh vật kiểm định 16 2.3.3 Môi trường phân lập nuôi cấy 17 2.3.4 Hóa chất thiết bị 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phân lập nuôi cấy xạ khuẩn 18 2.4.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 19 2.4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 19 2.4.4 Lựa chọn môi trường lên men tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu 20 2.4.5 Phương pháp lên men, tách kháng sinh thô cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu 21 2.4.6 Phương pháp xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sinh trưởng vi khuẩn kiểm định (MIC90) 21 2.4.7 Phương pháp định danh phân loại chủng loại 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ mẫu đất 25 3.2 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn P5-1 28 3.2.1 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn P5-1 28 3.2.2 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh lí - sinh hóa 31 3.3 Kết nghiên cứu lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng P5-1 35 3.3.1 Kết lựa chọn môi trường lên men thích hợp 35 3.3.2 Kết xác định thời gian lên men tối ưu 36 3.4 Kết đánh giá nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế 90% vi khuẩn kiểm định (MIC90) 38 3.5 Kết phân loại chủng xạ khuẩn P5-1 phương pháp sinh học phân tử 39 3.5.1 Kết tách DNA tổng số 39 3.5.2 Kết nhân gene mã hóa 16S-rRNA phản ứng PCR 40 viii 3.5.3 Kết giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 KẾT LUẬN 43 ĐỀ NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 37 khuẩn kiểm định nồng độ ~104 CFU/ml (Bacillus anthracs KEMB 211-146 Bacillus subtilis ATCC 6051A) Kết thể Bảng 3.8 Hình 3.7 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 theo thời gian lên men Hoạt tính kháng khuẩn (D-d, mm) theo thời gian lên men Chủng vi khuẩn (ngày) kiểm định Bacillus anthracs KEMB 211-146 Bacillus subtilis ATCC 6051A 10 10 11 11 12 16 14 13 13 10 12 13 13 15 17 16 14 14 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 mơi trường Gause I theo thời gian lên men (A: Bacillus anthracs KEMB 211-146, B: Bacillus subtilis ATCC 6051A; I-1: Hoạt tính kháng sinh sinh chủng P5-1 theo thời gian lên men; I-2: Hoạt tính kháng khuẩn từ dịch lên men (50 µl/mỗi khoanh giấy) chủng P5-1) Kết thí nghiệm cho thấy hoạt tính kháng sinh sinh tổng hợp tăng dần từ đến ngày lên men có xu hướng giảm sau ngày Như vậy, hoạt chất kháng sinh chủng xạ khuẩn P5-1 sử dụng môi trường Gause I đạt cực đại ngày lên men 38 3.4 Kết đánh giá nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế 90% vi khuẩn kiểm định (MIC90) Xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng thể rõ rệt Các CKS có nguồn gốc từ xạ khuẩn có phổ kháng rộng, kìm hãm ức chế nhiều loại VSV khác Xạ khuẩn thường tạo sản phẩm trao đổi chất để ức chế tạo điều kiện không thuận lợi cho sinh trưởng VSV khác Tiến hành đánh giá nồng độ kháng sinh tối thiểu từ chủng xạ khuẩn P5-1, từ 1L dịch lên men sau đem cô quay chân không thu 2,15g kháng sinh thơ, có màu vàng- chanh ( Hình 3.8) Hình 3.8 Kháng sinh thơ thu từ dịch lên men chủng P5-1 Từ kháng sinh thô thu chuẩn bị dung dịch kháng sinh gốc tiến hành thử MIC mức nồng độ khác Kết thu Bảng 3.9 Hình 3.9 Bảng 3.9 Kết kiểm tra giá trị MIC Vi khuẩn kiểm định Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Giá trị MIC90 (µg/ml) Kháng sinh thơ tách chiết từ Erythromycin dịch lên men chủng P5-1 64 Staphylococcus aureus ATCC 6538P Bacillus subtilis ATCC 6051 0,5 Bacillus anthracis KEMB 211-146 0,5 MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sinh trưởng vi khuẩn kiểm định) 39 (A Staphylococcus epidermidis ATCC 14990; B Bacillus anthracis KEMB 211-146; C: Staphylococcus aureus ATCC 6538P; D Bacillus subtilis ATCC 6051 ) Hình 3.9 Kết MIC chủng P5-1 với chủng vi khuẩn kiểm định Từ kết cho thấy chủng P5-1 có khả ức chế mạnh chủng vi khuẩn kiểm định Trong chủng P5-1 có khả ức chế mạnh với vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6051 với giá trị MIC nhỏ MIC = µg/ml chủng Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 với nồng độ MIC = µg/ml Ngồi ra, chủng P5-1 có khả ức chế mạnh với chủng kiểm định Bacillus anthracis KEMB 211-146 mức MIC = µg/ml ức chế yếu với