Nghiên cứu khả năng phân hủy microcystin của vi khuẩn nước sphingomonas

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Thị Huệ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƯỚC Sphingomonas LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hà Nội – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Thị Huệ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƯỚC Sphingomonas Chuyên ngành : KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Nguyễn Thị Hoài Hà Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, đã nhận sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và góp ý nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân Qua đây, xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường - Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy trùn đạt cho tơi kiến thức q báu, bổ ích và giúp đỡ tơi suốt khóa học vừa qua tạo điều kiện cho tơi hồn thành ḷn văn tốt nghiệp Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hoài Hà - Phòng Sinh học Tảo - Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành nhiều thời gian tâm hút hướng dẫn giúp tơi hồn thành ḷn văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đặng Minh Hằng - Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường - Đại học Bách Khoa Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện để thực hồn thành ḷn văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn Th.S Phạm Thị Bích Đào cán bợ Phòng sinh học Tảo, nhóm tác giả đề tài mã số: 01C-09/01-2012-2 và các cán bộ Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nợi đã tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình làm ḷn văn vừa qua Nhân đây, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè cùng các anh, chị, em đã động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập, đã nhiệt tình đóng góp ý kiến để luận văn của thêm hoàn thiện Mặc dù tơi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện ḷn văn tất cả sự nhiệt tình và lực của mình, nhiên không thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn Hà Nội, tháng 03 năm 2014 Học viên Lê Thị Huệ Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH i Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tảo lam Microcystis 1.2 Độc tố mcirocystin (MC) 1.2.1 Đặc điểm, cấu trúc của microcystin 1.2.2 Đợc tính của microcystin .11 1.2.2.1 Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên các loài động vật thủy sinh 13 1.2.2.2 Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên thể người 14 1.3 Loại bỏ MC hòa tan các quá trình xử lý nước 15 1.3.1 Quang phân .15 1.3.2 Quá trình khử ozon .15 1.3.3 Khử clo 15 1.3.4 Lọc carbon hoạt tính 17 1.3.5 Lọc chậm 19 1.3.6 Phân hủy sinh học MC 21 1.4 Vi khuẩn phân hủy MC 21 1.4.1 Vi khuẩn dị dưỡng Sphingomonas 21 1.4.2 Cơ chế phân hủy độc tố microcystin của Sphingomonas 24 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.1 Đối tượng và thời gian nghiên cứu .26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trường nuôi cấy .26 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phân lập VKDD từ nước hồ nở hoa 27 2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá 27 2.2.2 Nhuộm Gram 27 2.2.2.2 Phản ứng Catalase .28 2.2.2.3 Phản ứng Oxidase .29 2.2.3 Phân loại 16S rDNA 29 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu enzyme protease .31 2.2.4.1 Nuôi VKDD để thu nhận enzyme 31 2.2.4.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 31 2.2.4.3 Điện di protease gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp Heusen và Dowdle [27] 32 2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi đến sự phân hủy microcystin 33 2.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 33 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH ii Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas 2.2.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ microcystin .33 Xác định hàm lượng microcystin máy quang phổ .34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 Khảo sát mức độ phú dưỡng hồ Hoàn Kiếm 35 3.2 Sàng lọc và tuyển chọn VKDD phân hủy microcystin từ nước hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội 36 3.2.1 Phân lập các chủng VKDD từ nước hồ Hoàn Kiếm .36 3.2.2 Sàng lọc VKDD có khả phân hủy đợc tố microcystin 39 3.2.3 Đặc điểm sinh học và hình dạng tế bào của VKDD S1 42 3.2.3.1 Đặc điểm hình thái tế bào của VKDD S1 42 3.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của VKDD S1 42 3.2.4 Xác định trình tự đoạn gen 16S rDNA của VKDD S1 45 3.3 Nghiên cứu enzyme phân hủy độc tố microcystin của Sphingomonas sp., S1 .48 3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease 48 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease 49 3.3.3 Độ bền với nhiệt theo thời gian xử lý 60oC .51 3.3.4 Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu đến hoạt tính enzyme protease .52 3.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme protease 53 3.3.6 Phân tích thành phần protease điện di 54 3.4 Khả phân hủy MC của VKDD Sphingomonas sp., S1 56 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 56 3.4.2 Ảnh hưởng của số lượng vi khuẩn .59 3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ microcystin 60 KẾT LUẬN .63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC .69 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH iii Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Các chữ viết tắt BOD Biochemical oxygen dermand - Nhu cầu oxy sinh học COD Chemical oxygen demand - Nhu cầu oxy hóa học DO Oxygen demand – Hàm lượng oxy hòa tan DNA Deoxyribonucleic acid DMSO Dimethyl Sulfoxide EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid Median lethal dose – Liều lượng gây chết 50% số sinh vật thí nghiệm LD50 MC Microcystin MC-LR Leucine and arginine in the positions of X and Z of microcystin MC-RR Arginine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin MC-YR Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of Microcystin Ophe O –Phenanthroline PCMB p- Chloromer curibenzoate PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng trùng hợp PMSF PP1 PP2A Phenyl methyl sulfonyl fluoride Protein Photphataza 2A RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SS SDS Suspended solids – Các chất lơ lửng Sodium Dodecyl Sulphate VKDD Vi khuẩn dị dưỡng WHO World Heath Organisation – Tổ chức y tế thế giới Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH iv Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Ảnh hưởng của microcystin đến cá [28] 12 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của chủng VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 37 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 38 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 48 Bảng 3.4 Sự thay đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo nhiệt độ 50 Bảng 3.5 Sự thay đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo thời gian xử lý 60oC 51 Bảng 3.6 Nồng đợ microcystin cịn lại với sự phân hủy của VKDD Sphingomonas sp., S1 nhiệt độ khác 57 Bảng 3.7 Nồng độ microcystin lại với sự phân hủy của VKDD Sphingomonas sp., S1 có số lượng vi khuẩn khác 59 Bảng 3.8 Lượng microcystin lại với sự phân hủy của VK Sphingomonas sp., S1 nồng độ MC khác 61 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH v Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỜ THỊ Hình 1.1 Microcystis tạo thành váng dày mặt nước [27] Hình 1.2 Tập đoàn tế bào Microcystis (×40) Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc hóa học của microcystin [11] Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc hố học của đợc tố MC – LR [46] 10 Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc hố học của đợc tố MC – RR [46] 10 Hình 1.6 Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – YR [46] 11 Hình 1.7 Vi khuẩn dị dưỡng Sphingomonas kính hiển vi điện tử [45] 22 Hình 1.8 Con đường phân hủy microcystin Sphingomonas [39] 25 Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu hồ Hoàn Kiếm - Địa điểm A [47] 26 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S1 37 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S2 37 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S3 38 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S4 38 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S5 38 Hình 3.6 Khả phân hủy MC của VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 41 Hình 3.7 Hình dạng tế bào VKDD S1 kính hiển vi điện tử (SEM×60.000) 42 Hình 3.8 Động thái sinh trưởng VKDD S1 43 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến VKDD S1 43 Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH lên VKDD S1 44 Hình 3.11 DNA tổng số của VKDD S1 45 Hình 3.12 Sản phẩm PCR nhân đoạn gene 16S rDNA của VKDD S1 45 Hình 3.13.Cây phả hệ dựa phân tích giải trình tự 16S rDNA của VKDD S1, S2 lồi có quan hệ họ hàng gần (2*) 47 Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease Sphingomonas sp.,S1 49 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Sphingomonas sp.,S1 50 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH vi Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas Hình 3.16 Sự biến đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo thời gian xử lý 60oC 51 Hình 3.17 Ảnh hưởng của chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt đợ protease của Sphingomonas sp.,S1 53 Hình 3.18 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt đợ protease Sphingomonas sp.,S1(3*) 54 Hình 3.19 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease của Sphingomonas sp., S1 55 Hình 3.20 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease của Sphingomonas sp., S1 khôi phục ion Ca2+ 55 Hình 3.21 Điện di gel polyacrylamit 10% có SDS gelatin 0,1% protease của Sphingomonas sp., S1 khôi phục ion Mg2+(3*) 56 Hình 3.22 Sự phân hủy microcystin VKDD Sphingomonas sp S1 nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 35°C 58 Hình 3.23 Tốc độ phân hủy sinh học microcystin số lượng VKDD Sphingomonas sp S1 khác 59 Hình 3.24 Phân hủy sinh học microcystin VKDD Sphingomonas sp., S1 nồng độ MC khác (1, 10, 20 50 µg/ml) 61 PHỤ LỤC Hình Biến đợng pH trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng DO trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình 3.Biến đợng COD trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng BOD5 trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng NH4+ trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng NO2- trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng NO32- trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến động PO43- trung bình của mẫu nước hồ Hồn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Hình Biến đợng SS trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH vii Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas MỞ ĐẦU Hiện nay, thế giới xử lý độc tố vi tảo lam thời kỳ nở hoa nước quốc gia quan tâm đặc biệt Đã có khơng các cơng trình nghiên cứu tượng nở hoa nước giảm thiểu tác hại của độc tố tảo lam gây độc, nhiên kết quả cịn mức đợ khác Hồ Hồn Kiếm_ địa danh tiếng của thủ đô một hồ nơng, kín, chất lượng nước thay đổi dẫn tới sự suy giảm mợt số lồi vi tảo đặc hữu, đồng thời gia tăng mật độ của vi tảo lam sinh độc tố gây nên lo ngại về môi trường cho khu hệ động thực vật sống hồ Trong số loài vi tảo lam gây nở hoa nước hồ Hoàn Kiếm, Microcystis aeruginosa Kutzing loài bắt gặp thường xuyên phổ biến Microcystis aeruginosa chứa đợc tố tḥc nhóm hepatotoxin (đợc tố gan) cấu tạo từ peptid mạch vịng có tên gọi microcystin (MC) [27,43] Chúng là các heptapeptide mạch vòng có chứa amino acid đặc hiệu (Adda) chuỗi bên Cho đến nay, là dạng cấu trúc đặc biệt gặp microcystin Microcystin có 90 đồng phân, chúng khác các nhóm methyl (R1 và R2) và amino acid (ở vị trí X và Z) bên ch̃i Từ dẫn đến sự khác về cấu trúc bậc 4, tính đợc các đặc tính ưa nước kỵ nước Có loại đợc tố MC-YR, MC-RR, MC-YA, MC-LR, MC-LR phổ biến và có tính đợc cao Khi vào gan, microcystin ức chế hepatocyte protein photphat PP1 và PP2A, từ gây siêu phosphoryl hoá cytokeratin và dẫn đến sự phá vỡ các vi sợi, thoát dịch tế bào và chảy máu gan động vật Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ microcystin thấp nước uống làm ảnh hưởng đến các cấu trúc tế bào, quá trình nguyên phân dẫn đến kích thích gây ung thư gan người Năm 1989, WHO đã triệu tập mợt nhóm chuyến gia Quốc tế để có cái nhìn tổng quan về lĩnh vực này và đưa mức giới hạn nồng độ độc MC-LR nước uống là 1,5g/l Song công bố gần nhất, mức giới hạn MC-LR nước uống làm tròn xuống một chữ số 1,0g/l, để đảm bảo sức khoẻ người Microcystin thường tích luỹ nợi quan tế bào dạng tự nước Việc loại bỏ microcystin nước có thể thực nhiều phương pháp khác phương pháp sinh học thế giới quan tâm Xử lý microcystin nước vi khuẩn dị dưỡng (VKDD) bản địa không làm thay Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas  MC nồng đợ 20 µg/ml, nhiệt đợ 30 °C số lượng tế bào tối ưu của vi khuẩn Sphingomonas sp., S1 khoảng 4.2×107 1.0×108 CFU/ml cho hiệu quả phân hủy MC cao 87,6% và 88,4% ngày đầu  Khả phân hủy MC của VKDD Sphingomonas sp., S1 mang tính ổn định cao tiến hnh thớ nghim vi MC nng ụ 1ữ50 àg/ml Vi mật đợ vi khuẩn 1.0×108CFU/ml xử lý tốt MC nồng đợ 20 µg/ml hồn tồn ba ngày, hiệu suất 87,3% ngày đầu KIẾN NGHỊ Tiến hành nghiên cứu việc tác động môi trường xử lý MC VKDD Sphingomonas sp., S1 trong điều kiện thực tế; Tiếp tục nghiên cứu tiếp theo để sản xuất chế phẩm từ VKDD Sphingomonas sp., S1 đưa vào ứng dụng xử lý MC điều kiện tự nhiên; Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 64 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Tài Nguyên và Môi trường, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia chất lượng nước mặt (National technical regulation on surface water quality)- QCVN 08 : 2008/BTNMT Nguyễn Thị Hoài Hà, (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học thăm dị khả phân hủy đợc tớ của mợt sớ chủng Microcystis phân lập hồ Hồn Kiếm, Hà Nội, Viện Vi sinh Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Đề tài cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thị Hoài Hà, (2013), “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân hủy độc tố microcystin của tảo lam Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn dị dưỡng nhằm bảo vệ nước hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội” - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Đề tài cấp Thành phố Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Alexandre Campos and Vitor Vasconcelos, (2010), Molecular Mechanisms of Microcystin Toxycity in Animal Cells, International Journal of Molecular Sciences, ISSN 1422-0067, 268-287 Ana Camến, Isabel M Moreno, María J Ruiz, Yolanda Picó, (2004), Determination of microcystins in natural blooms and cyanobacterial strain cultures by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography–mass spectrometry, Anal Bioanal Chem (2004) 380: 537–544 AWWA & ASCE (2005) Water Treatment Plant Design (4th ed.) London: McGraw-Hill Bourne, D G., Blakeley, R L., Riddles, P., & Jones, G J (2006) Biodegradation of the cyanobacterial toxin microcystin LR in natural water and biologically active slow sand filters Water Research, 40, 1294-1302 Carmichael, W W., Beasley, V., Bunner, D L., Eloff, J N., Falconer, I., Gorham, P., et al (1988) Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue- green algae) Toxicon,26, 971-973 Christiansen, G.; Fastner, J.; Erhard, M.; Borner, T.; Dittmann, E (2003) Microcystin biosynthesis in planktothrix: genes, evolution, and manipulation J Bacteriol., 185, 564–572 10 Codd, G A., Morrison, L F., & Metcalf, J S (2005) Cyanobacterial toxins: Risk management for health protection Toxicology and Applied Pharmacology, 203, 264-272 11 Dittmann, E., & Wiegand, C (2006) Cyanobacterial toxins Occurrence, Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 65 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas biosynthesis and impact on human affairs Molecular Nutrition and FoodResearch, 50, 7-17 12 Drikas, M., Chow, C W K., House, J., & Burch, M D (2001) Using coagulation, flocculation, and settling to remove toxic cyanobacteria Journal of American Water Works Association, 93, 100-111 13 Falconer, I R (2005) Cyanobacterial toxins of drinking water supplies: Cylindrospermopsins and microcystins Florida: CRC Press 14 Grützmacher, G., Bottcher, G., Chorus, I., & Bartel, H (2002) Removal of microcystins by slow sand filtration.Environmental Toxicology, 17, 386–394 15 Himberg, K., Keijola, A M., Hiisvirta, L., Pyysalo, H., & Sivonen, K (1989) The effect of water treatment processes on the removal of hepatotoxins from Microcystis and Oscillatoria cyanobacteria: A laboratory study Water Research, 23, 979–984 16 Hitzfeld, B C., Höger, S J., & Dietrich, D R (2000) Cyanobacterial toxins: Removal during drinking water treatment, and human risk assessment Environmental Health Perspectives, 108, 113–122 17 Ho, L (2004) Removal of cyanobacterial metabolites from drinking water using ozone and granular activated carbon A thesis submitted to the University of South Australia for the degree of Doctor of Philosophy in Applied Science 18 Ho, L., Meyn, T., Keegan, A., Hoefel, D., Brookes, J., Saint, C P., et al (2006) Bacterial degradation of microcystin toxins within a biologically active sand filter Water research, 40, 768–774 19 Hoeger, S J., Hitzfeld, B C., & Dietrich, D R (2005) Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in drinking water treatment plants Toxicology and Applied Pharmacology, 203, 231-242 20 Huang, W J., Cheng, B L., & Cheng, Y L (2007) Adsorption of microcystin-LR by three types of activated carbon Journal of Hazardous Materials, 141, 115-122 21 Indabawa, I.I., (2009), Detection of variants of microcystin produced by Micorocystis aeruginosa in some borrow pits of Kano, Nigeria, Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 2(1):189 – 197 22 Ingrid Chorus and Jamie Bartram, (1999), Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public heath consequences, monitoring and management, E & FN Spon, London 23 Jaana Vaitomaa, (2006), The effects of environmental factors on biomass and microcystin production by the freshwater cyanobacterial genera Microcystis and Anabaena, Department of Applied Chemistry and Microbiology, University of Helsinki, Finland.pp.3-5 24 Kenefick, S.L., S.E Hrudey, H.G Peterson and E.E Prepas (1993) Toxin release from Microcystis aeruginosa after chemical treatment Water Sci Tech 27:pp 433-440 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 66 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas 25 Lawton, L A., & Robertson, P K J (1999) Physicochemical treatment methods for the removal of microcystins (cyanobacterial hepatotoxins) from potable waters.Chemical Society Reviews, 28, 217-224 26 Lee, D K., Kim, S C., Kim, S J., Chung, I S., & Kim, S W (2004) Photocatalytic oxidation of microcystin-LR with TiO2-coated activated carbon.The Chemical Engineering Journal, 102, 93-98 27 Lenka Šejnohová, (2008), Microcystis, New findings in peptide production, taxonomy and autecology by cyanobacterium Microcystis, Masaryk University in Czech Republic, Faculty of Science Department of Botany and Zoology & Institute of Botany Czech Academy of Sciences.pp.16-38 28 Ned Butler, James C Carlisle, Regina Linville, Barbara Washburn, (2009), Microcystins: A brief overview of their toxycity and effects, with special reference to fish, wildlife, and livestock, Integrated Risk Assessment Branch Office of Environmental Heath Hazard Assessment California Environmental Protection Agency, OEHHA Ecotoxycology.pp.1-9 29 Nicholson, B C., Rositano, J., & Burch, M D (1994) Destruction of cyanobacterial peptide heptatotoxins by chlorine and chloramines Water Research, 28, 1297–1303 30 Rodriguez, E., Onstad, G D., Kull, T P J., Metcalf, J S., Acero, J L., & von Gunten, U (2007) Oxidative elimination of cyanotoxins: Comparison of ozone, chlorine, chlorine dioxide and permanganate Water Research, 41, 3381–3393 31 Saito.H, Miura.K, (1963 ), “Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment ”, Journal: Biochimica Et Biophysica Acta (bba) - Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects , vol 72, pp 619-629 32 Sakane T, Takeuchi M, De Bruyn A, Kereters K, Yokota A (1995), Distribution of 3-katolectose formation among Sphingomonas spp and other members of alpha subclass of Proteobacteria Int J Syst Bacteriol 45.pp.342-347 33 Shephard, G S., Stockenström, S., de Villiers, D., Engelbrecht, W J., Sydenham, E W., & Wessels, G F S (1998) Photocatalytic degradation of cyanobacterial microcystin toxins in water Toxicon, 36, 1895-1901 34 Singer, P C., & Reckhow, D A (1999) Chemical Oxidation In: R D Letterman, (Ed) Water Quality and Treatment (pp 12.1-12.51) (5th ed.) New York: McGraw-Hill 35 Sivonen, K., & Jones, G (1999) Cyanobacterial toxins In: I Chorus & J Bartram (Eds), Toxic Cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring and management (pp 41-111) 36 Tahara Y, Kawazu M (1994), Isolation of glucuronic acid-containing glycosphingolipid from Zymomonas mobilis Biosci Biotechnol Biochem 58.pp.586-587 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 67 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas 37 Takeuchi M, Sakane T, Yanagi M, Yamasato K, Hamana K, Yokota A (1995),Taxanomic study of bacteria isolated from plants: proposal of Sphingomonas rosa sp nov., Sphingomonas pruni sp nov., Sphingomones asaccherolytica sp nov., and Sphingomones mali sp nov Int J Syst Bacteriol45.pp.334-341 38 Takeuchi M, Sawada W, Oyaizu H, Yolota A (1994), Phylogenetic evidence for Sphingomonas and Rhizomonas as nonphotosynthetic members of the alpha-4 subclass of the Proteobecteria Int J Syst Bacterio 44.pp.308-314 39 Theerasak Somdee, (2010), Biodegradation of cyanobacterial hepatotoxins MC-LR by natural aquatic bacteria Institute of Food, Nutrition and Human Health College of Sciences, Massey University at Wellington, New Zealand.pp.1-2 40 Tzong-Huei Lee (2000), Isolation and identification of seven microcystins from a culture M.TN-2 strain ofMicrocystis aeruginosa, Bot.Bull.Acad.Sin., 41: pp 197202 41 Wang, H., Ho, L., Lewis, D M., Brookes, J D., & Newcombe, G (2007) Discriminating and assessing adsorption and biodegradation removal mechanisms during granular activated carbon filtration of microcystin toxins Water research, 41, 4262-4270 42 Yabuuchi E, Yano I, Oyaizu H, Hashimoto Y, Ezaki T, Yamamoto Y, Ezaki T, Yamamoto H, (1990), Proposals of Sphingomonas paucimobilis gen nov and comb nov Sphingomonas parapaucimobilis sp nov., Sphingomonas yanoikuyae sp nov., Sphingomonas adheesive sp nov., Sphingomonas capsulate comb nov and two genospecies of the genus Sphingomonas Microbiol Immuno.pp.99-119 43 Zurawell, R W., Chen, H., Burke, J M., & Prepas, E E (2005) Hepatotoxic cyanobacteria: A review of the biological importance of microcystins in freshwater environments Journal of Toxicology and Environmental Health part B: Critical Reviews, 8, 1-37 Website 44 45 46 47 http://www.microbewiki.kenyon.edu/index.php/Sphingomonas 27L http://www.visualsunlimited.photoshelter.com/image/I0000uHEPrsZ5QQM28 http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/cyanotox/toxins/microcystins.html http://.hoangsa.org/gallery/showphoto.php?photo=9204&title=to-c3-a0n-c-e1ba-a3nh-h-e1-bb-93-g-c6-b0-c6-a1m&cat=182 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 68 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas PHỤ LỤC Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường PBS (g/l) Môi trường LB (g/l) Hóa chất Khối lượng (g) Hóa chất Khối lượng (g) Na2HPO4 1,72 Trytone 10,0 KH2PO4 0,254 Cao nấm men 5,0 NaCl 8,5 NaCl 10 Thạch 15,0 Thạch 15,0 Nước cất lít Nước cất lít Khử trùng 121oC 15 phút, pH=7,2 Môi trường NA (g/l) Khử trùng 121oC 15 phút, pH=7 Nước hồ nhân tạo Hóa chất Khối lượng (g) Hóa chất Khối lượng (g) Pepton 10,0 (NH4)2SO4 0,1 Cao thịt 1,0 KH2PO4 0,5 NaCl 1,5 Na2HPO4 0,5 Thạch 15,0 MgSO4.7H2O 0,5 Nước cất lít Nước cất lít Khử trùng 121oC 15 phút, pH=7 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Khử trùng 121oC 15 phút, pH=7 69 PHỤ LỤC Bảng 1: Thơng số thủy lý, hóa của hồ Hoàn Kiếm Hà Nội tháng 3, 4, 5/2012 Thời gian thu mẫu (tháng) Chỉ tiêu TT Mức cho phép Đơn vị 6/3/2012 6/4/2012 6/5/2012 Nhiệt độ khơng khí o 22 24,5 32 Nhiệt đợ nước o 21 23,1 25 Màu nước Xanh Xanh Xanh Mùi nước Tanh Tanh Tanh pH 9,8 10,1 10,5 Độ cm 23 20 14 Chất rắn lơ lửng mg/l 60 90 DO mg/l 5,7 COD mg/l 10 BOD5 11 C C TC – QC áp dụng so sánh 5,5-9 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 80 50 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 4,4 3,0 ≥4 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 510 560 540 30 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 mg/l 340 440 390 15 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 NH4 + mg/l 1,88 9,1 5,6 0,5 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 12 NO2 - mg/l 0,12 0,28 0,39 0,04 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 13 NO32 - mg/l 32 57 63 10 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 14 PO4 3- mg/l 1,89 2,57 2,85 0,3 QCVN 08:2008/ BTNMT cột B1 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH  Các tiêu lý học Nhiệt độ Nhiệt độ nước phụ thuộc vào thời tiết, thời gian, nhiệt đợ khơng khí của đất tiếp xúc với nước Sự thay đổi ảnh hưởng lớn đến nhiệt đợ nước hồ Nhiệt đợ nước có ảnh hưởng lớn đến đời sống của sinh vật thủy sinh hồ Đồng thời ảnh hưởng đến hàm lượng oxy hịa tan, tốc độ hoạt động của vi khuẩn phân hủy đợng vật sống hồ, ảnh hưởng đến tồn bợ xích thức ăn hồ Trong thời gian thu mẫu nhiệt đợ nước hồ có sự biến động theo thời gian và liên quan trực tiếp đến nhiệt đợ mơi trường khơng khí thu cùng thời điểm Từ tháng đến tháng 5, nhiệt đợ mơi trường tăng dần 22°C đến 32°C, theo nhiệt đợ nước hồ có sự biến đợng từ 21°C đến 25°C Sự biến động của nhiệt độ nước hồ thấp so với nhiệt đợ khơng khí nhiêt độ nước hồ phụ thuộc vào nhiều yếu tố Vào tháng (đầu hè) nhiệt độ nước tăng cao tới 25oC, nhiệt đợ khơng khí lên tới 32oC là thời điểm thuận lợi cho sự phát triển của mợt số lồi tảo ưa ấm pH Mẫu nước hồ có sự phát triển của mợt số loài vi tảo, đặc biệt