Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano cacbon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN SỸ UẨN NGUYỄN SỸ UẨN CHUYÊN NGÀNH VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH CHUỖI ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO CÁC BON NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ KHOÁ 2009 Hà Nội – 2011 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu hướng dẫn nhiệt tình thầy cô giáo, giúp đỡ bạn đồng nghiệp nỗ lực cố gắng thân, luận văn tốt nghiệp cao học hồn thành Đầu tiên cho tơi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn TS Phương Đình Tâm người định hướng, hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Viện đào tạo quốc tế khoa học vật liệu (ITIMS ), Viện tiên tiến khoa học công nghệ (AIST), Viện sau đại học tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thành viên nhóm cảm biến sinh học - Viện ITIMS người nhiệt tình giúp đỡ suốt trình thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Hà nội, ngày27 tháng năm 2011 Học viên Nguyễn Sỹ Uẩn Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Nguyễn Sỹ Uẩn Học viên lớp: VLĐT- HY Đề tài: Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học Tơi xin cam đoan kết tơi trình bày luận văn nghiên cứu hướng dẫn tiến sỹ Phương Đình Tâm Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố sử dụng để bảo vệ luận văn Hà nội, ngày 27 tháng9 năm 2011 Người viết Nguyễn Sỹ Uẩn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN SỸ UẨN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH CHUỖI ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO CÁC BON NHẰM ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN SINH HỌC Chuyên ngành : Khoa học kỹ thuật vật liệu điện tử LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS PHƯƠNG ĐÌNH TÂM Hà Nội – 2011 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .9 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .10 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO CÁC BON 13 1.1 Giới thiệu chung cảm biến sinh học 13 1.2 Tổng quan số phương pháp cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano bon 14 1.2.1 Giới thiệu chung ống nanno bon (CNT) 14 1.2.2 Giới thiệu chung chuỗi ADN 16 1.2.3 Tổng quan số phương pháp cố định chuỗi ADN 19 1.2.3.1 Phương pháp hấp phụ vật lý .19 1.2.3.2 Phương pháp liên kết cộng hoá trị 20 1.2.3.3 Phương pháp điện hoá 21 1.2.3.4 Phương pháp bẫy màng 21 1.2.4 Một số phương pháp cố định ADN sử dụng ống nano bon .22 1.2.4.1 Phương pháp hấp phụ vật lý .22 1.2.4.2 Phương pháp liên kết cộng hoá trị 23 1.3 Kết luận 27 CHƯƠNG CỐ ĐỊNH ADN LÊN CẢM BIẾN .29 2.1 Các hoá chất sử dụng cố định ADN .29 2.2 Thông tin cảm biến 30 2.3 Cố định ADN sử dụng ống nano bon lên cảm biến 30 2.3.1 Sơ đồ cố định .31 2.3.2 Các bước thực 31 2.3.2.1 Biến tính CNT 31 2.3.2.2 Rung siêu âm 31 2.3.2.3 Phủ ADN-CNT lên bề mặt cảm biến 32 2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu 32 2.3.3.1 Phương pháp SEM & TEM 32 2.3.3.2 Phổ tử ngoại UV – Vis 34 2.3.3.3 Phổ hồng ngoại FTIR 35 2.3.3.4 Phổ Raman 36 2.3.3.5 Xây dựng hệ đo phương pháp đo xác định lai hoá .39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Cố định ADN lên bề mặt ống nano bon 44 3.1.1 Phân tán ống nano bon dung dịch ADN 44 3.1.1.1 Ảnh quang học ống nano bon phân tán dung dịch ADN, nước 44 3.1.1.2 Phổ UV-Vis phân tán ống nano bon dung dịch ADN 45 3.1.1.3 Ảnh hiển vi điện tử truyền qua phân tán ống nano bon dung dịch ADN .46 3.1.2 Đặc trưng cố định ADN lên ống nano bon 47 3.1.2.1 Ảnh FE-SEM bề mặt ống nano bon 47 3.1.2.2 Đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR CNT-ADN 48 3.1.2.3 Đặc trưng phổ Raman 49 3.2 Đặc trưng đáp ứng cảm biến ADN 50 3.2.1.Đặc trưng đáp ứng cảm biến 50 3.2.1.1 Thời gian đáp ứng cảm biến .50 3.2.1.2 Đặc trưng tín hiệu cảm biến 51 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng trình cố định ADN đến tín hiệu cảm biến 52 3.2.2.1 Ảnh hưởng thời gian cố định DNA 52 3.2.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ADN dò 53 3.2.2.3 Ảnh hưởng nồng độ CNT 54 3.2.2.4 Ảnh hưởng giá trị pH 55 3.2.3 Độ ổn định cảm biến 56 3.2.3.1 Ảnh hưởng phủ màng BSA 56 3.2.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lai hoá 57 3.2.3.3 Độ lặp lại cảm biến 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TT Tên hình vẽ, đồ thị Hình 1.1.Cấu tạo chung cảm biến sinh học ADN Hình 1.2 Hình ảnh mô ống nano bon đơn vách(A) đa Trang 14 vách(B) 15 Hình 1.3 Cấu tạo hố học phân tử ADN 18 Hình 1.4 Mơ tả phương pháp cộng hóa trị 21 Hình 1.6 Phương pháp chung để chức hoá ống nano bon 24 Hình 1.8 Cố định ADN lên ống nano bon 25 Hình 1.9 Sơ đồ cố định ADN lên màng đa lớp SWCNT 26 Hình 2.1 Vi cảm biến có có cấu hình 10 µm X 10µm (bề rộng x khoảng cách điện cực) 30 Hình 2.2 Sơ đồ cố định ADN sử dụng ống nano bon 31 10 Hình 2.3 Cố định ADN- CNT lên cảm biến 32 11 Hình 2.4 Dải làm việc kỹ thuật hiển vi điện tử quang học 33 12 Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo máy SEM 34 13 Hình 2.6 Cơ chế phổ Raman 36 14 Hình 2.7 So sánh mức lượng phổ Raman thường, 38 15 Raman cộng hưởng huỳnh quang cộng hưởng 38 16 Hình 2.8 Dạng sóng từ khuếch đại Lock-in 40 17 Hình 2.9 Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830 41 18 Hình 2.10 Mạch tương đương hệ đo vi sai 42 19 Hình 3.1 Ảnh quang học phân tán ống nano bon sau tháng lưu trữ nước (a), dung dịch ADN (b) Công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7 20 44 Hình 3.2 Phổ UV-vis ống nano bon phân tán dung dịch ADN (a), mối quan hệ cường độ đỉnh hấp phụ với thời gian phân tán (b) Công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7 21 46 Hình 3.3 Ảnh TEM ống nano bon phân tán dung dịch ADN 46 22 Hình 3.4 Ảnh FE-SEM bề mặt ống nano bon không cố định ADN (a), cố định ADN (b) 23 Hình 3.5 Phổ FTIR ống nano bon không cố định AND (a), cố định ADN (b), 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7 24 47 48 Hình 3.6 Phổ raman ống nano bon cố định DNA ống nano bon không cố định DNA 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7 25 49 Hình 3.7 Thời gian đáp ứng cảm biến, nồng độ ADN dị 10µM, nhiệt độ 30oC 26 50 Hình 3.8 Đặc trưng lai hóa chuỗi ADN với nồng độ chuỗi ADN dị 10µM, nhiệt độ 30oC 27 51 Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian cố định ADN đến tín hiệu cảm biến 28 52 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ ADN dị tín hiệu cảm biến 29 53 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ ống nano bon đến tín hiệu cảm biến 54 30 Hình 3.12 Ảnh hưởng giá trị pH tín hiệu cảm biến 55 31 Hình 3.13 Ảnh hưởng màng BSA tín hiệu cảm biến 57 32 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ lai hố tới tín hiệu cảm biến 58 33 (a) nồng độ chuỗi ADN đích khác nhau, (b) nồng độ ADN đích 34 9nM 58 Hình 3.15 Tín hiệu cảm biến sau hai lần lai hoá 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Ký hiệu Viết tắt cho Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axít nuclêic APTS 3-Amino propyl triethoxy silane Chất APTS CNT Carbon nanotube Ống nano bon EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride Chất EDC FE-SEM FTIR Field Emision Scanning Electron Microscop Fourier Transform Infra Red Hiển vi điện tử quét Phổ hồng ngoại GPTS Chất GPTS GTD 3-Glycidoxy propyl trimethoxy silane glutaraldehyde HATU O-(7-azabenzotriazol-1-yl)N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate Chất HATU 10 HREM High resolution electron microscopy Hiển vi điện tử phân dải cao 11 MWCNT Multi-walled carbon nanotube 12 NHS N-hydroxysulfo-succinimide 13 14 ODA PCR 4,4’-oxydianiline Polymerase chai reaction 15 SWCNT Single-walled carbon nanotube 16 TOAB tetra-n-octylammonium bromide 17 TEM Transmission electron microscopy Chất GTD Ống nano bon đa vách Chất NSH Chất ODA Phản ứng chuỗi polyme Ống nano bon đơn vách Chất TOAB Hiển vi điện tử truyền qua 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng trình cố định ADN đến tín hiệu cảm biến 3.2.2.1 Ảnh hưởng thời gian cố định DNA Thời gian cố định ADN yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu lai hố cảm biến Bởi phương pháp cố định thời gian cố định gắn liền với trình rung siêu âm hỗn hợp ADN ống nano bon, định đến phân tán ống nano bon dung dịch ADN lượng chuỗi ADN dò hấp phụ lên ống nano bon Để xét ảnh hưởng thời gian cố định ADN đến tín hiệu cảm biến, tiến hành khảo sát bốn mẫu thí nghiệm với thời gian cố định 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian cố định ADN đến tín hiệu cảm biến Sau cố định, bốn mẫu thí nghiệm tiến hành đo lai hố nhiệt độ phịng Các đường mơ tả ảnh hưởng thời gian cố định đến tín hiệu cảm biến biểu diễn hình 3.9 Quan sát hình 3.9 thấy, tín hiệu cảm biến tăng thời gian cố định tăng Ở thời gian cố định 30 phút tín hiệu cảm biến thấp gần khơng thay đổi Điều giải thích với khoảng thời gian 30 phút, số lượng chuỗi ADN hấp phụ lên ống ít, khả bắt cặp ADN dị ADN bổ sung khơng nhiều dẫn đến tín hiệu cảm biến nhỏ Khi tăng dần thời gian cố định, lượng ADN dò 52 cố định bề mặt ống nano bon tăng dần, dẫn đến khả bắt cặp lai hố ADN dị đích tăng lên Như vậy, nói rằng, đáp ứng cảm biến tăng thời gian cố định tăng lên Trong tất trường hợp, nồng độ ADN đích 7nM, tín hiệu lai hoá đạt giá trị lớn 2,3mV, với thời gian cố định 120 phút Vì vậy, thời gian 120 phút lựa chọn để cố định chuỗi ADN có thí nghiệm 3.2.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ADN dò Chuỗi ADN dò thông số ảnh hưởng lớn đến độ nhạy độ ổn định cảm biến, định đến xác suất tương tác ADN dị ADN đích Trong cơng trình này, chúng tơi thực việc xác định ảnh hưởng nồng độ ADN dị đến tín hiệu cảm biến bốn mẫu thí nghiệm với nồng độ ADN dò 1mM, 5mM, 10mM, 20mM, với điều kiện cố định lai hoá Đường đặc trưng mẫu mơ tả hình 3.10 Chuỗi ADN dị sử dụng thí nghiệm vi khuẩn Ecoli có cấu trúc AACGCCGATACCATTACTTA cung cấp invitrogen Từ hình 3.10 nhận thấy, tín hiệu cảm biến mẫu 1mM, 5mM, 10mM 20mM tăng tuyến tính nồng độ thấp (0-6nM) có xu hướng đạt giá trị bão hồ dải nồng độ lớn 6nM Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ ADN dị tín hiệu cảm biến 53 Ở nồng độ ADN dị thấp, đáp ứng tín hiệu cảm biến thấp ngược lại nồng độ cao, đáp ứng tín hiệu tốt Điều chứng tỏ rằng, cố định lượng lớn nồng độ ADN dò, mật độ ADN dò hấp phụ lên ống nano bon tăng lên dẫn đến lượng ADN dò bề mặt cảm biến tăng Khi tiến hành lai hố với ADN đích, xác suất gặp chuỗi dị đích tăng làm tăng khả hình thành chuỗi xoắn kép bề mặt cảm biến, mật độ điện tích lân cận bề mặt cảm biến tăng làm cho tín hiệu đáp ứng cảm biến tăng 3.2.2.3 Ảnh hưởng nồng độ CNT Tín hiệu cảm biến khơng bị ảnh hưởng nồng độ chuỗi ADN dò cố định bề mặt cảm biến mà bị ảnh hưởng lượng vật liệu trung gian gắn kết chuỗi ADN với bề mặt cảm biến Trong khuôn khổ đề tài này, sử dụng vật liệu trung gian để liên kết chuỗi ADN với bề mặt cảm biến ống nano bon Vì vậy, ảnh hưởng nồng độ ống nano bon đến tín hiệu cảm biến xem xét nghiên cứu phần Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ ống nano bon đến tín hiệu cảm biến, chúng tối tiến hành khảo sát bốn mẫu có điều kiện cố định nhau, với lượng ống nano bon 0.3mg, 0.5mg, 0.7mg 1mg Đường mô tả ảnh hưởng hàm lượng ống nano bon đến tín hiệu cảm biến biểu diễn hình 3.11 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ ống nano bon đến tín hiệu cảm biến 54 Có thể nhận thấy tín hiệu mẫu tăng theo nồng độ ống nano bon Điều giải thích tăng nồng độ ống nano bon, số lượng ống nano chuỗi ADN dò hấp phụ tăng Trong q trình lai hố, xác suất bắt cặp chuỗi ADN dị đích tạo thành chuỗi xoắn kép tăng lên, dẫn đến tín hiệu cảm biến tăng Nhưng với lượng CNT nhiều gây giảm tín hiệu cảm biến q trình cố định có nhiều CNT bao phủ lượng ADN bề mặt cảm biến, dẫn đến khả lai hoá giảm, làm giảm tín hiệu cảm biến 3.2.2.4 Ảnh hưởng giá trị pH Như ta biết chuỗi ADN phân tử sinh học cấu tạo ba zơ, đường gốc a xit Nồng độ pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt động phân tử Vì vậy, tín hiệu cảm biến ảnh hưởng độ pH môi trường cố định Trong phần tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH trình cố định tới tín hiệu cảm biến với năm mẫu khảo sát với nồng độ pH pH 3, pH 5, pH 7, pH 9, pH 11 Tín hiệu cảm biến thể hình 3.12 Hình 3.12 Ảnh hưởng giá trị pH tín hiệu cảm biến Quan sát tín hiệu hình 3.12 thấy rằng, mẫu có độ pH pH 11 có tín hiệu thay đổi khơng đáng kể, chứng tỏ khả lai hố chuỗi ADN dị 55 chuỗi bổ sung thấp, mẫu có pH pH tín hiệu cảm biến tốt Trường hợp pH tín hiệu cảm biến cao mẫu khảo sát Như vậy, ta nhận thấy môi trường cố định có độ axít ba zơ cao, lai hố chuỗi ADN dò chuỗi bổ sung xảy khơng thuận lợi Sự lai hố xảy thuận lợi mơi trường trung tính Ngun nhân tạo kết chuỗi ADN bị thay đổi cấu trúc môi trường có độ a xít ba zơ cao Do đó, tiến hành lai hố số lượng chuỗi ADN dị bắt cặp với chuỗi ADN bổ sung thấp nên tín hiệu cảm biến nhỏ không ổn định Trong mơi trường trung tính ADN khơng bị thay đổi cấu trúc bắt cặp diễn thuận lợi tín hiệu cảm biến lớn 3.2.3 Độ ổn định cảm biến 3.2.3.1 Ảnh hưởng phủ màng BSA Độ ổn định thông số quan trọng cảm biến nói chung cảm biến ADN nói riêng Đây coi thước đo đánh giá chất lượng cảm biến việc ứng dụng chúng vào thực tế Vì vậy, phần này, chúng tơi nghiên cứu phương pháp làm tăng độ ổn định làm việc cảm biến cách sau cố định ADN lên bề mặt cảm biến, hợp chất BSA phủ lên bề mặt để tránh hấp phụ chuỗi ADN đích lên bề mặt cảm biến, dẫn đến tín hiệu lai hố giả Để khảo sát ảnh hưởng màng BSA đến tín hiệu cảm biến, khảo sát hai mẫu thí nghiệm Một mẫu sau cố định ADN phủ lớp màng BSA, cịn mẫu khơng phủ, số liệu thí nghiệm mơ tả hình 3.13 Từ hình 3.13 nhận thấy, tín hiệu lai hoá trường hợp phủ BSA nhỏ so với tín hiệu lai hố bề mặt cảm biến khơng phủ BSA q trình lai hố Trong trường hợp cho thấy, sử dụng màng BSA ngăn hấp phụ chuỗi ADN đích lên bề mặt cảm biến, giảm lai hố giả chuỗi ADN dị ADN đích 56 Hình 3.13 Ảnh hưởng màng BSA tín hiệu cảm biến 3.2.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lai hố Q trình bắt cặp chuỗi ADN dị chuỗi ADN đích phụ thuộc nhiều yếu tố như: nhiệt độ bắt cặp, độ dài chuỗi ADN bổ sung, nồng độ muối dung dịch đo Trong yếu tố nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng mạnh đến q trình lai hố Để xác định nhiệt độ lai hố tối ưu, cần thiết phải xác định nhiệt độ Tm nhiệt độ mà đoạn ADN kép bị tách hoàn toàn thành đoạn ADN đơn Giá trị nhiệt độ gọi nhiệt độ ‘biến tính’ ADN Nó chủ yếu xác định số lượng cặp bazơ G − C, độ dài đoạn ADN Do vậy, phần nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lai hố đến tín hiệu cảm biến nhiệt độ khác 30oC, 45oC, 60oC 75oC Tín hiệu cảm biến phụ thuộc vào nhiệt độ lai hố nồng độ ADN đích khác thể hình 3.14 a Hình 3.14b mơ tả tín hiệu cảm biến phụ thuộc vào nhiệt độ nồng độ ADN đích 9nM Từ hình 3.14 b nhận thấy rằng, tăng dần nhiệt độ 30oC, 45oC, 60oC tín hiệu cảm biến tăng theo, nhiệt độ 75oC tín hiệu giảm thấp đột ngột Điều giải thích với mẫu lai hố 30oC, 45oC, 60oC, giá trị nhiệt độ nằm khoảng nhiệt độ hồi tính ADN Khi đó, nhiệt độ đóng vai trị làm 57 tăng tốc độ phản ứng, xúc tác cho bắt cặp hai chuỗi ADN đơn thành chuỗi ADN kép dẫn đến làm tăng tín hiệu cảm biến (a) (b) Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ lai hố tới tín hiệu cảm biến (a) nồng độ chuỗi ADN đích khác nhau, (b) nồng độ ADN đích 9nM Trường hợp mẫu lai hố lớn 75oC, tín hiệu lai hố giảm nhiệt độ khơng cịn đóng vai trị xúc tác bắt cặp chuỗi ADN mà đóng vai trị tách chuỗi ADN kép thành chuỗi đơn Vì vậy, theo lý thuyết, để có giá trị lai hố tốt nhiệt độ lai hoá thực tế nên nhỏ nhiệt độ Tm khoảng 10% đến 25% 3.2.3.3 Độ lặp lại cảm biến Thông thường, việc tái sử dụng cảm biến đặc điểm mà nhà sản xuất thường hướng tới Điều cảm biến sinh học nói chung cảm biến ADN nói riêng Trong phần này, chúng tơi nghiên cứu khả tái sử dụng vi cảm biến ADN cách tách sợi ADN đích khỏi đoạn ADN dò bề mặt vi cảm biến, sau sử dụng cảm biến xác định lai hóa đoạn ADN Q trình dựa biến tính hồi tính đoạn xoắn kép nhiệt độ Tm Để thực biến tính, chúng tơi nâng nhiệt độ lên qua nhiệt độ Tm để đảm bảo đoạn ADN đích đoạn ADN dị tách hồn tồn Sau làm nguội nhanh rửa trơi đoạn ADN đích khỏi bề mặt vi cảm biến Thí nghiệm lặp lại để xác định phụ thuộc tín hiệu vi cảm biến với nồng độ ADN đích mơ tả hình 3.15 58 Hình 3.15 Tín hiệu cảm biến sau hai lần lai hoá Kết cho thấy, gần khơng có khác biệt phụ thuộc tín hiệu lối với nồng độ ADN đích phép đo trước sau biến tính Điều cho phép nghĩ tới việc tái sử dụng cảm biến ADN 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong trình thực đề tài ”Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học” bước đầu thu số kết qủa khoa học, đóng góp vào việc phát triển cảm biến ADN để phát nhanh virut gây bệnh Những kết thu khn khổ luận văn bao gồm: Cố định thành công chuỗi ADN dò vi khuẩn Ecoli lên bề mặt cảm biến vi độ dẫn thông qua vật liệu trung gian ống nano bon phương pháp hấp phụ vật lý Tác giả sử dụng ảnh quang học, ảnh SEM, ảnh TEM, phổ UV-VIS, phổ hồng ngoại, phổ Raman để nghiên cứu trình cố định chuỗi ADN lên bề mặt ống nano bon Các thông số cố định tối ưu hoá Các yếu tố trình cố định ảnh hưởng đến tín hiệu cảm biến nghiên cứu như: thời gian cố định, nồng độ ADN dò, nồng độ CNT, pH dung dịch cố định Kết cho thấy thời gian cố định tối ưu 120 phút, nồng độ ADN dò 20mM, nồng độ CNT 1mg, dung dịch cố định có pH7 Ngoài độ ổn định khả tái sử dụng cảm biến nghiên cứu Kết khảo sát cho thấy, cảm biến hoạt động ổn định có phủ màng BSA Bên cạnh đó, khảo sát lặp lại cảm biến cho thấy tín hiệu cảm biến lần lai hoá thứ hai giảm không nhiều so với lần thứ Điều cho phép tái sử dụng cảm biến thực tế Kiến nghị: Để phát triển đề tài dự định tiếp tục theo số hướng sau đây: Nghiên cứu cố định ADN lên bề mặt cảm biến sử dụng phương pháp liên kết cộng hoá trị, điện hoá, để so sánh với phương pháp hấp phụ vật lý Tiếp tục nghiên cứu triển khai áp dụng phương pháp cho cảm biến ADN để phát vi rút gây bệnh 60 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Cơng trình báo quốc tế 1.1 B¸o đăng tạp chí quốc tế Thi Thuy Nguyen, Sy Uan Nguyen, Dinh Tam Phuong, Duc Chien Nguyen, Anh Tuan Mai, “ D ispersion of denatured carbon nanotubes by using a dimethylformamide solution ” , Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol (2011) 035015 1.2 Báo đăng hội nghị quốc tế Phuong Dinh Tam, Nguyen Thi Thuy, Nguyen Sy Uan, Phuong Trung Dung, Mai Anh Tuan, Nguyen Duc Chien, Dispersion of single wall carbon nanotubes in DNA solution for DNA sensor preparation, Proceedings of IWNA 2011, November 10-12, 2011, Vung Tau, Vietnam, accepted Cơng trình báo nước 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2005), Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Phạm Thành Hổ (2003), Di truyền học, Nhà xuất giáo dục Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Phương Đình Tâm (2008), Nghiên cứu chế tạo cảm biến ADN ứng dụng y học công nghệ thực phẩm, Luận án TS Tài liệu tham khảo tiếng Anh Cattien V Nguyen, Lance Delzeit, Alan M Cassell, Jun Li, Jie Han, and M Meyyappan (2002), Preparation of Nucleic Acid Functionalized Carbon Nanotube Arrays, Nano letters, 2, 1079-1081 Chenguo Hu, Yiyi Zhang, Gang Bao, Yuelan Zhang, Meilin Liu, and Zhong Lin Wang (2005), DNA Functionalized Single-Walled Carbon Nanotubes for Electrochemical Detection, J Phys Chem B, 109, 20072-20076 D Grieshaber et al (2008), Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures, Sensors, 8, 1400-1458 Dae-Hwan Jung, Byung Hun Kim, Young Koan Ko, Myung Sup Jung, Sungouk Jung, Sang Yup Lee, Hee-Tae Jung (2004), Covalent Attachment and