chủng Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 với nồng độ MIC = 64 µg/ml Như hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 thể mạnh với Bacillus subtilis ATCC 6051, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 có hoạt tính kháng khuẩn yếu với chủng Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 3.5 Kết phân loại chủng xạ khuẩn P5-1 phương pháp sinh học phân tử 3.5.1 Kết tách DNA tổng số Chủng xạ khuẩn P5-1 nuôi môi trường Gause I (lỏng), nhiệt độ 28 0C, sau 48h thu sinh khối Kết tách chiết kiểm tra điện di gel agarose 1% thể hình 3.10 40 Hình 3.10 Kết điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn P5-1 gel agarose 1% DNA tổng số chủng xạ khuẩn P5-1 tách sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết điện di cho thấy đoạn DNA tổng số điện di xuất băng đơn, có kích thước rõ nét Vì DNA thu qua trình tách chiết đạt yêu cầu để tiếp tục cho nghiên cứu 3.5.2 Kết nhân gene mã hóa 16S-rRNA phản ứng PCR Để phân loại định tên xác chủng xạ khuẩn, tiến hành nhân gene mã hóa 16S-rRNA để làm sở phân tích trình tự Đây gene thị dùng phổ biến phân loại VSV Cặp mồi sử dụng để nhân gene là: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1492R (5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) Kết thể hình 3.11 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S- rRNA chủng P5-1 gel agarose 1% 41 (Băng M: thang ADN chuẩn (kb); P5-1: Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S- rRNA.) Từ kết điện di cho thấy sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao Dựa vào thang ADN chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước gần 1,5kb tương ứng với kích thước chọn cặp mồi đặc hiệu Do xác định DNA nhân lên gen mã hóa 16S-rRNA chủng P5-1 Kết sở để tiến hành tách dịng giải trình tự phân loại chủng xạ khuẩn 3.5.3 Kết giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA Sau thực phản ứng PCR với gene mã hóa 16S-rRNA, tiến hành tinh sản phẩm PCR kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen) Kết trình tự gene 16S- rRNA chủng P5-1, giải đoạn gene Trình tự gene sử dụng để Search blast GenBank để xác định trình tự tương đồng, kết thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết Search Blast trình tự tương đồng gen 16S- rRNA chủng P5-1 GenBank Từ kết Search Blast GenBank cho thấy chủng P5-1 có trình tự 16SrRNA tương đồng cao với lồi Streptomyces sp HMU39 với tỉ lệ 99,86% Dựa vào phần nềm Mega xây dựng phân loại chủng P5-1, kết thể hình 3.12 Qua cho thấy chủng P5-1 nằm nhóm với chủng Streptomyces sp HMU39 42 Hình 3.12 Cây phân loại chủng P5-1 số chủng xạ khuẩn Như kết hợp kết phân tích tình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng P5-1 với kết thu nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng này, cho thấy chủng P5-1 thuộc chi Streptomyces sp đặt tên chủng Streptomyces sp P5-1 Đăng ký trình tự gen 16S- rRNA chủng P5-1 ngân hàng gen với mã số MK652886 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Với 39 mẫu đất thu thập, sử dụng đồng thời hai môi trường NA ISP-4 phân lập 48 chủng xạ khuẩn có khả sinh kháng sinh tổng số 379 chủng lựa chọn (chiếm 12,66%); tìm 4/48 (8,33%) chủng xạ khuẩn phân lập ức chế sinh trưởng chủng vi khuẩn kiểm định, chủng P5-1 thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh Chủng P5-1 có khả sinh trưởng tốt môi trường Gause I, Gause II, ISP-1 ISP-6 Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn P5-1 môi trường Gause I 28oC sau ngày nuôi cấy có hình trịn lồi, màu xám, mép hình cưa; khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành vòng tròn đồng tâm bao bên ngồi; khuẩn ty chất có màu nâu xám Chủng P5-1 sinh trưởng tốt môi trường có D-glucose, succarose, mannitol, lactose; phát sinh trưởng pH 4-9 (pH thích hợp 7), 14-40oC (nhiệt độ thích hợp 30oC) nồng độ NaCl 0-4% (nồng độ thích hợp 0-1%) Gause I môi trường tối ưu cho chủng P5-1 sinh tổng hợp hoạt chất kháng sinh ngày lên men Kháng sinh tách chiết từ chủng P5-1 có khả ức chế sinh trưởng chủng vi khuẩn kiểm định, cụ thể ức chế sinh trưởng chủng Bacillus subtilis ATCC 6051 1µg/ml, Bacillus anthracis KEMB 211-146 (4µg/ml), Staphylococcus aureus ATCC 6538 (2µg/ml) Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 (64 µg/ml) Từ kết nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tích trình tự gen 16SrRNA phân loại chủng P5-1 thuộc chi Streptomyces đặt tên Streptomyces sp P5-1 Mã số truy nhập gen 16S rRNA GenBank MK652886 ĐỀ NGHỊ Cần tiền hành xác định loại kháng sinh sinh từ chủng Streptomyces sp P5-1 đánh giá thử nghiệm hiệu kháng sinh vật nuôi 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học cơng nghiệp, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hồng, Trịnh Đình KháVi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, Vũ Thị Lan (2007), Nghiên cứu phân bố xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc NCCB khoa học sống Tr.433-437 Nguyễn Lân Dũng (1983) Thực tập Vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng, Biên dịch), Hà Nội: NXB ĐH&THCN (Quyển sách gốc xuất năm 1976) Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội, Trang 101-109 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977) Vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 10 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ không xuất bản) Trường đại học Thái Nguyên, Việt Nam 45 11 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 3-48 12 Đỗ Thu Hà (2002), Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam, Tạp chí sinh học 24(1):59-63 13 Nguyễn Đình Hải (2012), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12- Streptomyces toxytricini có tiềm ứng dụng xử lý bệnh bạc lúa thân thiện với môi trường, Luận văn ThS ngành công nghệ Nano sinh học, Trường Đại học Công nghệ, Hà Nội 14 Lê Thị Hiền, Đinh Văn Lợi, Vũ Thị Vân, Nguyễn Văn Giang (2014), Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm bệnh cây, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 5: 656-884 15 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 16 Phan Quốc Kinh (2004), Cơng nghiệp hóa chất, thơng tin kinh tế & Công nghệ, số 17 Dương Minh Lam, Đặng Ngọc Quang, Nguyễn Thị Hà (2013), Tách chiết, tinh nghiên cứu đặc điểm kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces sp QN63 chống Staphylococus aureus nhờn kháng sinh, tạp chí Khoa học Cơng nghệ 51(5) 555-563 18 Biền Văn Minh (2002), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ, Nhà xuất Đại học Sư phạm Hà Nội 19 Lê Thị Thanh Xuân, Tăng Thị Chính (2007), Ảnh hưởng điều kiện lên men lên khả sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 Streptomyces hygroscopicus HD 58, Tạp chí Sinh học 29(1): 89-94 46 TIẾNG ANH 20 Alanis AJ (2005) Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Arch Med Res ;36:697–705 21 Bungonsiri Intra, Isada Mungsuntisuk, Takuya Nihira, Yasuhiro Igarashi, ( 2011): Watanalai Panbangred, Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease 22 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F (2008) Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp 301- 305 23 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard—9th edition, CLSI document M07-A9 (ISBN 1-56238-783-9), vol 32 Pennsylvania 24 Cornick M M., McGuire J M L.(1962) Vancomycin and method for its preparation US Patent 622264 25 Crawford DL, Lynch JM, Whipps JM, Ousley MA (1993), “Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen”, Applied and Environmental Microbiology, 59(3), pp 899-905 26 Das, S., Lyla, P S., Khan, S A (2008), “Distribution and generic composition of culturable marine actinomycetes from the sediments of Indian continental slope of Bay of Bengal”, Chinese Journal Oceanology Limnology, 26, pp 166177 27 de Lima PRE, da Silvaa IR, Martinsa MK (2012) Antibiotics produced by Streptomyces Braz J Infect Dis;16:466–71 28 Doern GV, Pfaller MA, Erwin ME (1997) The prevalence of fluoroquinolone resistance among clinically significant respiratory tract isolates of Streptococcus pneumoniae in the United States and Canada- results from the SENTRY Antimicrobial Dis 1998;32:313–6 Surveillance Program Diagn Microbiol Infec 47 29 Enright MC (2003) The evolution of a resistant pathogen-the case of MRSA Curr Opin Pharmacol.;3:474–9 30 George P R (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712 31 Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L (2004) Nocardiopsis alkaliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbiol, 54, pp 247-252 32 Kamal Rai, Sujan Khadka, Bidya Shrestha (2018) Actinomycetes: Isolation, Characterization and Screening for Antimicrobial Activity from Different Sites of Chitwan, Nepal International Journal of Microbiology and Biotechnology Vol 3, No 1, 2018, pp 25-30 doi: 10.11648/j.ijmb.20180301.14 33 Kekuda P, Shobha KS, Onkarappa R (2010) Fascinating diversity and potent biological activities of actinomycete metabolites Pharm Res;3:250–6 34 Keswanit J and Whitman W.B (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678 35 Krishnaraj M., Mathivanan N (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 36 Kuster, E (1959) Outline of a comparative study of criteria used in characterization of the actinomycetes Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon 9, 97– 104 37 Pridham, T G & Lyons, A J Jr (1961) Streptomyces albus (RossiDoria) Waksman et Henrici: taxonomic study of strains labeled Streptomyces albus J Bacteriol 81, 431–441 38 Shirling E.B., Gottlieb D (1966) International of systematic bacteriology: Method for characterization of Streptomyces species Derpartment of Botany and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois 48 39 Song J.H (2004), “Surveillance of antimicrobial resistance – Strategic plan in Asia” WPCID 40 Stanley T Williams M E Sharpe, J G Holt (1989) Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology, Williams & Wilkins, 4: 2452-2492 41 Trerner, H.D, Buckus E.J (1963), "System of color wheels for Streptomyces taxonomy" Appl Microbiol, 11, 335-338 42 Waskman, S.A., (1961) The actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The William & Wilkins Co., Baltimore, USA 43 WHO Global strategy for containment of antimicrobial resistance Geneva: WHO;CDS/CSR/DRS/2001(https://www.google.com/search?q=gg+d%E1%BB %8Bch&oq=gg&aqs=chrome.2.69i57j0j69i59l2j0l2.4617j0j7&sourceid=chrom e&ie=UTF-8) PHỤ LỤC Trình tự đoạn gen 16S chủng P5-1: TCCGTCACGCGCGCTCTGGCCGTGTGCTTCACACACGCGTGTAGCGAGGTGAAGCCTT TCGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCT GGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGAC GGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGG GTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA ATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTA AACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATT GGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAAC CCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCT GGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCT CTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTC GGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAC GCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTG CCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCG GGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGA CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACA ATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATT GGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTG CTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCCGTCACGTCACGAAAGTCG GTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGA CTGGCGATGGACAGTAAAAACGGGGGGGAAGAAAAGAGAAGA Một số hình ảnh trình thực đề tài: B A P5-1 P5-17 K02-7 K05-26 P5-17 P5-1 K02-7 N5 K05-26 N5 D C P5-1 P5-17 K02-7 P5-1 K02-7 K05-26 N5 K05-26 P5-17 Lựa chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế VSV kiểm định Chủng xạ khuẩn P5-1 Ly tâm dịch xạ khuẩn P5-1 Hỗn hợp dung môi etyl acetate- dịch xạ khuẩn Máy cô quay chân không dịch xạ khuẩn Chiết dịch xạ khuẩn Kháng sinh thơ chủng P5-1 Hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn ... cứu Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương phân lập từ mẫu đất số vùng tỉnh Thái Nguyên Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Phát chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn. .. nghiên cứu * Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương * Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh, có nhiều... THỊ HIỀN TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VƠI VÀ KHAI THÁC KHỐNG SẢN TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: