Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật. Nó được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng... Collagen là một loại protein chiếm tới 25% lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau. Ví dụ như các sợi collagen chiếm chủ yếu trong sợi dây chằng, ảnh hưởng đến khả năng nén ở các khớp sụn và tính linh động của mạch máu và da. Nó được coi như là một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể con người thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có collagen cơ thể người chỉ là các phần rời rạc. Chỉ riêng điều này cũng đủ chỉ ra tầm quan trọng của collagen với sự sống của con người. Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm... Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá vỡ. NỘI DUNG: 1. Tổng quan về collagen 4 2. Các loại collagen và cấu tạo của chúng 6 3. Thành phần các acid amin có trong collagen 9 4. Tính chất của collagen 9 4.1 Tác dụng với nước 9 4.2 Tác dụng với acid, kiềm 10 4.3 Các tính chất khác của collagen 11 4.3.1 Khả năng tạo nhũ tương 11 4.3.2 Khả năng hòa tan 11 4.3.3 Sự biến tính 11 4.3.4 Tính kị nước 12 4.3.5 Tính chất của dung dịch keo 12 4.3.6 Tính chất điện ly lưỡng tính 12 5. Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen 12 6. Quy trình công nghệ của trích ly collagen từ da cá tra 13 6.1 Phương pháp hóa học 13 6.2 Phương pháp dùng enzyme 16 7. Các ứng dụng của collagen 18 7.1 Trong công nghiệp thực phẩm 18 7.2 Trong mỹ phẩm 19 7.3 Trong y học và dược phẩm 19 8. Thành tựu 21 8.1 Nghiên cứu trích ly collagen bằng enzyme collagenase kết hợp với acid 21 8.1.1 Mở đầu 21 8.1.2 Cách tiến hành 21 8.1.3 Kết quả 23 8.1.4 Kết luận 24 8.2 Nghiên cứu ứng dụng của collagen trong lĩnh vực y khoa: Tổng hợp polymercollagen hydrogel để làm chất tải thuốc và dùng trong công nghệ mô 25 8.2.1 Mở đầu 25 8.2.2 Giới thiệu 25 8.2.3 Tổng quan 26 8.2.4 Tổng hợp hydrogel 29 8.2.5 Kết quả 31 8.2.6 Bàn luận 42 8.2.7 Kết luận 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48#luận_văn_y_khoa#công_nghệ_collagen#ứng_dụng_collagen#tìm_hiểu_collagen#trích_ly_collagen
EBOOKBKMT.COM MỤC LỤC Tổng quan collagen Các loại collagen cấu tạo chúng Thành phần acid amin có collagen .8 Tính chất collagen Các nguồn nguyên liệu có chứa collagen 11 Quy trình cơng nghệ trích ly collagen từ da cá tra 12 Các ứng dụng collagen 17 Thành tựu 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 DANH MỤC HÌNH Hình 1-1: Cấu trúc lớp hạ bì da Hình 1-2: Các liên kết sợi collagen .4 Hình 2-3: Cấu trúc phân tử collagen Hình 2-4: Trật tự xếp acid amin collagen Hình 2-5: Từng bậc cấu trúc chuỗi collagen Hình 2-6: Tổ chức bó sợi collagen Hình 6-7: Quy trình chiết collagen acid acetic 13 Hình 6-8: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I da heo collagen da cá (Điện di 5% gel chứa urea 3,5M) (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu 14 Hình 6-9: Quy trình chiết collagen pepsin 15 Hình 7-10: HANAMAI COLLAGEN: sản phẩm dạng bột, trộn chung với đậu hủ hay natto dùng bữa ăn phụ nữ Nhật 17 Hình 7-11: Tóc bị hư tổn phục hồi sau sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate 18 Hình 7-12: Collagen áp dụng việc điều trị vết bỏng ((a): vết bỏng trước sử dụng collagen, (b): sau ngày sử dụng, (c): sau 10 ngày sử dụng) .19 Hình 7-13: Collagen hydrolysate mảnh bọt biển sử dụng nha khoa .20 Hình 8-14: Hình ảnh điện di mẫu collagen từ da cá hồi điều kiện khử không khử Đường 1: protein có MW cao; đường 2: collagen loại I; đường 3-5:; đường 6-8: collagen chiết xuất acid acetic, collagenase từ CNA1 CNL3 điều kiện khử .22 Hình 8-15: Cấu trúc polymer PEO-PPO-PEO 26 Hình 8-16: Quá trình tạo micelle 26 Hình 8-17: Lược đồ phương pháp chế tạo hydrogel tổng hợp .29 Hình 8-18: Mẫu hydrogel C-F108 (1%) vị trí khác .29 EBOOKBKMT.COM Hình 8-19: Hình ảnh SEM cấu trúc A) Collagen gel; B) C-L103 (1%); C) C-L103 (3%); D) C-L103 (5%); E) C-F108 (1%); F) C-F108 (3%); G) C-F108 (5%) nồng độ collagen 3,2 mg/ml (độ phóng đại: 2500) 32 Hình 8-20: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 30%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 15% 33 Hình 8-21: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10 15% 33 Hình 8-22: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 30% 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10% 34 Hình 8-23: Tế bào K562 A) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) B) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) nồng độ khác đo cách bổ sung Alamar blue Giá trị trung bình sử dụng đồ thị Thanh sai số thể sai