Hybridization of DNAOligonucleotides on Patterned Single-Walled Carbon Nanotube Films, Langmuir, 20, 8886-8891 Davis J, Vaughan DH, Cardosi MF (1995), Elememts of biosensor construction, Enzyme Microb Technol ,17, 1030-519 10 Dichs JM, Cardosi MF, Turner APF, Karube I (1993), The application of ferrocene-modified n type silicon in glucose biosensors, Electroanalysis, 5, 1-9 11 F Kleinjung, F.F Bier, A Warsinke, F.W Scheller (1997), Fibre-optic 62 genosensor for specific determination of femtomolar DNA oligomers, Analytica Chimica Acta, 350, 51-58 12 F Palmisano, D Centonze, P.G Zambonin (1994), An in situ electro synthesized amperometric biosensor based on lactate oxidase immobilized in a poly-o-phenylenediamine film: determination of lactate in serum by flow injection analysis, Biosens Bioelectron, 9, 471-54 13 G.I.Dovbeshko, Repnytska, O.P.Obraztsova, E.D.Shtogun (2003), DNA Interaction with Single-Walled Carbon Nanotubes: A SEIRA Study, Chem Phys.Lett, 372, 432-437 14 GI Dovbeshko, OP Repnytska, ED Obraztsova, YV Shtogun, (2003), DNA interaction with single-walled carbon nanotubes: a SEIRA study, Chemical Physics Letters, 372, 432–437 15 Gladchenko G O., Karachevtsev M.V., Leontiev V.S., Valeev V.A., Glamazda A.Y., Plokhotnichenko A.M., Stepanian S.G (2006), Interaction of Fragmented Double-Stranded DNA with Carbon Nanotubes in Aqueous Solution, Mol Phys., 104, 3193 16 H.A Tajmir-Riahi (2006), An Overview of Protein-DNA and ProteinRNA Interactions, Journal of the Iranian Chemical Society, 3, 297304 17 Hong Cai, Xuni Cao, Ying Jiang, Pingang He, Yuzhi Fang (2003), Carbon nanotube-enhanced electrochemical DNA biosensor for DNA hybridization detection, Anal Bioanal Chem, 375, 287-293 18 http://jnm.snmjournals.org/content/48/7/1039/F1.expansion.html 19 http://www.fractal.org/Fractal-Research-and-Products/Bridging.htm 20 http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/dna2.php 21 Hu C., Zhang Y., Bao G., Zhang Y., Liu M., Wang Z.L (2005) Functionalized Single-Walled Carbon Nanotubes for Electrochemical Detection, J Phys Chem B, 109, 20072-20076 63 22 Hwang E.S., Cao C., Hong S., Jung H.J.,Cha C.Y., Choi J.B., Kim Y.J., Baik S (2006), The DNA Hybridization Assay Using SingleWalled Carbon Nanotubes as Ultrasensitive, Long-Term Optical Labels, Nanotechnology, 17, 3442-3445 23 Jinyan Jia, Wenjun Guan1, Minghao Sim,Yongquan Li, Hong Li (2008), Carbon Nanotubes Based Glucose Needle-type Biosensor, Sensors, 8, 1712-1718 24 Junrong Yu, Nadia Grossiord, Cor E Koning, Joachim Loos (2007), Controlling the dispersion of multi-wall carbon nanotubes in aqueous surfactant solution, Carbon, 45, 618-623 25 Liang, Z Lao, R Wang, J Liu, Y Wang, L Huang, Q Song, S Li, G Fan (2007), Solubilization of Single-Walled Carbon Nanotubes with Single-Stranded DNA Generated from Asymmetric PCR, Int J Mol Sci, 8, 705-713 26 Linqin Jiang, Lian Gao, Jing Sun ( 2003), Production of aqueous colloidal dispersions of carbon nanotubes, Journal of Colloid and Interface Science, 260, 89-94 27 M Passamano et al (2006), QCM DNA-sensor for GMOs detection, Sensors and Actuators B, 118, 177-181 28 M S Alqasaimeh et al (2007), A Urea Biosensor from Stacked SolGel Films with Immobilized Nile Blue Chromoionophore and