Microcystis aeruginosa Sự biến đợng giá trị pH trung bình của điểm thu mẫu tại hồ tháng thu mẫu thể hình Hình Biến đợng pH trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Vào thời điểm này, pH của cả tháng đều trạng thái kiềm, và vượt mức cho phép Khoảng pH dao động từ 9,8 đến 10,5, sự biến động pH qua các tháng không rõ rệt, mức độ sai khác các tháng thấp (chỉ 0,4-0,7) Về mặt lý thuyết, nhiệt đợ tăng, pH nước có xu hướng giảm, nhiên trường hợp của hồ Hoàn Kiếm, Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH nhiệt độ nước tăng (từ 21°C đến 25°C) thì pH lại tăng (từ 9,8 đến 10,5) điều này là do: tảo phát triển mạnh lượng CO2 tiêu thụ lớn nhờ quá trình quang hợp diễn mạnh mẽ khiến nồng độ CO2 tự xuống nồng đợ cân với khơng khí Sự thiếu CO2 làm chuyển dịch từ dạng bicarbonate HCO3- sang dạng carbonate CO32-, tiếp theo từ carbonate CO32- sang dạng hydroxide OH- Phản ứng xảy : CO32- + H2O = CO2 + 2OH- (tăng pH)  Các tiêu hóa học Oxy hòa tan (DO – Dissolved Oxygen) Oxy một yếu tố quan cho sự sống Thiếu oxy, tất cả sinh vật sống trái đất đều không thể tồn tại Trong môi trường nước, oxy hòa tan quyết định sự tồn tại phát triển của các sinh vật thủy sinh Hàm lượng oxy hòa tan nước phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau, đặc biệt nhiệt độ phản ứng sinh hóa học quá trình trao đổi chất Hình Biến đợng DO trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Sự biến đợng giá trị DO trung bình của điểm thu mẫu tại hồ tháng thu mẫu trình bày hình Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng oxy hòa tan hồ tháng thu mẫu liên tục giảm từ 5,7 xuống 3mg/l Sự giảm DO là lượng oxi hòa tan nước tuân theo định luật Henry nên phụ thuộc vào nhiệt độ; nhiệt độ tăng thì DO giảm Kết quả nhiệt độ nước các đợt lấy mẫu liên tục tăng từ 21°C đến 25°C điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả DO giảm dần hình 3.2 Ngồi ra, hồ có tỷ số BOD5/COD cao (0,72) nên tình trạng ô nhiễm hữu cơ, dẫn tới xảy phản ứng phân hủy sinh học tiêu tốn lượng lớn oxy nước h Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Nhu cầu oxy hóa học (COD-chemical oxygen demand) COD một thông số quan trọng thường sử dụng để đánh giá mức độ ô nhiễm của nước, kể cả nước thải nước tự nhiên Sự biến động hàm lượng COD hồ tại thời điểm thu mẫu theo tháng 3, 4, trình bày hình Hình Biến đợng COD trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Trong thời gian nghiên cứu, hàm lượng COD cả tháng đều cao, vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần Hàm lượng COD này nằm khoảng 510 đến 560 mg/l, vậy là đã vượt quá tiêu chuẩn cho phép từ 17 đến 18,7 lần Điều này chứng tỏ hồ đã tiếp nhận một lượng lớn chất thải hữu từ nước thải sinh hoạt, nước mưa chảy tràn và xác động thực vật Trong khoảng thời gian từ tháng 3/2012, hàm lượng COD đạt giá trị cao tại tháng và đạt mức 560 mg/l Nhu cầu oxy sinh học (BOD- biochemical oxygen dermand) Cùng với COD, BOD5 là tiêu quan trọng đánh giá mức độ ô nhiễm sinh học của thủy vực Tiến hành phân tích nhu cầu oxy sinh học của các mẫu nước thu tại hồ Hoàn Kiếm cho kết quả hình 4, tại thời điểm lấy mẫu hàm lượng BOD5 của các mẫu nước cao gấp nhiều lần tiêu chuẩn cho phép và dao động khoảng 340-440 mg/l cao gấp 22,7 đến 29,3 lần tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 08:2008 cột B1 Lê Thị Ḥ 12B.KTMT.KH Hình Biến đợng BOD5 trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Tỷ lệ BOD5/COD cao, khoảng từ 0,67 đến 0,79 chứng tỏ nước hồ Hoàn Kiếm bị ô nhiễm hữu cơ, có khả xử lý đường sinh học Ngoài COD, BOD tiêu NH4+ , PO43-, NO32-, NO2-, chất rắn lơ lửng (SS) là thông số quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm bẩn của thủy vực hay của hồ Hoàn Kiếm nói riêng Amoni (NH4+) Amoni là mợt các tiêu đánh giá mức độ ô nhiễm nguồn nước, và một sản phẩm của trình phân hủy sản phẩm hữu nước hồ Sự biến động hàm lượng NH4+ hồ tại thời điểm thu mẫu theo tháng 3, 4, trình bày hình Hàm lượng NH4+ cao thể sự nhiễm bẩn hồ So sánh hàm lượng amoni của các mẫu nước đem phân tích với QCVN 08:2008 cột B1 nhận thấy hàm lượng amoni của các mẫu nước đã vượt ngưỡng cho phép 3,76 đến 18,2 lần Có sự gia tăng đợt biến hàm lượng amoni nước hồ tại tháng (9,1 mg/l) điều này có nghĩa là có sự phân hủy mạnh mẽ các sản phẩm hữu có nước hồ vào thời gian này Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Hình Biến động NH4+ trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Sang tháng 5, amoni chuyển hóa dần thành nitrit và nitrat khiến cho hàm lượng nitrit và nitrat tăng cao và đạt giá trị cao tháng thu mẫu Đối với vi tảo, chất dinh dưỡng quan trọng hợp chất của nitơ và photpho Hàm lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi tảo cao Nitrit (NO2-) Hình Biến đợng NO2- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Nitrite một hợp chất trung gian quá trình oxy hóa nitơ amoniac thành nitrate vi khuẩn nitrat hóa đất và nước Nồng đợ nitrit bị tác động mức oxy hòa tan và chloride nước nitrit là mợt tiêu quan trọng đánh giá chất lượng nước Sự biến đợng nitrite của nước hồ Hồn Kiếm tại thời điểm thu mẫu thể hình.6 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Các mẫu nước thu tại hồ Hoàn Kiếm có hàm lượng nitrit dao đợng khoảng 0,12 đến 0,39 mg/l, vượt ngưỡng cho phép từ đến 9,75 lần Nitrat (NO32-) Nitrat là sản phẩm cuối của quá trình oxi hóa các hợp chất hữu nước, nước có hàm lượng nitrat là chủ yếu nghĩa là quá trình oxi hóa nước đã kết thúc Sự biến đợng nitrat của nước hồ Hồn Kiếm tại thời điểm thu mẫu thể hình.7 Hình Biến động NO32- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Theo QCVN 08:2008 cột B1 hàm lượng nitrat giới hạn là 10 mg/l Tuy nhiên kết quả phân tích mẫu nước hồ Hoàn Kiếm thu lại cao gấp 3,2 đến 6,3 lần ngưỡng cho phép và nằm khoảng giá trị từ 32 đến 63 mg/l Photphat (PO43-) Photphat là chất dinh dưỡng cần thiết cho thực vật và gây nên sự phát triển của tảo nước mặt Photphat dùng đánh giá dinh dưỡng thủy vực, thủy vực có nồng đợ photphat cao có thể gây tượng phú dưỡng Đối với thủy vực nước ngọt, photphat coi là yếu tố giới hạn đánh giá mức độ phú dưỡng Các mẫu nước hồ Hoàn Kiếm đem phân tích cho kết quả hình Nồng đợ photphat đều mức cao (1,89-2,85 mg/l), là điều kiện dẫn đến sự bùng nổ số lượng của tảo Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Hình Biến động PO43- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Với giá trị hàm lượng NH4+ dao động 1,88 – 9,1mg/l, NO2- khoảng 0,12 – 0,39mg/l, NO3- từ 32 – 63mg/l PO43- 1,89 – 2,85mg/l chứng tỏ nước hồ có hàm lượng dinh dưỡng cao và hồ tình trạng phú dưỡng Điều này thúc đẩy sự phát triển củsa Microcystis và các loại vi tảo khác dẫn đến sự nở hoa nước Vi tảo lam phát triển dày đặc mặt hồ và đặc biệt tập trung khu vực cuối hướng gió  Các tiêu khác Chất rắn lơ lửng (SS): Hàm lượng chất rắn lơ lửng nước là một tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng nước hồ Các chất này đặc trưng cho hàm lượng các hạt nhỏ (hữu và vơ cơ) có nước, và đặc biệt hồ vi tảo nhỏ sống trôi hồ Nếu hàm lượng SS cao, sự thâm nhập của ánh sáng vào hồ giảm xuống, vậy ảnh hưởng đến nhiều q trình khác hồ Hình Biến đợng SS trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH Trong kết quả phân tích, nhận thấy hàm lượng chất lơ lửng nước của hồ là tương đối cao, thay đổi từ 60 đến 90mg/l (giới hạn tối đa theo QCVN 08:2008 cột B1 là 50 mg/l) So sánh tháng tháng 4/2012 tháng có hàm lượng chất rắn lơ lửng nước cao (90mg/l), sang tháng hàm lượng chất rắn lơ lửng giảm nhẹ và đạt giá trị 80 mg/l Độ trong: độ của nước thể mức độ sạch bẩn tương đối của hồ Đối với hồ sạch, nghèo dinh dưỡng, độ tương đối cao Tuy nhiên, tại hồ, độ thấp, dao động từ 14 tới 23 Một điều đáng ý hồ Hoàn Kiếm tháng khảo sát độ liên tục giảm thấp là vào tháng Điều lý giải nhiệt đợ khơng khí nhiệt đợ nước tương đối cao (ổn định), các thông số NH4+, NO2-, NO32 - PO43- mức cao là nguồn dinh dưỡng phong phú, điều kiện tḥn lợi kích thích sự phát triển của mợt số lồi vi tảo lam, vậy nước có màu xanh đặc trưng và độ thấp So với kết quả nghiên cứu của một số tác giả trước, độ của hồ giảm nhiều Đây là điều đáng lo ngại chất lượng nước của hồ sau thời gian nạo vét bùn Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH ... 12B.KTMT.KH 20 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas 1.3.6 Phân hủy sinh học MC Trong nước ngọt, chế phân hủy MC trình phân hủy sinh học Lớp vi tảo... lồi Sphingomonas sp., khác [42] Sphingomonas sp.,HH69, Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH 23 Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas phân lập từ đất phân hủy. .. Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas Hình 1.8 Con đường phân hủy microcystin Sphingomonas [39] Chính tượng mở vòng độc tố MC - LR nhờ enzyme microcystinase