số chuẩn giá trị trung bình (n = 3) 34 Hình 8-24: A) Tế bào K562 ma trận hydrogel C-F108 (1%) sau tuần B) Hình ảnh SEM tế bào K562 C-F108 (1%) sau liên kết với glutaraldehyde (2%) (độ phóng đại 2500) 35 Hình 8-25: Hình ảnh điện di BSA tinh khiết BSA-PPG diglycidyl ether liên kết dọc môi trường thời điểm khác 35 Hình 8-26: Hình ảnh điện di collagen tinh khiết collagen diglycidyl ether môi trường thời điểm khác 36 Hình 8-27: Hình ảnh SEM collagen tinh khiết độ phóng đại khác .36 Hình 8-28: Hình ảnh SEM PG-COLc20 độ phóng đại khác 37 Hình 8-29: A) Đường cong TGA PPG diglycidyl ether tinh khiết; B) Đường cong TGA gel tổng hợp 37 Hình 8-30: Đồ thị DSC PPG diglycidyl ether tinh khiết; Tg = -76,7oC 37 Hình 8-31: Đường cong nhiệt collagen tinh khiết,, PG-COLc5 PG-COLc20 A) Quét lần B) Quét lần .38 Hình 8-32: Đường NMR A) PPG diglycidyl ether B) Collagen tinh khiết C) Gel tổng hợp 38 Hình 8-33: Đồ thị thể liên hệ nồng độ amin với độ hấp thu tia UV 39 Hình 8-34: Độ độc collagen-PPG gel lên nguyên bào sợi, đo phần trăm tế bào sống, 72 sau cấy 40 Hình 8-35: Nguyên bào sợi (mũi tên) A) PG-COLc20 b) blank glass coverslip C) bottom well plastic ngày kính hiển vi quang học, Độ phóng đại × 10 41 Hình 8-36: Hình ảnh SEM nguyên bào sợi A) glass coverslip B) PG-COLc20 độ phóng đại khác 41 Hình 8-37: Minh họa tạo liên kết dọc collagen với diglycidyl ether 43 Hình 8-38: Cơ chế phản ứng nhóm epoxy với nhóm ε -amino lysine pH≈ 12 44 Hình 8-39: A) Bề mặt collagen-PPG diglycidyl B) Bề mặt collagen tinh khiết .46 EBOOKBKMT.COM DANH MỤC BẢNG Bảng 3-1: Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide .8 Bảng 8-2: Lượng collagen chiết xuất acid collagenase 23 Bảng 8-3: Các loại polymer dùng để tổng hợp hydrogel .26 Bảng 8-4: Phương pháp chuẩn bị mẫu hydrogel 29 Bảng 8-5: Vật liệ sử dụng để sản xuất hydrogel tổng hợp phương pháp thủy phân .30 Bảng 8-6: A) Tỉ lệ BSA & PPG mơi trường có pH khác B) Tỉ lệ Vitrogen 100 & PPG NaOH pH khác .30 Bảng 8-7: Tỉ lệ tế bào sống hydrogel C-F108 nồng độ polymer khác 35 Bảng 8-8: Độ hấp thu tia UV hỗn hợp BSA nồng độ khác 39 Bảng 8-9: Số lượng nhóm amin tự dung dịch tổng hợp tỉ lệ polymer khác 39 Bảng 8-10: Phần trăm phát triển tế bào gel tổng hợp so với mẫu chuẩn 40 Bảng 8-11: Số lượng tế bào sống sót sau 24 chất mang khác 40 Bảng 8-12: Góc tiếp xúc với nước mẫu chuẩn lớp màng kết hợp, độ lặp lại n=4 46 Tổng quan collagen Collagen loại protein cấu trúc thể động vật Nó phân bố phận da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương Collagen loại protein chiếm tới 25% lượng protein thể người, có chức kết nối mơ thể lại với Ví dụ sợi collagen chiếm chủ yếu sợi dây chằng, ảnh hưởng đến khả nén khớp sụn tính linh động mạch máu da Nó coi chất keo dính phận thể người thành khối hoàn chỉnh, khơng có collagen thể người phần rời rạc Chỉ riêng điều đủ tầm quan trọng collagen với sống người Trong thành phần da, lớp bì chứa nhiều collagen tạo hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho đặc tính học da sức căng, độ đàn hồi, trì độ ẩm Tùy theo độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân mơi trường, da bị lão hóa tổn thương, sợi collagen dần tính đàn hồi săn cấu trúc collagen bị phá vỡ Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da phân bố chủ yếu lớp hạ bì da (hình 1-1) Nó đóng vai trị kết nối tế bào, kích thích q trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm số lượng chất lượng collagen dẫn đến hậu lão hóa thể mà thay đổi da, khuôn mặt dấu hiệu dễ nhận biết nhất: da bị khô, nhăn nheo đường nhăn mảnh khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, đường nét khuôn mặt bị chùng nhão chảy sệ Chính mà collagen đóng vai trị chất quan trọng hàng đầu ngành thẩm mỹ, đặc biệt chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng EBOOKBKMT.COM Hình 1- 1: Cấu trúc lớp hạ bì da Collagen protein có cấu trúc bậc điển hình, đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc tổ hợp theo hướng dọc ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc (hình 1-2) Trong cấu trúc phân tử collagen, tương tác mạch polypeptide làm cho phân tử có vùng kị nước vùng phân cực mang điện tích tạo nên khả háo nước làm trương nở collagen Hình 1-2: Các liên kết sợi collagen EBOOKBKMT.COM Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trị quan trọng phát triển, hàn gắn vết thương, thành phần hoạt hố tiểu cầu máu hình thành mạch Thêm vào phát triển số bệnh di truyền xác định đột biến cấu trúc gen collagen Những rối loạn trình tổng hợp phân giải collagen ghi lại nguyên nhân nhiều bệnh phức tạp chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường ung thư bệnh có liên quan đến lão hố Xét mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất gelatine, chất có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác Các loại collagen cấu tạo chúng • Collagen tồn nhiều phận thể Đã có 29 loại collagen tìm thấy cơng bố tài liệu khoa học Trên 90% collagen thể loại I, II, III IV • Collagen loại I: có da, gân, mạch máu, quan, xương (thành phần xương) • Collagen loại II: có sụn xương (thành phần sụn) • Collagen loại III: có bắp (thành phần bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I • Collagen loại IV: thành phần cấu tạo màng tế bào • Collagen loại V: có dây chằng, giác mạc, kẽ hở mơ • Collagen loại VI: có gan, thận, màng sụn • Collagen loại VII: có nối liền da biểu bì • Collagen loại VIII: có tế bào màng • Collagen loại IX: có sụn • Collagen loại X: có sụn bị khống hóa phình to • Collagen loại XI: có sụn • Collagen loại XII: có dây chằng, sợi liên kết collagen • Collagen loại XIII: có biểu bì, nang tóc, tế bào gốc móng • Collagen loại XIV: có sợi liên kết collagen • Collagen loại XV: có nhiều mơ khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII • Collagen loại XVI: cịn nghiên cứu • Collagen loại XVII: có da • Collagen loại XVIII: có gan • Collagen loại XIX: có mắt, não, tinh hồn, mơ thời kỳ đầu phát triển • Collagen loại XX-XXIX: cịn nghiên cứu Collagen loại I phổ biến thường mô liên kết da, xương, gân Collagen loại II tồn mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc lớn vào độ tuổi động vật, da heo trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ giảm - 10% Những loại colagen khác diện với lượng nhỏ vài quan đặc biệt EBOOKBKMT.COM Về cấu trúc phân tử collagen, phân tử collagen hay gọi tropocollagen cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5nm Mỗi sợi collagen cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (alpha peptide) nối với liên kết hydro xoắn lại với giống sợi dây thừng (hình 2-1) Mỗi vịng xoắn có độ dài 3,3 gốc amino acid, chiều cao 2,9 A0 Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn ống từ trái sang phải Ba chuỗi xoắn lại với hình thành cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi triple helix Hình 2- 3: Cấu trúc phân tử collagen Mỗi chuỗi polypeptide collagen cấu tạo từ amino acid theo trật tự, thông thường Gly - Pro - Y, Gly - X – Hyp (hình 2-2) Trong đó, X, Y đơn vị amino acid khác Proline (Pro) hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi Tổng cộng riêng proline, hydroxyproline, glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen Các amino acid cịn lại chiếm 1/2 Glycine đóng vai trị quan trọng cấu trúc sợi siêu xoắn collagen Hình 2- 4: Trật tự xếp acid amin collagen Phần lớn collagen mạng lưới ngoại bào tìm thấy dạng sợi, bao gồm sợi mảnh nhỏ Đầu tiên ba sợi collagen xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh sợi hình thành nên ba tropocollagen Sau tropocollagen liên kết với theo kiểu đầu nối hình thành collagen fibril Các collagen fibril bó lại với hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber (hình 2-3, 2-4) EBOOKBKMT.COM Hình 2-5: Từng bậc cấu trúc chuỗi collagen Hình 2- 6: Tổ chức bó sợi collagen Các chuỗi collagen xếp song song theo chiều dọc liên kết với liên kết ngang tạo thành sợi theo chu kỳ định Chúng xếp so le khoảng 67nm có khoảng trống 40nm phân tử liền kề EBOOKBKMT.COM Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có chuỗi xoắn ốc chuyển sang sợi collagen, cung cấp cho mô độ cứng, độ đàn hồi đặc tính học riêng Vì collagen chắc, dai bền Thành phần acid amin có collagen Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline Collagen khơng chứa tryptophan, số protein chứa hydroxylysine Các amino acid xếp chuỗi xoắn ốc theo dãy với phân bố sau: Bảng 3- 1: Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide Trong I amino acid (proline hydroxyproline), X amino acid khác Glycine chiếm gần 1/3 tổng số amino acid phân bố cách đặn vị trí 1/3 xuyên suốt phân tử collagen Do glycine có nhánh phụ nhỏ nên lặp lại cho phép chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với tạo thành đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ phần lõi Trong collagen không chứa tryptophan, cystine loại protein khác, tyrosin, histidin, acid amin chứa lưu huỳnh loại diện không 1%, điều làm cầu nối disulfur (-S-S) cấu trúc collagen xuất ngun nhân cho tính mềm dẻo so với keratin, chứa nhiều hydroxyproline Hydroxyproline acid amin đặc trưng collagen mà loại protein khác khơng có Trong collagen chứa đến 30% glycine, 10% hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine Tính chất collagen 4.1 Tác dụng với nước Collagen khơng hịa tan nước mà hút nước để nở ra, 100g Collagen khơ hút khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở nước, độ dày tăng lên chừng 25% độ dài tăng lên khơng đáng kể, tổng thể tích phân tử collagen tăng lên – lần Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro liên kết phối trí collagen làm giảm tính vững sợi gelatin từ – lần Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu bắt đầu đứt thành mạch polypeptide tương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên khoảng 60 – 650C collagen hút nước bị phân giải EBOOKBKMT.COM Nhiệt độ phân giải collagen nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao Khi ngun liệu khử hết chất khống, nhiệt độ phân giải giảm xuống 4.2 Tác dụng với acid, kiềm Collagen tác dụng với acid kiềm, mạch collagen có gốc carboxyl amin Hai gốc định hai tính chất Trong điều kiện có acid tồn tại, ion tác dụng với gốc amin, điện tích carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+ Trong điều kiện có nước, nước tác dụng với nhóm gốc có mang điện kết cấu protide ion Na+ Cl- làm tăng tính hấp phụ nước collagen mơi trường acid kiềm tính trương nở collagen tăng lên Ngồi acid kiềm cịn gây số biến đổi : Cắt đứt mạch muối (liên kết –NH3+ COO-) làm đứt mạch peptide mạch Làm đứt liên kết hydrogen gốc –CO, NH- mạch xung quanh Làm acid amin bị phân hủy giải phóng ammoniac Cùng với biển đổi điểm đẳng điện collagen hạ xuống thấp, acid kiềm phân hủy collagen nhiên theo nghiên cứu nhiều nhà khoa học vơi làm tăng tỷ lệ phân hủy collagen Trong điều kiện thường, thời gian dài làm cho collagen bị phân giải( mức độ phân giải thấp) nhiệt độ tăng độ phân giải tăng lên nhanh chóng Collagen phân giải biến thành gelatin, vào giả thuyết Hofmeister phản ứng tiến hành sau: EBOOKBKMT.COM Nếu xử lý điều kiện nhiệt độ cao có nước keo dễ tiếp tục biến đổi thành Do muốn sản xuất gelatin ta phải khống chế nhiệt độ thích hợp cho chất lượng gelatin đảm bảo 4.3 Các tính chất khác collagen 4.3.1 Khả tạo nhũ tương - Là protein khơng tan, collagen có dấu hiệu cho thấy chất nhũ hóa Tuy nhiên, thực collagen có nguồn gốc từ da sống xử lý biến tính mức độ khác chất nhũ hóa tốt sữa gầy 4.3.2 Khả hòa tan Collagen tan glycerin, acid acetic, ure không tan nước lạnh Collagen phân chia thành bốn lớp sở tính hịa tan dung dịch đệm khác nhau: tan muối trung tính, tan acid, tan kiềm, không tan kiềm Các phần tan acid thường bao gồm hai tập hợp khác bên cạnh tiểu phân tử chuỗi α Một có tên β2 β11 bao gồm hai chuỗi α1, thứ hai β1 β12 bao gồm chuỗi α1 chuỗi α2 liên kết liên kết cộng hóa trị kiểu este Collgagen hịa tan muối tìm thấy bao gồm 90% chuỗi chuỗi α số dạng β (l0%), collagen hòa tan acid khoảng 10% chuỗi α 90% dạng β Chỉ có 50% nhóm ion acid hịa tan có collagen hịa tan muối Các nhóm cịn lại tham gia vào mối liên kết chéo Mặt khác, phần tan kiềm khơng hịa tan kiềm đại diện cho collagen trưởng thành 4.3.3 Sự biến tính Dưới tác dụng chất hóa học acid, base, muối, dung môi alcohol, tác nhân vật lý khuấy trộn học, nghiền, tia cực tím cấu trúc bậc hai, ba bậc bốn protein bị biến đổi làm cho liên kết hydro, cầu nối disunfit, liên kết ion bị phá không phá vỡ liên kết peptide, tức cấu trúc bậc giữ nguyên, protein thay đổi tính chất so với ban đầu Đó tượng biến tính protein Sau bị biến tính, protein thường có tính chất sau: • Độ hịa tan giảm làm lộ nhóm kị nước vốn bên phân tử protein Tức protein chưa biến tính, acid amin có nhóm kị nước nằm bên phân tử protein Khi bị biến tính, phân tử protein lúc trình tự xếp acid amin mạch thẳng, làm cho nhóm kị nước lộ ngồi độ hịa tan giảm Khả giữ nước giảm EBOOKBKMT.COM Hình 8-22: So sánh phóng thích FITC-dextran hydrogel collagen – PEO-PPOPEO (EO 30% 80%) chuẩn bị với nồng độ polymer 1, 5, 10% 8.2.5.1.3 Sự tăng trưởng tế bào thí nghiệm khả sống Sự tăng trưởng tế bào thí nghiệm khả sống tiến hành để nghiên cứu ảnh hưởng ma trận lên cách cư xử tế bào Như hình, tế bào phát triển collagen–PEO-PPOPEO hydrogel C-F108 (1%) C-F108 (3%) tỏ có tăng trưởng giống biểu thị ảnh hưởng thời gian lên phát triển phát huỳnh quang phát triển có nhanh đơi chút sau ngày Cả thể khác biệt 14% từ ngày trở Ở nồng độ polymer 5%, tế bào phát triển ma trận hydrogel bị hạn chế so với collagen khác quan sát đồ thị Ở trường hợp C-L103 hydrogel, tế bào phát triển tốc độ cao đặc biệt ma trận C-L103 (5%) trước giảm dần sau ngày Tuy nhiên C-L103 (5%) thể độ nghiêng thấp từ ngày trở đi, độ khác biệt không lớn không phản ánh tăng trưởng có ý nghĩa thống kê Hình 8- 23: Tế bào K562 A) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 80%) B) Ma trận collagen – PEO-PPO-PEO (EO 30%) nồng độ khác đo cách bổ sung Alamar blue Giá trị trung bình sử dụng đồ thị Thanh sai số thể sai số chuẩn giá trị trung bình (n = 3) Khả sống tế bào C-F108 hydrogel cao (bảng dưới) gần với collagen gel Điều cho thấy tri-block copolymer PEO-PPO-PEO (EO 80%) nồng độ nhỏ 5% EBOOKBKMT.COM không ảnh hưởng lên sống tế bào ma trận Tuy nhiên nồng độ polymer cao (5%) ma trận làm giảm sống tế bào (dưới 50%, kết đây) Mặt khác, PEO-PPO-PEO (EO 30%) ảnh hưởng lên sống tế bào nồng độ 1% Bảng 8- 7: Tỉ lệ tế bào sống hydrogel C-F108 nồng độ polymer khác Hình 8- 24: A) Tế bào K562 ma trận hydrogel C-F108 (1%) sau tuần B) Hình ảnh SEM tế bào K562 C-F108 (1%) sau liên kết với glutaraldehyde (2%) (độ phóng đại 2500) 8.2.5.2 Polymer liên kết dọc xerogel 8.2.5.2.1 Điện di gel Hình hình ảnh điện di PG-BSA2, PG-BSA3 PG-BSA4 Hình 8-25: Hình ảnh điện di BSA tinh khiết BSA-PPG diglycidyl ether liên kết dọc môi trường thời điểm khác BSA sử dụng protein mẫu để nghiên cứu khả thành công liên kết dọc protein collagen có nhóm epoxy đầu Kết cho thấy mẫu PG-BSA2 khống có thay EBOOKBKMT.COM đởi khối lượng so sánh với BSA PBS (B’) PG-BSA3 PG-BSA4 so sánh với C’ D’ cho thấy có thay đổi lượng nhỏ (M w ≈ 10 kD), thể tăng cường tính chất BSA sửa đổi Suy phản ứng nhóm amin nhóm cuối phân tử polymer xảy pH ≥ 12 Dưới tác dụng điều kiện kiềm, collagen loại 1, chất nghiên cứu, tạo liên kết dọc PPG diglycidyl ether sản phẩm phân tích với thí nghiệm để nhận dạng protein nhử hình: Hình 8-26: Hình ảnh điện di collagen tinh khiết collagen diglycidyl ether mơi trường thời điểm khác Có tăng khối lượng phân tử PG-COL (E 1, E2, E3, E4) (Mw ≈ 10 kD) mong đợi thể biến dần chuỗi collagen α 1, α2 β1, β2 theo thời gian kéo theo thay đổi vị trí để tạo phần dày so sánh với collagen tinh khiết (E’) Khơng có khác biệt mẫu pH12 14 8.2.5.2.2 Kính hiển vi qt electron Hình ảnh từ khính hiển vi cho thấy gel collagen tinh khiết có cấu trúc xốp Đây kết hình thành tinh thể đá porogen mà bị bay q trình sấy lạnh đơng Hình 8-27: Hình ảnh SEM collagen tinh khiết độ phóng đại khác Mặt khác, collagen-PPG diglycidyl ether với lượng 20 mg gel (PG-COLc20) hình cho thấy cấu trúc lỗ xốp nhiên bị bao phủ màng có cấu trúc khơng xốp Những mỏng trở nên lớn dày nồng độ polymer tăng EBOOKBKMT.COM Hình 8- 28: Hình ảnh SEM PG-COLc20 độ phóng đại khác 8.2.5.2.3 Phân tích nhiệt trọng (thermogravimetric) Hình thể nhiệt độ thối hóa PPG diglycidyl ether với khối lượng phân tử 350 Dalton 93 oC Sau liên kết dọc với collagen, ma trận tổng hợp tăng nhiệt độ thối hóa lên gần 123 oC Hình 8- 29: A) Đường cong TGA PPG diglycidyl ether tinh khiết; B) Đường cong TGA gel tổng hợp 8.2.5.2.4 Quét nhiệt vi sai (DSC – Differential Scanning Calorimetry) Đường cong DSC PPG diglycidyl ether (hình dưới) sử dụng để tham khảo Hình 8-30: Đồ thị DSC PPG diglycidyl ether tinh khiết; Tg = -76,7oC Đường cong nhiệt collagen tinh khiết PG-COLc5 (gel mg polymer 3,2 mg collagen) có Td (nhiệt độ biến tính) khoảng 124 oC đường cong hình A Enthalpy kèm với biến tính khoảng 2,6 Wg-1 Mặt khác, thay đổi nhẹ T d quan sát PG-COLc20 mức độ liên kết dọc Do nồng độ nồng độ polymer có ảnh hưởng EBOOKBKMT.COM tói phản ứng tọa liên kết dọc Đường cong DSC mẫu sau lần qt thứ (hình B) biến tính nhiệt biến đường cong collagen gel khơ tổng hợp, từ cấu trúc trật tự bị Hình 8-31: Đường cong nhiệt collagen tinh khiết,, PG-COLc5 PG-COLc20 A) Quét lần B) Quét lần 8.2.5.2.5 Quang phổ proton NMR A) B) C) Hình 8-32: Đường NMR A) PPG diglycidyl ether B) Collagen tinh khiết C) Gel tổng hợp Cấu trúc chuỗi không quy tắc PPG diglycidyl ether thể vùng tín hiệu – 3,2 ppm (hình A) với mũi nhọn 1,09 ppm thể proton methyl PPG Trong hình C tín hiệu từ polymer collagen đánh dấu 8.2.5.2.6 Kiểm tra TNBS Nồng độ nhóm amin tự (lysine cịn lại) mẫu xác định 2,4,6trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) Giá trị nhóm amino thấp, lượng protein tạo liên kết với polymer nhiều Lượng amin mẫu đánh giá cách so sánh với mẫu chuẩn sử dụng hợp chất amin nào, BSA (Bovine Serum Albumin) trường hợp này, hòa tan nồng độ bảng dưới: EBOOKBKMT.COM Bảng 8-8: Độ hấp thu tia UV hỗn hợp BSA nồng độ khác Hình 8- 33: Đồ thị thể liên hệ nồng độ amin với độ hấp thu tia UV Mẫu đo bước sóng 420 nm kết bảng Bảng 8-9: Số lượng nhóm amin tự dung dịch tổng hợp tỉ lệ polymer khác 8.2.5.2.7 Độ độc tế bào Kiểm tra phần chiết EBOOKBKMT.COM Bảng 8-10: Phần trăm phát triển tế bào gel tổng hợp so với mẫu chuẩn Hình 8- 34: Độ độc collagen-PPG gel lên nguyên bào sợi, đo phần trăm tế bào sống, 72 sau cấy Phân tích t-test độ tin cậy 95% cho thấy khác lượng tế bào PG-COLc15 (gel chứa 15 mg polymer 3,2 mg collagen) so với mẫu chuẩn, mẫu cịn lại không Kiểm tra tiếp xúc trực tiếp Bảng 8-11: Số lượng tế bào sống sót sau 24 chất mang khác Số lượng nguyên bào sợi bám ma trận PG-COLc20 blank glass coverslip bottom well plate khác biệt khơng đáng kể Để nghiên cứu hình thái tế bào, gel khơ cấy ngun bào sợi cho vào kính hiển vi quét electron Mẫu để nhiệt độ phòng trong dung dịch 2% glutaraldehyde dehydrate hóa qua loạt dung dịch ethanol Ta thấy cấu trúc tế bào giãn tạo thành hình đa giác thể hình thái bình thường tế bào glass coverslip mẫu lai EBOOKBKMT.COM Hình 8-35: Nguyên bào sợi (mũi tên) A) PG-COLc20 b) blank glass coverslip C) bottom well plastic ngày kính hiển vi quang học, Độ phóng đại × 10 Hình 8- 36: Hình ảnh SEM nguyên bào sợi A) glass coverslip B) PG-COLc20 độ phóng đại khác 8.2.6 Bàn luận 8.2.6.1 Polymer tổng hợp hydrogel Việc phóng thích bền vững thuốc từ gel collagen khoảng trống sợi hình thành rối sợi collagen khuếch tán hạt thuốc gần bề mặt tiếp xúc nhiều tạo nhiều lỗ trống Tuy nhiên, việc bổ sung tri-block copolymer lớp phủ sợi collagen cách hấp thụ khối kị nước (PPO theo thứ tự M w 3000 cho L103 F108) làm neo chuỗi copolymer vào nhóm kị nước acid amin phân tử collagen làm giảm lỗ sợi cho phép kiểm sốt dài hạn việc phóng thích thuốc (xem hình 8-5) Nồng độ polymer cao, chất phủ dày Tuy nhiên, đạt đến điểm mà ảnh hưởng tri-block copolymer trở nên mạnh mẽ với nồng độ ngày tăng collagen tri-block copolymer dẫn đến gia tăng làm trở ngại hình thành sợi collagen tự lắp ráp, trái với nghiên cứu mà tri-block copolymer khơng can thiệp vào hình thành sợi Điều phản ánh đồ thị C-L108 (5%, 10%, 15%) mà việc phóng thích thuốc nhanh chóng rối sợi collagen có mặt để trì EBOOKBKMT.COM thuốc C-L108 (20%) phóng thích tồn thuốc (con số khơng hiển thị đây) Các chuỗi PPO kị nước yếu tố quan trọng để cung cấp neo cần thiết cho phân tử polymer hấp thụ bề mặt lớp phủ chuỗi PEO mở rộng vào pha ngậm nước Khi tăng nồng độ polymer, chuỗi PEO trở nên ngày đông bề mặt điều cách dẫn đến hình thành sợi collagen bị ảnh hưởng chứng Số sợi có nghĩa giảm diện tích bề mặt để neo chuỗi PPO giảm hiệu lớp phủ polymer tăng nồng độ Làm để chuỗi PEO tương tác với phân tử collagen sợi chưa hiểu đầy đủ suy đoán chuỗi can thiệp vào xếp phân tử collagen gây cản trở hình thành liên kết dọc vi sợi, sau trở thành sợi Nghiên cứu chi tiết cần phải thực Chiều dài chuỗi PEO yếu tố có khuynh hướng gây trở ngại trình tạo sợi lớn với chuỗi PEO dài dẫn đến sợi collagen Điều giải thích cho trường hợp F108 (80% PEO), nơi thuốc bắt đầu phóng thích (xem hình 8-8) nồng độ tăng lên 5%, 10% so với L103 (30% PEO) với nồng độ Kết từ thử nghiệm phát triển tế bào cho thấy tế bào dường sống tốt ma trận hydrogel C-F108 nồng độ polymer sử dụng thấp Điều phần chức nhóm cuối PEG dẫn đến khả tương thích caovới máu đặc biệt cho loại tế bào máu Tuy nhiên, nồng độ polymer đạt 5% cao hơn, hydrogel tổng thể lại trở nên độc hại tương tác tế bào ma trận giảm minh họa tốc độ tăng trưởng chậm (xem hình 8-9) Mặt khác, tế bào bị ức chế nhiều ma trận hydrogel C-L103 Điều lực thấp tế bào chất kị nước mạnh tỷ lệ phần trăm EG giảm ảnh hưởng đến khả sống sót tăng trưởng tế bào 8.2.6.2 Polymer liên kết dọc xerogel Liên kết dọc sợi collagen cách sử dụng diglycidyl ether liên quan đến phản ứng nhóm epoxy với nhóm amin (hydroxy) lysine lại điều kiện kiềm với hai acid cacboxylic lại liên kết dọc thực điều kiện acid (xem hình 8-23) Trong trường hợp này, phân tử PPG diglycidyl ether có hai nhóm chức phản ứng với hai nhóm amin collagen tạo thành cầu nối hình EBOOKBKMT.COM Hình 8-37: Minh họa tạo liên kết dọc collagen với diglycidyl ether Các nhóm epoxy diglycidyl ether với phản ứng cao dễ dàng việc mở vịng, cắt hai điều kiện acid kiềm Trong mở vòng xúc tác acid, epoxide chuyển đổi acid thành proton epoxide sau bị cơng chất nhân Trong mở vịng xúc tác kiềm, epoxide, khơng phải proton epoxide, bị công chất nhân Phản ứng epoxy nhóm amin điều kiện kiềm phản ứng nhân trung tâm δ+ nhóm epoxy Một số nghiên cứu liên kết dọc collagen môi trường acid dẫn đến vật liệu có độ bền kéo cao kéo dài ổn định thể Khi cấy ghép, vật liệu dựa collagen cho thấy tỷ lệ phân hủy sinh học nhanh Do mục tiêu đề tài, nguyên liệu chậm phân hủy cần thiết Vì liên kết dọc collagen thực pH cao để có loại vật liệu có khả chống phân hủy tốt độ cứng cao cho chức ma trận tốt Cấu trúc hóa học liên hợp collagen/polymer EBOOKBKMT.COM Hình 8-38: Cơ chế phản ứng nhóm epoxy với nhóm ε -amino lysine pH≈ 12 Liên kết collagen với diglycidyl ether tạo pH cao, trường hợp giá pH = 12 tìm thấy yêu cầu tối thiểu để bắt đầu phản ứng nhân với nhóm epoxy dẫn đến thay đổi thuộc tính thể gia tăng trọng lượng phân tử thí nghiệm điện di gel (xem hình 8-12) Phản ứng điều kiện với pH 12 tiến hành chứng minh cho thấy khơng có thay đổi khơng trình bày thiếu tài liệu Bằng chứng xuất phản ứng hỗ trợ thêm thí nghiệm khác NMR TNBS, đồ thị tương ứng liệu minh họa (xem hình 8-18 bảng 8-7) Từ quang phổ NMR, nhóm chức PPG diglycidyl ether collagen quan sát liệu thu từ thí nghiệm TNBS cho thấy giảm nhóm amin gia tăng nồng độ polymer phản ứng với nhóm amin Số lượng nhóm amin khoảng 200 cho 86% polymer tổng hợp (0,86 mg mg mẫu) so với 264 cho 61% polymer 284 cho 0% Tuy nhiên, sản lượng sản phẩm thấp, có tối đa 50% lấy sau lọc thẩm tách đông khô Bên cạnh mát thẩm tách mẫu, số liên kết dọc so với dự kiến số polymer Mức độ liên kết dọc liên quan đến gia tăng EBOOKBKMT.COM nhiệt độ biến tính, phân tích cách sử dụng máy quét nhiệt vi sai tiến hành biểu đồ mô tả (xem hình 8-17) Nhiệt độ biến tính cần thiết để phá vỡ liên kết hydro cấu trúc xoắn ba collagen biến thành cấu hình cuộn ngẫu nhiên Đó báo cho liên kết dọc với xoắn ba ổn định so với duỗi cần thiết để sản xuất cuộn ngẫu nhiên Nhiệt độ biến tính PG-COLc5 mẫu collagen tinh khiết tương tự Điều xuất liên kết dọc collagen phân nhánh Nhánh có nghĩa phản ứng cố định với nhóm amin đơn, kết nhánh đến từ acid amin phản ứng Thông thường nhánh chứng minh có nhiệt độ biến tính thấp so với collagen Nhưng T d giảm khơng đáng kể, điều yếu tố nhỏ Tuy nhiên, khơng có liên kết dọc không cho thấy vắng mặt tương tác polymer collagen Có thể che chắn phản ứng nhóm amin cố định với nhóm hoạt động khác Trong thực tế, nghiên cứu Tu cho thấy che chắn phổ biến đặc biệt tiến hành pH cao Liên kết dọc collagen với hợp chất polyepoxy bifunctional tham gia phản ứng hai bước tuần tự, với phản ứng nhóm epoxy với nhóm amin, phản ứng nhóm epoxy thứ hai với nhóm amin vùng lân cận để hình thành liên kết chéo Trong trung gian hai bước này, nhóm epoxy thứ hai chưa phản ứng hợp chất polyepoxy bị ngừng hoạt động phản ứng phụ, liên kết ngang tạo thành Sự chấm dứt hoạt động trung gian có nhiều khả xảy ra, phản ứng phụ với ion hydroxyl pH cao bị ảnh hưởng giá trị pKa tương đối loại acid amin mơi trường dung dịch Vì vậy, có nhiều che chắn khác môi trường kiềm Các chứng che chắn hỗ trợ liệu thử nghiệm TNBS cho thấy sụt giảm đáng kể lượng nhóm amin PG-COLc5 cho nhiệt độ biến tính giống collagen nguyên chất đường cong DSC Một khó khăn khác góp phần đáng kể việc đạt liên kết dọc cấu trúc PPG khơng ổn định nước Ngồi ra, cấu tạo collagen có khả thay đổi đáng kể tương tác có cực / khơng cực dung dịch muối hữu sử dụng (NaCl) với phân cực định Có thể liên kết dọc hình thành cấu trúc khác với liên kết hình thành mơi trường dung dịch Thay đổi cấu trúc mang lại thêm nhóm amin vào đủ gần để liên kết dọc xảy cặp khác bị tách liên kết dọc bị ức chế Để nghiên cứu tính khả thi gel khơ có liên kết dọc PPG diglycidyl ether-collagen để làm mô cho da bỏng, nguyên bào sợi - tế bào chịu trách nhiệm sản xuất ma trận ngoại bào để làm lành vết thương tái tạo mô - lựa chọn để gieo lên ma trận Như hình 8-21 822, quan sát thấy nguyên bào sợi sống bám chặt lên ma trận collagenpolymer sau 24 khơng hiển thị hình thái tế bào dị thường Trong thực tế, tính chất bề mặt gel lai thử nghiệm cách đo góc tiếp xúc với nước Người ta chấp nhận rộng rãi tế bào thích gắn vào bề mặt ưa nước so với bề mặt kị nước Góc tiếp xúc với nước nhỏ gel hình thành mặt phẳng tiếp xúc với bề mặt nước khử ion mặt phẳng tiếp xúc với mẫu polymer / collagen làm tăng tính ưa nước vật liệu Tóm lại, mẫu chuẩn bị cách trải dung dịch gel glass coverslip để hình thành lớp màng mỏng cho phép nước từ dung dịch bay từ từ theo dịng chảy tầng lớp phủ Các hình thái lớp phủ quan sát SEM mà hình ảnh EBOOKBKMT.COM Hình 8-39: A) Bề mặt collagen-PPG diglycidyl B) Bề mặt collagen tinh khiết Hóa góc tiếp xúc gel có liên kết dọc thấp so với collagen nguyên chất (xem bảng 8-5 đây), có khả ưa nước cao, từ giải thích gắn kết mạnh tế bào Bảng 8-12: Góc tiếp xúc với nước mẫu chuẩn lớp màng kết hợp, độ lặp lại n=4 Tuy nhiên, tỷ lệ phát triển tế bào thấp số lượng tế bào chết gia tăng theo thời gian Điều quy cho epoxy cịn lại gây độc phóng thích sản phẩm gây độc tế Mức độ độc tế bào phụ thuộc vào nồng độ polymer minh họa hình 820 Khi lượng polymer bổ sung vào collagen lớn 15 mg, tăng trưởng tế bào giảm mạnh Độ xốp Ma trận collagen nguyên chất có nhiều lỗ hổng ma trận collagen-polymer tổng hợp cồng kềnh với lỗ bị bao phủ lớp lỗ hình 8-14 Tuy nhiên hình ảnh SEM hình 8-22 cho thấy ma trận sau gieo tế bào cho thấy giảm đáng kể kích thước lỗ Điều co rút collagen nguyên bào sợi, tượng công nhận rộng rãi Sự co rút ma trận collagen để đáp ứng cytokine / yếu tố tăng trưởng diện huyết DMEM - phương tiện sử dụng cho việc bảo vệ tế bào Sự co rút biết có đáp ứng với diện yếu tố tăng trưởng cytokine môi trường Một yếu tố khác giảm kích thước lỗ dung môi hữu ethanol sử dụng cho q trình dehydrate hóa chuẩn bị mẫu SEM hịa tan polymer tổ chức lại cấu trúc ma trận 8.2.7 Kết luận Từ kết cho thấy bổ sung lương PEO-PPO-PEO tri-block copolymer để tạo hydrogel điều khiển tăng giảm tốc độ phóng thích FITC-dextran so với EBOOKBKMT.COM hydrogel có chất collagen Ma trận hydrogel cịn có khả tương thích sinh học với tế bào sử dụng polymer với 80% EG với nồng độ 5% Trong trường hợp tổng hợp copolymer PPG diglycidyl ether-collagen, kết nghiên cứu cho thấy việc tạo liên kết dọc thành công với lượng liên kết tăng nồng độ polymer tăng Nguyên liệu tạo ta thể khả hút nước cao so với gel làm từ collagen chất mang cho tế bào nguyên bào sợi bám lên Đây ứng cử viên cho ứng dụng làm chất mang tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Bae, I., Osatomi, K., Yoshida, A., Osako, K., Yamguchi, A., Hara, K Biochemical properties of acid-soluble collagen extracted from the skins of underutilised fishes Food chemistry, 108, 49–54, 2008 Hwang, J H., Mizuta, S., Yokoyama, Y., & Yoshinaka, R Purification and characterization of molecular species of collagen in the skin of skate (Raja kenojei) Food Chemistry, 100, 921–925, 2007 Kittiphattanabawon, P., Benjakul, S., Viessanguan, W., Nagai, T., Tanaka, M Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus) Food chemistry, 89, 363–372, 2005 Kunardi, L Synthetic polymer-collagen composite hydrogel for drug delivery & tissue engineering National University of Singapore, 2003 Losso, J, N., Ogawa, M., Potier, R, J Extraction of collagen from calcified tissues Patent application publication No US 2005/0267292 A1, 2005 Nagai, T., Araki, Y., & Suzuki, N Collagen of skin of ocellate puffer fish (Takifugu rubripes) Food Chemistry, 78, 173–177, 2002 Nalinanon S., Benjakul S., Visessanguan W., Kishimuratuna H Pepsin: Characteristics and Its Use for Collagen Extraction from the Skin of Threadfin Bream (Nemipterus spp.) Journal of food science Vol 73, Nr 5, 2008 Nhan Hong Thi Le, Anh Thy Bui Isolation of collagen from the skin of basa fish (Pangasius Bocourti), 2008 Pati F., Adhikari B., Dhara S Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability Bioresource Technology 101, 3737–3742, 2010 Sadowska, M., Kolodziejska, I., & Niecikowska, C Isolation of collagen from the skins of Baltic cod (Gadus morhua) Food Chemistry, 81, 257–262, 2003 Senaratne, L.S., Park, P.J., Kim, S.K Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish (Lagocephalus gloveri) skin Bioresource Technology, 97, 191– 197, 2006 Shimizu, J., Shimizu, H., Nagashima, K., Yamada, K., Takamatsu, M Fish collagen and method of producing same United States patent No US 6271350 B1 Suphatharaprateep, W et al Production and properties of two collagenases from bacteria and their application for collagen extraction New Biotechnology, 2011 EBOOKBKMT.COM [14] [15] Villanueva, P, A., McNulty, A, K., Beniker, H, D., Kieswetter, K Method for quantitation of collagen tissues Patent application publication No US 2009/0142799 A1 Zhang, M., Liu, W., Li, G Isolation and characterisation of collagens from the skin of largefin longbabel catfish (Mystus macropterus) Food chemistry, 115, 826–831, 2009 ... glutaraldehyde không tạo sản phẩm phân h? ?y độc Trong nghiên cứu n? ?y, polypropylene glycol diglycidyl ether polymer sử dụng để tạo liên kết dọc với collagen nghiên cứu Polypropylene glycol (PPG)... hydrogel (ví dụ poly(vinyl acetate) th? ?y phân phần thành poly(vinyl alcohol) hay polyacrylonitrile thành polyacrylonitrile/polyacrylamide/poly(acrylic acid)) 8.2.4 Tổng hợp hydrogel 8.2.4.1 Phương... cao Các ứng dụng collagen Trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, dược phẩm, collagen thường sử dụng dạng collagen th? ?y phân Collagen th? ?y phân gọi collagen hydrolysate T? ?y theo mức