Urease Enzyme, Sensors, 7, 2251-2262 29 M Zheng, A Jagota, E D Semke, B A Diner, R S Mclean, S R Lustig, R E Richardson, N G Tassi (2003), Nat Mater, 2, 338-342 30 Maryam Hadji Abouzar (2005), Label-free detection of charged macromolecules using a field-effect-based biosensor, Master of Science Thesis, Department of Applied Sciences and Technology, Germany 31 Nakashima N., Okuzono S., Murakami H., Nakai T., Yoshikawa K 64 (2003), DNA Dissolves Single-Walled Carbon Nanotubes in Water, Chem Lett., 5, 456-457 32 Qingxiang Wang, Bin Zhang, Xiaoqiang Lin, Wen Weng (2011), Hybridization biosensor based on the covalent immobilization of probe DNA on chitosan–mutiwalled carbon nanotubes nanocomposite by using glutaraldehyde as an arm linker, Sensors and Actuators B, 156, 599-605 33 Rajesh, Bisht V, Takashima W, Kaneto K.(2005), An amperometric urea biosensor based on covalent immobilization of urease onto an electrochemically prepared co polymer poly (N-3-amino propyl pyrrole-co-pyrrole) film, Biomaterials, 26, 3683-3690 34 Ramanathan K, Pandey SS, Kumar R, Gulati A, Murthy ASN, Malhotra BD.(2000) Covelent immobilization of glucose exidase to poly(o- amino benzoic acid) for application to glucose biosensor J Appl Polym Sci, 78, 662-667 35 Sarah E Baker, Wei Cai, Tami L Lasseter, Kevin P Weidkamp, Robert J Hamers (2002), Covalently Bonded Adducts of Deoxyribonucleic Acid (DNA) Oligonucleotides with Single-Wall Carbon Nanotubes: Synthesis and Hybridization, Nanoletters, 2, 14131417 36 Tombelli S., Mascini M., Sacco C., Turner A.P.F (2000), A DNA piezoelectric biosensor assay coupled with a polymerase chainreaction for bacterial toxicity determination in environmental samples, Analytica Chimica Acta, 418, 1-9 37 Taeger S., Xuang L.Y., Günther K., Mertig M.(2005), Noncovalent Sidewall Functionalization of Carbon Nanotubes by Biomolecules: Single-stranded DNA and Hydrophobin, AIP Conf Proc., 262-265 38 Trojanowicz M, Geschke O, Krawozynske V, Krawczyk T, Cammann K (1995), Biosensors based on oxidase immobilized in various 65 conducting polymers, Sens Actuators B, 28, 191-19 39 Xuejiang Wang, Ling Chen1, Siqing Xia1, Zhiliang Zhu1, Jianfu Zhao1, Jean-Marc Chovelon, Nicole Jaffrezic Renaul (2006), Tyrosinase biosensor based on interdigitated electrodes for herbicides determination, International Journal of Electrochem Science, 1, 5561 40 Yongqiang Tan, Daniel E Resasco (2005), Dispersion of SingleWalled Carbon Nanotubes of Narrow Diameter Distribution, J Phys Chem B, 109, 14454-14460 41 Wenrong Yang, Pall Thordarson, J Justin Gooding, Simon P Ringer, Filip Braet (2007), Carbon nanotubes for biological and biomedical applications, Nanotechnology, 18, 412001 66 ... chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học? ?? với nội dung nghiên cứu sau: - Nghiên cứu tổng quan phương pháp cố định ADN lên ống nano bon -... Nguyễn Sỹ Uẩn Học viên lớp: VLĐT- HY Đề tài: Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học Tôi xin cam đoan kết tơi trình bày luận văn nghiên cứu hướng dẫn... đổi sau phát cảm biến Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học ADN hình 1.1 13 Hình 1.1.Cấu tạo chung cảm biến sinh học ADN Trong cảm biến ADN việc cố định chuỗi ADN dò lên bề mặt cảm biến yếu tố